Impressão digital cromatográfica por correspondência de modelo para dados coletados por cromatografia abrangente de gás bidimensional

Resumo

Este protocolo apresenta uma abordagem para impressão digital e explorar dados multidimensionais coletados por cromatografia abrangente de gás bidimensional acoplado à espectrometria de massa. Algoritmos dedicados de reconhecimento de padrões (correspondência de modelos) são aplicados para explorar as informações químicas criptografadas na fração volátil de azeite extravirgem (ou seja, volatilome).

Resumo

O processamento e a avaliação dos dados são etapas críticas da cromatografia abrangente do gás bidimensional (GCxGC), particularmente quando acopladas à espectrometria de massa. As informações ricas criptografadas nos dados podem ser altamente valiosas, mas difíceis de acessar eficientemente. A densidade e a complexidade dos dados podem levar a longos tempos de elaboração e exigem procedimentos laboriosos e dependentes de analistas. Ferramentas eficazes e acessíveis de processamento de dados, portanto, são fundamentais para permitir a disseminação e aceitação dessa técnica multidimensional avançada em laboratórios para uso diário. O protocolo de análise de dados apresentado neste trabalho utiliza impressão digital cromatográfica e correspondência de modelos para alcançar o objetivo de desconstrução altamente automatizada de cromatatogramas bidimensionais complexos em características químicas individuais para reconhecimento avançado de padrões informativos dentro de cromatógrafos individuais e em conjuntos de cromatógrafos. O protocolo oferece alta consistência e confiabilidade com pouca intervenção. Ao mesmo tempo, a supervisão dos analistas é possível em uma variedade de configurações e funções de restrição que podem ser personalizadas para fornecer flexibilidade e capacidade de se adaptar a diferentes necessidades e objetivos. A correspondência de modelos é mostrada aqui como uma abordagem poderosa para explorar volatilome de azeite extravirgem. O alinhamento cruzado de picos é realizado não apenas para alvos conhecidos, mas também para compostos não direcionados, o que aumenta significativamente o poder de caracterização para uma ampla gama de aplicações. Exemplos são apresentados para evidenciar o desempenho para a classificação e comparação de padrões cromatográficos a partir de conjuntos amostrais analisados em condições semelhantes.

Introdução

A cromatografia abrangente do gás bidimensional combinada com a detecção espectrométrica de massa de tempo de voo (GC×GC-TOF MS) é hoje a abordagem analítica mais informativa para a caracterização química de amostras complexas^1,2,3,4,5. Em GC×GC, as colunas são conectadas serialmente e interfacedas por um modulador (por exemplo, uma interface de foco térmica ou baseada em válvula) que prende componentes de eluição da coluna primeira dimensão⁽¹D) antes de sua reinjeção na coluna segunda dimensão⁽²D). Esta operação é feita dentro de um período de tempo de modulação fixa(P_M),geralmente variando entre 0,5-8 s. Pela modulação térmica, o processo inclui crio-trapping e foco da banda de eluição com alguns benefícios para o poder de separação global.

Embora o GC×GC seja uma técnica de separação bidimensional, o processo produz valores de dados sequenciais. O conversor detector analógico-digital (A/D) obtém a saída de sinal cromatográfico em uma determinada frequência. Em seguida, os dados são armazenados em formatos proprietários específicos que não só contêm os dados digitalizados, mas também metadados relacionados (informações sobre os dados). O conversor A/D empregado em sistemas GC×GC ajuda no mapeamento da intensidade do sinal cromatográfico para um número digital (DN) em função do tempo nas duas dimensões analíticas. Detectores de canal único (por exemplo, detector de ionização de chamas (FID), detector de captura de elétrons (ECD), detector de quimiominascência de enxofre (SCD), etc.) produzem valores únicos por tempo de amostragem, enquanto detectores multicanais (por exemplo, detector espectrométrico de massa (MS)) produzem múltiplos valores (tipicamente, ao longo de uma faixa espectral) por tempo de amostragem ao longo da execução analítica.

Para visualizar dados ²D, a elaboração começa com a rasterização de um único período de modulação (ou ciclo) valores de dados como uma coluna de pixels (elementos de imagem correspondentes a eventos do detector). Ao longo da ordinação (eixo Y, de baixo para cima) o tempo de separação ^2Dé visualizado. As colunas pixel são processadas sequencialmente para que a abscissa (eixo X, da esquerda para a direita) reporte tempo de separação ¹D. Esta ordem apresenta os dados ²D em um sistema de coordenadas cartesiano destro, com o ordinal de retenção ¹D como o primeiro índice na matriz.

O processamento de dados de cromatografias ²D dá acesso a um nível mais alto de informação do que os dados brutos, permitindo detecção de ^{picos em 2D,}identificação de pico, extração de dados de resposta para análise quantitativa e análises intercompativas.

Os padrões de pico ²D podem ser tratados como a impressão digital única da amostra e compostos detectados como características de minúcias para uma análise transversal eficaz. Esta abordagem, conhecida como impressão digital baseada em modelo^6,7, foi inspirada na impressão digital biométrica⁶. Os sistemas automáticos de verificação de impressões digitais biométricas, na verdade, contam com características únicas da ponta dos dedos: bifurcações e terminações de cume, localizadas e extraídas de impressões com tinta ou imagens detalhadas. Essas características, denominadas características minúcias, são então combinadas com os modelos armazenados disponíveis^8,9.

