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Artigo de método

Um ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo usando células brutas de exsudato peritoneal e estimulação natural de antígenos

2.4K vistas

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DOI:

10.3791/61556

⸱

27 de abril de 2021

 ,  , 
1College of Pharmacy, Chungnam National University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Estabelecemos um ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo realizado pela incubação de células brutas de exsudato peritoneal isoladas dos camundongos, tratadas com um agente farmacológico de interesse e administradas antecipadamente IgE anti-dinitrofenol (DNP), com DNP em uma proteína carreadora.

Resumo

Os estabilizadores de mastócitos são uma parte essencial da medicação para alergia. A anafilaxia sistêmica passiva (PSA) é um ensaio animal amplamente utilizado para investigar o efeito de um agente farmacológico de interesse sobre mastócitos in vivo. Como os sintomas anafiláticos são atribuídos principalmente à exocitose dos grânulos dos mastócitos, concebe-se que o agente causador da melhora dos sintomas tenha uma atividade estabilizadora dos mastócitos. Apesar disso, é prudente confirmar a atividade demonstrando diretamente o declínio da atividade funcional dos mastócitos após o tratamento. Ensaios de degranulação in vitro usando uma linhagem de mastócitos imortalizados ou mastócitos primários cultivados são rotineiramente empregados para esse fim. Os resultados dos ensaios in vitro e in vivo podem nem sempre ser semelhantes entre si; no entanto, como as condições de tratamento (por exemplo, dose de tratamento, tempo, ambientes circundantes) para os ensaios in vitro são frequentemente distintas daquelas para o ensaio in vivo, como o PSA. Em busca de um ensaio in vitro (ou ex vivo) para refletir mais de perto o efeito de um agente farmacológico nos mastócitos in vivo, desenvolvemos o ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo no qual células brutas de exsudato peritoneal (PECs) isoladas dos camundongos, tratadas com o agente e administradas com IgE anti-dinitrofenol (DNP), foram incubadas diretamente com DNP em uma proteína transportadora. Descobriu-se que o ensaio não era apenas útil na validação da atividade estabilizadora de mastócitos de um agente farmacológico indicado pelo ensaio in vivo, mas também prático e altamente reprodutível.

Introdução

Os mastócitos desempenham um papel central na alergia 1,2. Quando a IgE localizada na superfície dos mastócitos por meio da interação com o receptor de alta afinidade para IgE (FcεRI) encontra um alérgeno cognato, uma cascata de sinalização é provocada para estimular a liberação dos grânulos. Como resultado, uma variedade de moléculas efetoras de alergia, incluindo monoaminas (por exemplo, histamina, serotonina), citocinas (por exemplo, TNF-α) e enzimas proteolíticas (por exemplo, triptase, quimase), são liberadas para causar uma série de reações imunológicas, neurológicas e vasomusculares 3,4.

Uma classe de fármacos é chamada estabilizador de mastócitos que alivia os sintomas de alergia, atenuando a função dos mastócitos5. A anafilaxia sistêmica passiva (PSA) é um modelo animal frequentemente utilizado para sondar a atividade estabilizadora de mastócitos de agentes farmacológicos. Como os sintomas anafiláticos resultam principalmente da ativação de mastócitos após a interação de IgE específica para hapteno transferida passivamente com o hapteno em uma proteína transportadora injetada posteriormente no animal, é bem recebido que um agente farmacológico de interesse tenha uma atividade estabilizadora de mastócitos quando seu tratamento resulta em melhora dos sintomas6. Ainda assim, muitas vezes é imperativo demonstrar diretamente o comprometimento da função dos mastócitos pelo agente em um experimento separado para descartar a possibilidade de que a melhora dos sintomas seja derivada de um mecanismo diferente da supressão da função dos mastócitos.

O ensaio de degranulação de mastócitos, que é realizado estimulando os mastócitos com um reagente químico ou um antígeno específico de IgE formando um complexo com FcεRI na superfície dos mastócitos para induzir a exocitose de grânulos secretores (ou seja, degranulação), é geralmente usado para determinar uma atividade estabilizadora de mastócitos de um reagente farmacológico in vitro7. Vários tipos de células são usados nesse ensaio, incluindo a linhagem celular de leucemia basofílica de rato (RBL)8, mastócitos derivados da medula óssea (BMMC) 9 e mastócitos derivados de células peritoneais (PCMC) 10 . Embora útil, pois um grande número de células pode ser facilmente obtido, o RBL é uma linhagem de células cancerígenas imortalizada cujas propriedades celulares não são mais semelhantes às dos mastócitos no corpo. Adquirir um número suficiente de BMMC ou PCMC, mesmo que suas propriedades celulares possam se assemelhar mais às dos mastócitos no corpo, costuma ser caro e demorado.

