Um ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo usando células brutas de exsudato peritoneal e estimulação natural de antígenos

Resumo

Estabelecemos um ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo realizado pela incubação de células brutas de exsudato peritoneal isoladas dos camundongos, tratadas com um agente farmacológico de interesse e administradas antecipadamente IgE anti-dinitrofenol (DNP), com DNP em uma proteína carreadora.

Resumo

Os estabilizadores de mastócitos são uma parte essencial da medicação para alergia. A anafilaxia sistêmica passiva (PSA) é um ensaio animal amplamente utilizado para investigar o efeito de um agente farmacológico de interesse sobre mastócitos in vivo. Como os sintomas anafiláticos são atribuídos principalmente à exocitose dos grânulos dos mastócitos, concebe-se que o agente causador da melhora dos sintomas tenha uma atividade estabilizadora dos mastócitos. Apesar disso, é prudente confirmar a atividade demonstrando diretamente o declínio da atividade funcional dos mastócitos após o tratamento. Ensaios de degranulação in vitro usando uma linhagem de mastócitos imortalizados ou mastócitos primários cultivados são rotineiramente empregados para esse fim. Os resultados dos ensaios in vitro e in vivo podem nem sempre ser semelhantes entre si; no entanto, como as condições de tratamento (por exemplo, dose de tratamento, tempo, ambientes circundantes) para os ensaios in vitro são frequentemente distintas daquelas para o ensaio in vivo, como o PSA. Em busca de um ensaio in vitro (ou ex vivo) para refletir mais de perto o efeito de um agente farmacológico nos mastócitos in vivo, desenvolvemos o ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo no qual células brutas de exsudato peritoneal (PECs) isoladas dos camundongos, tratadas com o agente e administradas com IgE anti-dinitrofenol (DNP), foram incubadas diretamente com DNP em uma proteína transportadora. Descobriu-se que o ensaio não era apenas útil na validação da atividade estabilizadora de mastócitos de um agente farmacológico indicado pelo ensaio in vivo, mas também prático e altamente reprodutível.

Introdução

Os mastócitos desempenham um papel central na alergia ^1,2. Quando a IgE localizada na superfície dos mastócitos por meio da interação com o receptor de alta afinidade para IgE (FcεRI) encontra um alérgeno cognato, uma cascata de sinalização é provocada para estimular a liberação dos grânulos. Como resultado, uma variedade de moléculas efetoras de alergia, incluindo monoaminas (por exemplo, histamina, serotonina), citocinas (por exemplo, TNF-α) e enzimas proteolíticas (por exemplo, triptase, quimase), são liberadas para causar uma série de reações imunológicas, neurológicas e v....

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a diretriz fornecida pelo IACUC (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais) da Universidade Nacional de Chungnam (Número do Protocolo Animal: CNU-00996).

1. Quantificação de moléculas específicas de mastócitos no lisado de PECs brutos

1. Isole as células da cavidade peritoneal do camundongo¹².
   1. Anestesiar um camundongo (8 semanas de idade, macho, BALB/C) com isoflurano. Eutanásia por luxação cervical.
   2. Coloque o mouse em um bloco de espuma. Limpe o abdômen com etanol 70%.
   3. C....

Resultados

Determinação do número ideal de PECs para ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo

Mastócitos (c-kit⁺· Células IgE⁺ duplamente positivas)¹⁵ representam apenas cerca de 2% das PECs (Figura 1A). Estimando os níveis máximos de moléculas específicas de mastócitos a serem detectadas nos sobrenadantes de cultura na suposição de que 100% dos grânulos foram liberados pelos mastócitos em PECs, medimos as qu.......

Discussão

A descoberta de que o ensaio de degranulação de mastócitos pode ser realizado com um número relativamente pequeno de PECs brutos de camundongos é significativa. Embora as PECs devam ser uma excelente fonte de mastócitos primários de camundongos, é exigente purificar mastócitos em PECs. Embora um meio de gradiente de densidade, como o Percoll²⁵ , tenha sido usado com sucesso para purificação de mastócitos de PECs de ratos, seu uso para purificação de mastócitos per.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa		de
microtubo de 1,5 mL	Hisol	MT-15003
Seringa		1757593161
tubo cônico de 15 mL	Thermo Fisher scientific	14-959-53A
20xPBS	Tech & Inovação	BPB-9121-500mL
4-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosamina	SIGMA	N9376
5 mL de tubo de fundo redondo de poliestireno	da vida	352003
tubo cônico de 50 mL	Thermo Fisher scientific	14-959-49A
Alumínio Fiol	BioFact	TS1-3330
Anti-mouse CD117 (c-kit)	Biolegend	135129	manter em 2-8° C
Anti-mouse IgE mAbs	Thermo Fisher scientific	11-5992-81	mantenha em 2-8° C
Antiti-DNP-IgE	SIGMA	D8406-.2MG	mantém em -20°
Centrífuga	C HANIL	396150
D-(+)-gluouse	SIGMA	G8270
Dexametasona	SIGMA	D2915-100MG
DNP-BSA	Invitrogen	2079360	manter em -20° C
EDTA	Biofact	PB131-500
Soro bovino fetal	Thermo Fisher científico	11455035
gelatina	SIGMA	G1890
Glicina	JUNSEI	27185-0350
hemocitômetro	ZEISS	176045
HEPES	Thermo Fisher científico	15630130
Kit ELISA de histamina	Abcam	GK3275957-4	mantenha em 2-8° C
Agitador de placa quente	Lab teach	zso-9001
Isoflurance	Troikaa	I29159
sal de fumarato de cetotifeno	SIGMA	K2628
MCPT-1 ELISA kit	Thermo Fisher scientific	88-7503-22	mantenha em 2-8° C
Mouse Fc block	BD Biosciences	553141	manter em 2-8° C
Propidium iodiole	SIGMA	81845	mantenha em 2-8° C
RBC lise tampão	Biolegend	420301
Fundo redondo 96 poços	SPL-life sciences	30096
Filtro de seringa de uso único	Startoriusag	16555
Microesferas de estreptavidina	MilteryiBiotec	130-048-101	mantenha em 2-8° C
Triton X-100	JUNSEIchemical	49415-1601
TWEEN 20	SIGMA	9005-64-5
Banho-maria	CHANGSHINSCIENCE	190107

1 mL 1757589701 de 10 mL Ciências