Como mencionado acima, cada padrão de separação GC×GC é composto de picos ²D racionalmente distribuídos sobre um plano bidimensional. Cada pico corresponde a um único analito, tem seu potencial informativo, e pode ser tratado como uma única característica para análise de padrões comparativos.

Aqui, apresentamos uma abordagem eficaz para impressão digital química pela GC×GC-TOF MS com ionização tandem. O objetivo é catalogar de forma abrangente e quantitativa os recursos de um conjunto de cromatogramas.

Em comparação com o software comercial existente ou rotinas internas^10,11 que empregam uma abordagem de pico de recursos, a impressão digital baseada em modelo é caracterizada por alta especificidade, eficiência e tempo computacional limitado. Além disso, possui uma flexibilidade intrínseca que permite o alinhamento transversal das características da minúcia (ou seja, picos ²D) entre cromatógramas severamente desalinhados como os adquiridos por diferentes instrumentações ou em estudos de longo prazo^12,13,14.

As operações básicas do método proposto são descritas brevemente para orientar o leitor a uma boa compreensão da complexidade do padrão ^2De do poder da informação. Em seguida, explorando a matriz de dados de saída do instrumento, a identificação química é realizada e conhecidos analitos direcionados localizados sobre o espaço bidimensional. O modelo de picos direcionados é então construído e aplicado a uma série de cromatógrafos adquiridos dentro do mesmo lote analítico. Metadados relacionados aos tempos de retenção, assinaturas espectrais e respostas (absolutas e relativas) são extraídos de padrões relin alinhados de picos direcionados e adotados para revelar diferenças composicionais no conjunto amostral.

Como uma etapa adicional e única do processo, uma impressão digital combinada não direcionada e direcionada (UT) também é realizada em cromatógrafos pré-direcionados para estender o potencial de impressão digital a analitos conhecidos e desconhecidos. O processo produz um modelo UT para uma análise comparativa verdadeiramente abrangente que pode ser amplamente automatizada.

Como etapa final, o método realiza o cross-alignment de características em dois sinais de detector paralelo produzidos com energias de ionização eletrônica alta e baixa (70 e 12 eV).

O protocolo é bastante flexível em análises de suporte de um único cromatograma ou um conjunto de cromatgramas e com cromatografia variável e/ou detectores múltiplos. Aqui, o protocolo é demonstrado com um conjunto de software GC×GC (ver Tabela de materiais)combinado a uma biblioteca e software de pesquisa de MS (ver Tabela de Materiais). Algumas das ferramentas necessárias estão disponíveis em outros softwares e ferramentas similares poderiam ser implementadas independentemente a partir de descrições na literatura por Reichenbach e colegas de trabalho^{15,16,17,18,19}. Os dados brutos para a demonstração são derivados de um estudo sobre óleo extravirgem de oliva (EVO) realizado no laboratório dos autores¹⁴. Em particular, a fração volátil (ou seja, volatilome) dos óleos evo italianos é amostrada por microextração de fase sólida do headspace (HS-SPME) e analisada por GC×GC-TOF MS para capturar impressões digitais diagnósticas para qualidade e qualificação sensorial das amostras. Detalhes sobre amostras, condições de amostragem e configuração analítica são fornecidos na Tabela de Materiais.

As etapas 1-6 descrevem o pré-processamento dos cromatógrafos. As etapas 7-9 descrevem o processamento e a análise de cromatogramas individuais. As etapas 10-12 descrevem a criação e correspondência do modelo, que são a base para a análise entre amostras. As etapas 13-16 descrevem a aplicação do protocolo em um conjunto de cromatógrafos, com etapas 14-16 para análise ut.

Protocolo

1. Importação de dados brutos

NOTA: Isso cria uma matriz de raster bidimensional para visualização e processamento.

1. Inicie o software de imagem.
2. Selecione | de arquivos Importação; navegar e escolher o arquivo de dados bruto adquirido pelo sistema GC×GC-TOF MS denominado "VIOLINO 101.lsc"(Arquivo Complementar 1); em seguida, clique em Abrir. O cromatógrafo abre neste software.
   NOTA: O formato do arquivo de dados bruto depende do fabricante do instrumento. O software importa uma variedade de formatos de arquivo listados no guia do usuário.
3. No diálogo Importação, defina o Período de Modulação (P_M) para 3,5 s; em seguida, clique em OK.
   NOTA: Alguns softwares de aquisição podem não registrar o período de modulação.
4. Selecione | de arquivos Salvar imagem como; navegar para a pasta desejada; digitar o nome "Oil 1 RAW.gci"(Arquivo Complementar 2); em seguida, clique em Salvar.

2. Mudar a fase de modulação

NOTA: Isso coloca todos os picos em cada ciclo de modulação na mesma coluna de imagem, incluindo os picos que envolvem o final do período de modulação no tempo nulo do próximo período de modulação²⁰.

1. Selecione | de processamento Fase de turno.
2. No diálogo Fase de turno, defina o Valor do Deslocamento para -0,8 s; em seguida, clique em OK.

3. Correção da linha de^{base 21}

1. Selecione | gráfico Desenhar Retângulo.
2. Clique e arraste para desenhar um retângulo na imagem onde não são detectados picos.
3. Selecionar ferramentas | Visualizar dados; note o desvio médio e padrão do sinal do detector, aqui, 21.850 ± número digital sem unidade SD (DN); em seguida, feche a ferramenta.
4. Selecione | de processamento Linha de base correta.