Um ensaio de degranulação usando mastócitos primários purificados é uma alternativa desejável11. No entanto, o uso de tal ensaio não é difundido como um método fácil para purificar mastócitos de tecido animal, particularmente de tecido de camundongo, com alto rendimento, e a pureza ainda não está disponível. Além disso, uma vez que a concentração e a duração do tratamento com um agente farmacológico para inibir a função dos mastócitos in vitro podem nem sempre coincidir com os in vivo, os resultados obtidos com um ensaio de degranulação in vitro podem deturpar os de um ensaio in vivo, como o PSA, e vice-versa. Portanto, um novo ensaio de degranulação, não apenas imitando de perto a forma como a ativação dos mastócitos ocorre in vivo, mas também refletindo com precisão os efeitos de um reagente farmacológico exercido nos mastócitos in vivo, está em alta demanda. Para atender a essas necessidades, desenvolvemos um ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo onde mastócitos em células de exsudato peritoneal (PECs) isoladas dos camundongos, tratadas com um agente farmacológico de interesse e administradas IgE específica para dinitrofenol (DNP) de antemão, são estimuladas com albumina de soro bovino conjugada com DNP (BSA).

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a diretriz fornecida pelo IACUC (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais) da Universidade Nacional de Chungnam (Número do Protocolo Animal: CNU-00996).

1. Quantificação de moléculas específicas de mastócitos no lisado de PECs brutos

  1. Isole as células da cavidade peritoneal do camundongo12.
    1. Anestesiar um camundongo (8 semanas de idade, macho, BALB/C) com isoflurano. Eutanásia por luxação cervical.
    2. Coloque o mouse em um bloco de espuma. Limpe o abdômen com etanol 70%.
    3. Corte a pele ventral longitudinalmente com uma tesoura de ponta romba. Retire a pele do mouse usando uma pinça e uma tesoura.
    4. Injete 6 mL de tampão B13 de Tyrode gelado na cavidade peritoneal usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 26 G. Insira a agulha suavemente para evitar picar qualquer órgão.
    5. Massageie o abdômen do camundongo por 60-90 s para coletar células peritoneais no tampão B de Tyrode. Faça isso com cuidado para não danificar os vasos sanguíneos.
    6. Insira a agulha (20 G) conectada a uma seringa de 10 mL para cima. Aspire o fluido lentamente da cavidade peritoneal (normalmente 5-6 mL).
    7. Remova a agulha da seringa. Dispense o fluido peritoneal em um tubo cônico de 50 mL. Mantenha o tubo no gelo.
    8. Repita as etapas 1.1.4 a 1.1.7.
    9. Centrifugue o tubo a 300 x g durante 5 min a 10 °C. Ressuspenda as células em 1 mL de 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Mantenha as células no gelo por 3 min.
    10. Dilua a suspensão celular com 2 mL de tampão B de Tyrode. Centrifugue o tubo a 300 x g durante 5 min a 10 °C.
    11. Remova o sobrenadante. Ressuspenda as células em 0,5 mL do tampão A de Tyrode13.
    12. Conte as células com um hemocitômetro. Ajuste o número da célula para 5 x 106 / mL com o tampão A de Tyrode.
  2. Preparar PECs empobrecidos de mastócitos usando um sistema de purificação de células magnéticas14.
    1. Centrifugar 5 x 105 PEC em bruto a 300 x g durante 5 min a 10 °C. Ressuspenda o pellet em 200 μL de tampão de purificação de células PBSBE (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,4).
    2. Adicione 1 μL de bloqueador Fc (0,5 mg/mL) às células para evitar a ligação não específica do anticorpo monoclonal (mAb) anti-c-kit a ser adicionado em seguida. Mantenha as células no gelo por 5 min.
    3. Adicione 1 μL de mAb15 anti-kit de camundongo biotinilado (0,5 mg / mL). Mantenha as células no gelo por 10 min.
    4. Adicione 2 mL de tampão PBSBE. Centrifugue as células a 300 x g durante 10 min a 10 °C.
    5. Remova o sobrenadante. Lave as células novamente com 2 mL de tampão PBSBE.
    6. Ressuspenda as células em 90 μL de tampão PBSBE. Adicione 10 μL de microesferas conjugadas com estreptavidina. Mantenha as células no gelo por 15 min.
    7. Adicione 2 mL de tampão PBSBE. Centrifugue as células a 300 x g durante 10 min a 10 °C.
    8. Carregue 500 μL de tampão PBSBE em uma coluna magnética média durante a centrifugação. Permita que o buffer flua pela coluna.
    9. Remover o sobrenadante após centrifugação. Ressuspenda as células em 500 μL de tampão PBSBE.
    10. Carregue as células na coluna. Colete as células que passam livremente pela coluna.
    11. Lave a coluna com 500 μL de tampão PBSBE. Colete as células que passam pela coluna novamente.
    12. Repita a etapa 1.2.11.
    13. Combine as células das etapas 1.2.9-1.2.11 em um tubo. Centrifugue as células a 300 x g durante 10 min a 10 °C.
    14. Ressuspenda as células no buffer A de Tyrode. Conte as células. Ajuste o número da célula para 5 x 106 células/mL.
  3. Preparar o lisado de PECs.
    1. Placa PECs (por exemplo, 5 x 105) em uma placa de fundo redondo de 96 poços, respectivamente. Centrifugue a placa a 300 x g durante 2 min a 10 °C para recolher as células. Remova o sobrenadante cuidadosamente com pipeta.
    2. Adicione 100 μL de tampão de lise celular ao pellet celular. Ressuspenda as células pipetando para cima e para baixo várias vezes suavemente. Mantenha o prato no gelo por 60 min.
    3. Centrifugue a placa a 300 x g durante 5 min a 10 °C para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante (o lisado celular) para uma nova placa de 96 poços.
  4. Meça a atividade enzimática da β-hexosaminidase16.
    1. Adicione o lisado celular (50 μL) à solução de substrato de β-hexosaminidase pré-aquecida (50 μL) em uma microplaca de 96 poços. Misture-os delicadamente com uma pipeta.
    2. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C. Adicione 50 μL de solução de parada (glicina 100 mM, pH 10,7) após 30 min para encerrar a reação enzimática.
    3. Leia o diâmetro externo das misturas de reação com um leitor de microplacas de absorbância UV-visível em configuração de comprimento de onda duplo; 405 nm para determinar o nível da reação enzimática e 620 nm para subtração automática de fundo, respectivamente.
  5. Meça a concentração de histamina17.
    1. Transfira 100 μL dos lisados de células eliminadas para a placa revestida com mAb anti-histamínico fornecida com o kit ELISA de histamina. Realize o ensaio ELISA de histamina competitiva seguindo o manual do fabricante.
    2. Leia o OD das amostras com um leitor de microplacas de absorbância UV-visível no comprimento de onda de 450 nm.
  6. Determinar a proporção de mastócitos nas PECs com citometriade fluxo 18.
    1. Transfira 1 x 105 PECs brutos ou empobrecidos em mastócitos em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Centrifugue a placa a 300 x g durante 2 min a 10 °C.
    2. Ressuspenda as células em 50 μL de tampão FACS. Adicione 1 μL de c-kit anti-mouse (0,5 mg / mL) e mAbs IgE anti-mouse (0,5 mg / mL).
    3. Vortex as células brevemente. Mantenha as células no gelo por 20 minutos no escuro.
    4. Encha os poços com 150 μL de tampão FACS. Centrifugue a placa a 300 x g durante 2 min a 10 °C. Descarte o buffer virando rapidamente a placa.
    5. Ressuspenda as células com 150 μL de tampão FACS contendo iodeto de propídio (1 μg/mL). Analise as células com um citômetro de fluxo.