4. Colorir a imagem cromatográfica usando um mapa de valor e mapa de cores²⁰

1. Selecione Exibir | Colorize.
2. Na caixa de diálogo Colorize, selecione a guia Importação/Exportação; selecionar o mapa de cores personalizado #AAAA (Arquivo Suplementar 3)fornecido como material complementar; em seguida, clique em Importar.
3. Nos controles de Mapeamento de Valor, defina a faixa de valor para os valores mínimos e máximos; em seguida, clique em OK.

5. ²D picos (ou seja, blobs) detecção para analitos¹⁸

1. Selecione | de processamento Detectar blobs com as configurações padrão; em seguida, observe que alguns picos são divididos e há detecções espúrias.
2. Selecione Configurar | Configurações | Detecção de bolhas; em seguida, defina suavizar para 0,1 para a primeira dimensão e 2.0 para a segunda dimensão e definir volume mínimo (ou seja, limiar para os valores somados) para 1,00 E6; em seguida, clique em OK.
3. Selecione | de processamento Detectar blobs com as novas configurações; então, observe as melhorias.

6. ²D picos de filtragem

NOTA: Isso é feito para remover automaticamente detecções sem sentido devido a sangramentos de coluna ao longo do ¹D e golpes ou rejeitos ao longo do ²D.

1. Selecione | de processamento Detecção interativa de bolhas.
2. Observe as configurações de detecção de bolhas; em seguida, clique em Detectar.
3. No construtor do filtro avançado, clique em Adicionar; em seguida, na caixa de diálogo Nova Restrição, selecione Retenção II; em seguida, clique em OK.
4. Nos controles deslizantes de restrição, defina os tempos mínimos e máximos de retenção ^{de 2}D para o filtro reduzir o número de picos falsos sem perder picos verdadeiros.
5. Clique em Aplicar; em seguida, clique em Sim para salvar as configurações de detecção com o novo filtro.
   NOTA: Ferramentas mais avançadas podem ser necessárias para lidar com problemas de detecção específicos, como detecção de pico de íon ou desconvolução para co-eluções¹⁹.

7. Calibração dos índices de retenção linear

NOTA: Execute esta etapa²² (I^T) para os tempos específicos de retenção em todo o conjunto de padrões de índice de retenção (RI) (tipicamente n-alkanes).

1. Selecione Configurar | | de Mesa RI Índice de Retenção (Col I).
2. Na caixa de diálogo Configuração da tabela RI, clique em Importar; em seguida, selecione o arquivo de calibração RI (em formato CSV com nome, tempo de retenção e índice de retenção) chamado "tabela LRI.csv" – (Arquivo Suplementar 4).
3. Selecione | de arquivos Salvar imagem A. Navegar até a pasta desejada; digitar o nome "Oil 1 LRI CALIBRATED.gci"(Arquivo Complementar 5); em seguida, clique em Salvar.

8. Procurando o espectro de pico na biblioteca NIST17 MS²³

1. Selecione Configurar | Configurações | Biblioteca de Pesquisa.
2. Na caixa de diálogo da Biblioteca de Pesquisa, defina tipo de espectro para o pico ms, limiar de intensidade para 100, tipo de pesquisa NIST para simples (similaridade), tipo de coluna NIST RI para polar padrão e tolerância de RI NIST a 10; em seguida, clique em OK. O NIST MS Search oferece muitas outras configurações definidas para os padrões aqui.
3. Selecione | de processamento Biblioteca de pesquisa para Todos os Blobs.

9. Revisar e corrigir identificações de analitos

1. Na paleta de ferramentas, defina o modo cursor para Blob | Selecione Blobs.
2. Na exibição Imagem, clique com o botão direito do mouse no pico desejado.
3. Na caixa de diálogo Blob Properties, inspecione propriedades de bolhas; em seguida, clique em Lista de Cliques.
4. Inspecione a lista de acertos; em seguida, se a identificação estiver incorreta, selecione a marca de verificação ao lado da identificação correta.
5. Na caixa de diálogo Blob Properties, digite o Nome do Grupo para designar classe química e quaisquer outros metadados desejados; em seguida, clique em OK.
6. Selecione | de arquivos Salvar imagem como; navegar para a pasta desejada; digitar o nome "Óleo 1 COLORIDO para Modelo de construção.gci"(Arquivo Complementar 6); em seguida, clique em Salvar.
   NOTA: Este arquivo está incluído no arquivo suplementar, que pode ser aberto para a etapa 10.

10. Crie um modelo com picos direcionados¹⁵

1. Na exibição de imagem (ainda no modo Select Blobs a partir da etapa 9.1), selecione os picos desejados com um clique no primeiro pico e CTRL + clique nos picos adicionais.
2. Na paleta de ferramentas, clique no botão Adicionar ao Modelo.
3. Quando o modelo estiver concluído, selecione Arquivo | Salvar modelo; especificar a pasta e o nome do arquivo; em seguida, clique em Salvar.
4. Selecione | de arquivos Imagem fechada.
   NOTA: Neste ponto, essas instruções continuam com o modelo criado para incluir os picos de destino desejados, disponíveis como "tamplate.bt direcionados"(Arquivo Complementar 7).

11. Combine e aplique o modelo

NOTA: A correspondência reconhece o padrão de modelo nos picos detectados um novo cromatograma. Aplicando as identificações dos conjuntos correspondentes e outros metadados no novo cromatograma do modelo.

1. Selecione | de arquivos Imagem Aberta; navegar e selecionar o arquivo de cromatograma "Oil 2 COLORIZED.gci"(Arquivo Suplementar 8) (que é pré-processado); em seguida, clique em Abrir.
2. Na paleta de ferramentas, defina o modo cursor para Modelar | Selecione Objetos.
3. Selecione | de modelos Modelo de carga.
4. Na caixa de diálogo Modelo de carga, clique em Procurar; navegar e selecionar o modelo de picos direcionados "Targeted template.bt"(Arquivo Suplementar 7); em seguida, clique em Abrir.
5. Na caixa de diálogo Modelo de carga, clique em Carregare, em seguida, Descarte.
6. Na exibição imagem, clique com o botão direito do mouse em um pico de modelo; em seguida, inspecione suas propriedades de objeto, incluindo o qCLIC e referência MS.
7. Selecione | de modelos Modelo interativo de correspondência e transformação.
8. Na interface Interactive Match, clique em Match All; em seguida, revise os resultados correspondentes tanto na tabela quanto na imagem, em que cada pico de modelo é marcado com círculos não preenchidos e, se uma correspondência for feita, há um link para um círculo preenchido para o pico detectado.
9. Editar as correspondências conforme desejado; quando estiver satisfeito, clique em Aplicar para transferir metadados do modelo para o cromatograma.
   NOTA: As restrições de correspondência, como a qCLIC, ajudam a corresponder ao padrão correto entre os picos detectados do novo cromatograma. Os parâmetros de restrição incluem o tipo de assinatura ms usada como referência de modelo(pico MS ou blob MS) e os valores limiares para similaridade espectral (Direct Match Factor (DMF) e Reverse Match Factor (RMF)). Aqui, os parâmetros são definidos com base em estudos anteriores^13,14 para limitar as correspondências falsas negativas: pico ms e dmf e limite de similaridade RMF 700.

12. Transforme o modelo para cromatografia substancialmente diferente

NOTA: Esta etapa não é necessária a menos que as condições cromatográficas variem substancialmente fazendo com que o modelo seja desalinhado com um novo cromatógrafo, como pode ser o caso em estudos de longo prazo ou depois que uma nova coluna é instalada. Nesses casos, o modelo pode ser geometricamente transformado no plano de retenção cromatográfica para melhor se encaixar no novo cromatógrafo^12,13. Neste exemplo, os padrões de pico do modelo e do cromatograma são semelhantes, mas diferem na geometria dos tempos de retenção, como seria visto para diferentes condições cromatográficas.

1. Repetir as etapas 11.2-11.5, exceto navegar para, selecionar e carregar 2.bt de modelo direcionado (Arquivo Suplementar 9).
2. Selecione | de modelos Modelo de correspondência interativo; em seguida, clique em Editar transformar.
3. Na interface Transformar Modelo, varie as escalas ¹D e ²D, traduções e tesouras para alinhar melhor o modelo com os picos detectados; em seguida, clique em Transformar modelo.
4. Com o modelo transformado, clique em Editar correspondência; em seguida, repita as etapas 11.8-11.9.

13. Realize análises combinadas não direcionadas e direcionadas em um conjunto de cromatogramas

NOTA: Um modelo combinado não direcionado e direcionado (UT), também referido como modelo de recurso ^24,25, quando combinado com cada um de um conjunto de cromatógrafos, estabelece correspondências entre analitos não direcionados e direcionados, em seguida, características consistentes de amostra cruzada são extraídas para padrão de reconhecimento.

1. Realize a pré-processamento (etapas 1-6) e correspondência de modelo UT (etapas 11.1-11.9) para todos os cromatógramas do conjunto (ou seja, cromatogramas ²D de óleos). Alternativamente, automatize esta etapa com software de projeto ou software semelhante, não descrito aqui.
2. Inicie o software Investigator.
3. Selecione | de arquivos Análise aberta; em seguida, selecione e abra "Feature Jove su 70 eV.gca"(Arquivo Suplementar 10).
4. Clique em OK para abrir e examinar os resultados.
5. Clique na guia Compostos para revisar valores métricos e estatísticas para analitos específicos (ou seja, analitos direcionados com nomes químicos associados) ou analitos não direcionados com identificadores (#) alinhados em todos os cromatogramas e, em seguida, execute as etapas abaixo.
   1. Clique na guia Atributos para revisar valores e estatísticas para métricas específicas em cromatogramas.
   2. Clique na guia Resumo para revisar as estatísticas de resumo de compostos e recursos. Se os cromatógrafos são de classes diferentes, como neste caso os óleos produzidos a partir de azeitonas colhidas em duas regiões diferentes da Itália, então a guia Resumo lista as estatísticas da razão de Fisher (F e FDR), que fornecem insights sobre características para discriminar entre classes.
   3. Visualize vários gráficos em todas as guias e, se desejar, execute a Análise de Componentes Principais (PCA) na guia Atributos.

14. Modifique o modelo UT para análise paralela de MS

NOTA: A análise foi realizada com 70 eV e 12 eV (ou seja, altas e baixas) energias de ionização eletrônica^26,27.

1. Abra um dos cromatógrafos de 12 eV, por exemplo, "Oil 1 12 eV RAW.gci"(Arquivo Suplementar 11),realize o pré-processamento (etapas 1-6) e carregue o modelo UT "modelo UT 70 relaxed.bt"(Arquivo Suplementar 12), conforme descrito nas etapas 11.1-11.6. Os arquivos são fornecidos como material complementar.
2. Se necessário, ajuste o modelo para se encaixar nos picos detectados de 12 eV conforme descrito na etapa 12. Aqui, não há desalinhamento significativo porque os sinais tandem são multiplexados. No entanto, deve-se notar que, como as diferentes configurações de ionização produzem diferentes fragmentações, é necessário relaxar as restrições para as restrições qCLIC sobre a similaridade espectral DMF e RMF (não demonstradas aqui).
3. Selecione | de arquivos Salvar modelo; especificar a pasta e o nome do arquivo, por exemplo, "modelo UT 12.bt"(Arquivo Complementar 13); em seguida, clique em Salvar.

15. Realize análises combinadas não direcionadas e direcionadas em 12 cromatogramas eV

1. Selecione | de arquivos Análise aberta; em seguida, selecione e abra "Feature Jove su 12 eV.gca" - Arquivo suplementar 14 fornecido.
2. Clique em OK para abrir e examinar os resultados.
3. Clique na guia Compostos para revisar os valores métricos, consulte 12 respostas eV e estatísticas para analitos específicos (ou seja, analitos direcionados com nomes químicos associados) ou analitos não direcionados com identificadores (#) alinhados em todos os cromatógramas e, em seguida, execute as etapas abaixo.
   1. Clique na guia Atributos para revisar valores e estatísticas para métricas específicas em cromatogramas.
   2. Clique na guia Resumo para revisar as estatísticas de resumo de ambos os compostos e recursos em 12 eV. Se os cromatógrafos são de classes diferentes, como neste caso os óleos produzidos a partir de azeitonas colhidas em duas regiões diferentes da Itália, então a guia Resumo lista as estatísticas da razão de Fisher (F e FDR), que fornecem insights sobre características para discriminar entre classes.
   3. Visualize os vários gráficos disponíveis em todas as guias e, se desejar, execute a Análise de Componentes Principais (PCA) na guia Atributos.

Resultados

Os padrões GC×GC-TOF MS de volatilome extravirgem de alta qualidade exibem cerca de 500 picos ^{de 2}D acima de um limiar de relação sinal-ruído (SNR) de 100. Tal limiar foi definido por investigações anteriores sobre os voláteis alimentares^14,27 como o sinal relativo mínimo sobre o limiar para obter espectros confiáveis para análises interativas. Os componentes são distribuídos sobre o espaço cromatográfico de acordo com sua retenção relativa nas duas dimensões cromatográficas, e especificamente com base em sua volatilidade/polaridade no ¹D e volatilidade no ²D. Aqui, a combinação de coluna é polar × semi-polar (ou seja, Carbowax 20M × OV1701).

O padrão ^2Dmostra um alto grau de ordem. Padrões de retenção relativa para séries e classes homólogos são mostrados na Figura 1A com anotações (gráficos para grupos e bolhas para picos) para hidrocarbonetos saturados lineares (preto), hidrocarbonetos insaturados (amarelo), aldeídos lineares saturados (azul), aldeídos mono-insaturados (vermelho), aldeídos poli-insaturados (salmão), álcoois primários (verde) e ácidos graxos de cadeia curta (cyano).

Os picos ²D detectados podem então ser identificados comparando o espectro médio de MS extraído de todo o pico ²D (espectroblob) ou do maior espectro (espectroápice). A Figura 2 ilustra a saída do espectro ápice de busca por blob 5 e retorna uma partida de alta semelhança (primeiros 10 hits) para (E)-2-hexenal. Os bancos de dados explorados são aqueles pré-selecionados pelo analista na etapa 8 do método.

A identificação é validada pela indexação de retenção ativa. O valor experimental I^T foi calculado para os picos ²D, de modo que nesta fase a pesquisa da biblioteca prioriza resultados com valores coerentes de T tabulado^. As janelas de tolerância podem ser personalizadas com base na experiência dos analistas, confiabilidade dos valores do banco de dados de referência de acordo com a fase estacionária e as condições analíticas aplicadas. Novas ferramentas para calibração inteligente de índices de retenção linear sem calibração experimental com n-alkanes, foram recentemente desenvolvidas e discutidas em um estudo de Reichenbach et al¹⁹.

A coleção de picos identificados ^{em 2}D (ou seja, picos direcionados) pode ser adotada para construir um modelo de picos direcionados para estabelecer prontamente correspondências confiáveis entre o mesmo composto em todos os cromatogramas amostrais. A coleção de picos de modelos direcionados é visualizada na Figura 1B. Os círculos vermelhos correspondem aos 196 compostos-alvo, incluindo dois Padrões Internos (IS) ligados a picos de modelo com linhas de conexão. Os IS são usados para normalização de resposta e as linhas de conexão ajudam a visualizar qual dos IS incluídos será adotado para normalizar cada resposta de pico/bolha ²D.

Na Figura 1B,círculos preenchidos indicam correspondências positivas entre o pico do modelo e o padrão real, enquanto os círculos vazios são para picos de modelo para os quais a correspondência não foi verificada. As correspondências negativas falsas podem ser limitadas pela seleção adequada de parâmetros de limiar, espectro de referência e funções de restrição^13,14,18,19. Para padrões complexos com múltiplas co-eluções, as funções de detecção de pico de íons baseadas na desconvolução espectral são aconselháveis e podem ser uma opção válida¹⁹. Os metadados de pico do modelo são mostrados no painel ampliado da Figura 1B para (E)-2-hexenal.

A especificidade da correspondência de modelos baseia-se na possibilidade de aplicar funções de restrição que limitam a correspondência positiva aos picos do candidato que, caindo dentro da janela de pesquisa do algoritmo, têm similaridade espectral de MS acima de um determinado limiar. Neste caso, na etapa 11, os limites de similaridade²³ foram fixados em 700 de acordo com experimentos anteriores destinados a definir parâmetros ideais que limitam falsas partidas negativas¹⁴. As áreas destacadas das propriedades de pico do modelo na Figura 1B mostram as informações sobre a sequência de espectro MS de referência e a função de restrição qCLIC (ou seja, (Match("

Aplicando o modelo a todos os cromatogramas de um conjunto, pode-se encontrar situações desafiadoras como no caso de desalinhamento parcial de padrões. Isso pode ser devido a inconsistências de temperatura do forno, instabilidades de fluxo/pressão do gás transportador, ou por causa de uma intervenção manual no sistema, como no caso de substituição da coluna ou substituição moduladora de loop-capilar^14,28. A Figura 3 mostra uma situação de desalinhamento parcial entre o modelo alvo e o cromatograma real. Para desalinhamentos mínimos, as transformações de modelo interativas(Figura 3,painel de controle) podem reposicionar picos de modelo para um melhor ajuste. Uma vez reposicionado, o modelo pode ser combinado para estabelecer correspondências. No exemplo, o modelo(Figura 3,passo 12) bate corretamente com o padrão ²D real. Em caso de desalinhamentos graves, não discutidos aqui, a repetição de ações de atualização de match-transform pode adaptar iterativamente a posição do modelo ao padrão de pico real^12,13,14.

Aqui, os picos direcionados (ou seja, analitos conhecidos) fornecem cerca de 40% do resultado cromatográfico (196 picos direcionados de cerca de 500 picos detectáveis em média). Os outros 60% dos compostos, juntamente com as informações que trazem, não são levados em consideração na análise-alvo. Para tornar a investigação verdadeiramente abrangente, também deve ser estabelecido um alinhamento cruzado consistente de picos ²D não-alvos. A primeira aplicação onde a correspondência de modelos foi estendida a todos os analitos detectáveis tratou do volatilome complexo do café torrado⁷. Esse processo é automatizado com um software (por exemplo, Investigador), mostrado aqui nas etapas 14-15.

Nesse processo, imagens pré-direcionadas pertencentes à amostra definida em estudo (20 amostras) são usadas para definir picos confiáveis, cruzando todos os padrões de imagem²⁹. Posteriormente, é construído um cromatógrafo composto a partir do qual se pode identificar picos e regiões de pico confiáveis ut (ou seja, pegada de picos ²D) no chamado modelo de recurso¹⁷.

Para análises adquiridas a 70 eV, o processo determinou 144 picos confiáveis com confiabilidade relaxada²⁹, dos quais 76 pertencem à lista de picos alvo. Com base nesses 144 picos confiáveis, o processo alinha todos os cromatógrafos consistentemente com os tempos médios de retenção dos picos confiáveis e, em seguida, combina-os para criar um cromatógrafo composto. A Figura 4 mostra uma lista de todas as amostras rotuladas de acordo com a região de produção do óleo (esquerda) e a lista de picos confiáveis/volumes de bolhas em cada amostra (à direita).

O modelo de recurso não direcionado é composto por picos ²D de analitos detectados no cromatógrama composto, mostrado na Figura 5A, que são combinados pelo modelo de picos confiáveis (n = 168 – círculos vermelhos para picos direcionados e círculos verdes para picos não direcionados). Os espectros de massa dos picos compostos, bem como seus tempos de retenção, são registrados no modelo de recurso, como mostrado para (Z)-3-hexenol acetato na área ampliada. As regiões de pico são mostradas na Figura 5B como gráficos de cor vermelha; em vez disso são definidos pelos contornos de todos os picos ²D detectados no cromatograma composto (n = 3578).

Quando o reconhecimento de padrão não supervisionado pela Análise de Componentes Principais é aplicado à distribuição de picos direcionados dentro das 20 amostras analisadas, os óleos sicilianos e toscanos agrupam-se separadamente sugerindo que as condições pedo-climáticas e o terroir impactam a prevalência relativa de voláteis. Os resultados são mostrados na Figura 6A e os resultados do PCA da distribuição de picos confiáveis são mostrados na Figura 6B. As duas abordagens validam que óleos de diferentes áreas geográficas têm assinaturas químicas diferentes, enquanto coerentes, sejam compostos direcionados ou não, ou ambos, são mapeados.

Finalmente, o software permite o reequemento imediato e eficaz de padrões em canais de detecção paralelos. Nesta aplicação, o re-alinhamento é proposto para sinais de ionização tandem. A fonte de íons dos multiplexes de MS entre duas energias de ionização (ou seja, 70 e 12 eV) em uma frequência de aquisição de 50 Hz por canal³⁰. Os dois padrões cromatógrafos resultantes estão intimamente alinhados, enquanto os dados espectrais (ou seja, assinaturas e respostas espectrais) trazem informações complementares com diferentes faixas dinâmicas de resposta^26,27. Os padrões alinhados permitem recursos de extração (picos²D e regiões-pico) com IDs univocal (ou seja, nomes químicos para picos direcionados e numeração única # para picos não direcionados e regiões-pico).

A correspondência de modelos permite um alinhamento cruzado eficaz. Nesta situação, não há muito desalinhamento, mas as restrições de MS devem ser relaxadas para permitir partidas para picos UT. Por outro lado, as regiões de pico da UT, que não têm restrições de MS, são prontamente combinadas sem correspondências falsas negativas. A Figura 5C mostra uma área ampliada de um cromatograma de 12 eV onde o modelo de recurso construído a partir de 70 dados eV é combinado. Os picos de UT confiáveis são positivamente combinados devido às restrições qCLIC reduzidas (por exemplo, limiar de DMF em 600). Note-se que, a 12 eV, há menos picos detectados devido à fragmentação limitada induzida pela baixa energia de ionização.

Figura 1: Gráfico de contorno bidimensional e modelo direcionado. (A) Gráfico de contorno da fração volátil de um azeite extravirgem da Toscana. Padrões ordenados de séries e classes homólogas são destacados com diferentes cores e linhas: hidrocarbonetos saturados lineares (linha preta e contornos ^2D)hidrocarbonetos insaturados (amarelo), aldeídos saturados lineares (azul) aldeídos mono-insaturados (vermelho), aldeídos poli-insaturados (salmão), álcoois primários (verde) e ácidos graxos de cadeia curta (ciano). (B) Modelo direcionado sobreposto de analitos conhecidos (círculos de cor vermelha) com linhas de conexão que ligam Normas Internas (ISs). Os painéis mostram as propriedades de pico/bolha de ²D (Decanal) ou propriedades de pico de modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Pesquisa apex MS. Saída do ápice MS busca por blob 5. Lista das entradas do banco de dados com a maior correspondência de semelhança e metadados relacionados disponíveis na biblioteca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Realinhamento de modelos. Fluxo de trabalho ilustrando as etapas que permitem o realinhamento do modelo por transformação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Interface GC Investigador. Painel de pesquisadores com todas as imagens selecionadas rotuladas de acordo com a região de produção do óleo (esquerda) e a lista de picos confiáveis/volumes de bolhas em cada amostra (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Modelo direcionado e UT. (A) Picos confiáveis resultantes do processamento automatizado na etapa 11; círculos vermelhos correspondem a analitos conhecidos, enquanto círculos verdes são desconhecidos. No painel sobreposto, as propriedades do objeto de modelo são mostradas para o (Z)-3-hexenal. (B) Área ampliada que mostra os picos UT (círculos vermelhos e verdes) e regiões-de-pico (gráficos vermelhos) do modelo UT combinada com um óleo amostral adquirido a 70 eV energia de ionização. (C) Modelo UT combinado com um óleo amostral adquirido a 12 eV energia de ionização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Parcelas de carregamento pca. Eles mostram a conformação natural das amostras (óleos da Toscana e da Sicília) como resultam em (A) distribuição de picos direcionados ou (B) distribuição de picos UT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussão

A visualização dos dados gc×GC-TOF MS é um passo fundamental para uma compreensão adequada dos resultados alcançados por separações bidimensionais abrangentes. Gráficos de imagem com coloração personalizada permitem aos analistas apreciar diferenças de resposta ao detector e, assim, a distribuição diferencial dos componentes amostrais. Essa abordagem visual muda completamente a perspectiva dos analistas sobre a interpretação e elaboração de cromatogramas. Este primeiro passo, uma vez compreendido e usado com confiança pelos cromatógrafos, abre uma nova perspectiva no processamento posterior.

Outro aspecto fundamental do processamento de dados é a acessibilidade à matriz completa de dados (ou seja, dados e respostas espectrais de MS) para todos os pontos amostrais, cada um dos quais corresponde a um único evento detector. Neste ^{sentido, 2}D picos de integração, de modo que a coleta de eventos detectores correspondentes a um único analito representam um passo crítico. No protocolo atual, a detecção de picos ²D é baseada no algoritmo da bacia hidrográfica¹⁸ com algumas adaptações incluídas para melhorar a sensibilidade de detecção em caso de compostos de co-eluição parcial. Para tornar esse processo mais específico, deve-se fazer a desconvolução e procedimentos mais sofisticados adotados. Isso é possível realizando uma detecção de pico de íons para dados de MS; o algoritmo processa o conjunto de dados e isola a resposta de analitos únicos com base nos perfis espectrais^19,31.

Um passo importante, porém crítico, do protocolo, e de qualquer processo de interpretação de dados GC×GC-MS, diz respeito à identificação de analitos. Este procedimento, proposto nas etapas 8 e 9, na ausência de uma análise confirmatória com padrões autênticos, deve ser cuidadosamente conduzido pelo analista. Ações automatizadas estão disponíveis em qualquer software comercial; incluem avaliação de similaridade de assinatura espectral de MS em relação ao espectro de referência coletado (ou seja, bibliotecas espectrais) e avaliação de razões características entre íons qualificados/quantificadores. No entanto, são necessários critérios confirmatórios adicionais para desambiguar a identificação de isômeros. O protocolo propõe a adoção de índices de retenção linear para priorizar a lista de candidatos; o limite aqui diz respeito à disponibilidade de dados de retenção e sua consistência.

A principal característica que torna essa abordagem única é o modelo correspondente^12,13,15,29. A correspondência de modelos permite o reconhecimento de padrão ^2Dde forma muito eficaz, específica e intuitiva. Pode ser definido, em termos de sensibilidade e especificidade, aplicando valores de limiar personalizados e/ou funções de restrição, enquanto o analista pode supervisionar o procedimento interagindo ativamente com parâmetros de função de transformação. A peculiaridade desse processo baseia-se na possibilidade de cruzar informações de picos direcionados e não direcionados entre amostras de um lote uniforme, mas também entre amostras adquiridas com as mesmas condições nominais, apesar do desalinhamento médio-grave. As vantagens desta operação dizem respeito à possibilidade de preservar todas as identificações de analitos direcionados, que é uma tarefa demorada para o analista, e todos os metadados salvos para picos direcionados e não segmentados de sessões de elaboração anteriores.

A correspondência de modelos também é muito eficaz em termos de tempo computacional; Os arquivos de dados MS de baixa resolução consistem em cerca de 1-2 Gb de dados embalados, enquanto as análises de MS de alta resolução podem chegar a 10-15 Gb por execução analítica única. A correspondência de modelos não processa a matriz de dados completa todas as vezes, mas, a princípio, realiza o alinhamento do tempo de retenção entre os cromatógrafos usando picos de modelo, então, processa picos de candidatos dentro da janela de pesquisa para sua correspondência de semelhança com referência no modelo. Em caso de grave desalinhamento, a situação mais desafiadora, as transformações polinomiais globais de segunda ordem tiveram um desempenho melhor do que os métodos locais, reduzindo o tempo computacional¹³.

Para que a técnica GC×GC se espalhe amplamente além da academia e dos laboratórios de pesquisa, as ferramentas de processamento de dados devem facilitar operações básicas para visualização e inspeção de cromatógrafos; a identificação de analitos deve oferecer a possibilidade de adotar algoritmos e procedimentos padronizados (por exemplo, algoritmo de pesquisa NIST e calibração I^T); e a análise interativo deve ser intuitiva, eficaz e suportada por ferramentas interativas. A abordagem proposta aborda essas necessidades ao mesmo tempo em que oferece opções e ferramentas avançadas para lidar com situações complexas, como co-elução de analitos, calibração de vários analitos, análise do tipo de grupo e alinhamento paralelo de detecção.

O poço de literatura referenciada abrange muitos cenários possíveis onde o GC×GC e, mais geralmente, a cromatografia bidimensional abrangente, oferecem soluções únicas e resultados confiáveis que não podem ser alcançados pela cromatografia ¹D na análise de execução única. ^5,32,33 Embora o GC×GC seja a ferramenta mais poderosa que aumenta a capacidade de separação e sensibilidade, há sempre limitações ao poder de separação, sensibilidade e outras capacidades sistêmicas. À medida que esses limites sistêmicos são abordados, a análise dos dados torna-se progressivamente mais difícil. Portanto, a pesquisa e o desenvolvimento devem continuar a melhorar as ferramentas analíticas à nossa disposição.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1D Coluna SolGel-Wax (100% polietilenoglicol; 30 m &vezes; 0,25 mm dc &vezes; 0,25 μ m df). Hélio de gás portador a um fluxo nominal constante de 1,3 mL / min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Austrália	PN 054796	Hélio gasoso transportador a um fluxo nominal constante de 1,3 mL/min. Programação de temperatura do forno definida da seguinte forma: 40° C (2 min) a 240 graus; C (10 min) a 3,5 graus; C/min.
2D Coluna OV1701 (86% polidimetilsiloxano, 7% fenil, 7% cianopropil; 1 m &vezes; 0,1 mm dc &vezes; 0,10 μ m df) de .	Mega, Legnano, Milão, Itália	PN MEGA-1701
Sistema automatizado para preparação de amostras: SPR Autosampler para GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, Reino Unido
Azeites de oliva extra virgem: Sicília e Toscana, Itália	Projeto VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		As amostras (n=10) foram coletadas durante o ano de produção de 2018 dentro da campanha de amostragem do projeto "Violino". Os óleos foram submetidos ao HS-SPME para amostragem de voláteis de acordo com um protocolo de referência validado em um estudo anterior de Stilo et al.14
Cromatógrafo gasoso: Modelo 7890B GC	Agilent Technologies Wilmington DE, EUA
GC Image GC× GC edição V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Software de processamento de imagem	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Espectrômetro de massa: BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, Reino Unido
Metil-2-octilnoato (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	PN: 68982
Controlador modulador: Optimode v2.0	SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milão, Itália
Modulador: Tipo de loop KT 2004	Zoex Corporation Houston, TX, EUA
Biblioteca MS e software de pesquisa: NIST Library V 2017, Software V 2.3	Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alcanos C8-C40 para indexação de retenção	Merck-Millipore/Supelco	PN: 40147-U
n-hexano (CAS 110-54-3) cromatografia gasosa MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN: 100795
Fibra de microextração em fase sólida	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
α- /β-tujona (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	PN: 04314