2. Ensaio de degranulação de mastócitos usando PECs brutos

  1. Determine a extensão da degranulação dos mastócitos (% de degranulação).
    1. Injete 3 camundongos BALB / C (8 semanas de idade, machos) por via intravenosa (i.v.) com 3 μg de mAb anti-DNP (IgE de camundongo). Isole as PECs um dia após a injeção de Ab (consulte a etapa 1.1).
    2. Placa de 90 μL de PECs brutos (5,5 x 106/mL) em uma placa de fundo plano de 96 poços (total de 4 poços). Incubar a placa em uma incubadora de CO2 umidificado a 37 oC por 30 minutos.
    3. Adicione 10 μL de DNP-BSA (5 ng/mL em 1x PBS) aos poços contendo PECs. Incubar a placa durante 10 minutos numa incubadora de CO2 a 37 °C.
    4. Centrifugue a placa a 300 x g durante 5 min a 10 °C imediatamente após a incubação. Retire os sobrenadantes (100 μL) cuidadosamente com uma pipeta. Guarde-os em um novo prato de fundo redondo de 96 poços no gelo.
    5. Adicione 100 μL de tampão de lise celular (0,1% Triton X-100 em 1 x PBS, pH 7,4) aos poços de microplacas contendo PECs. Mantenha o prato no gelo por 60 min.
    6. Efectuar o ensaio de β-hexosaminidase.
      1. Retirar dois conjuntos de sobrenadantes e dos lisados celulares correspondentes, respectivamente, de quatro que foram armazenados em gelo após o ensaio de degranulação (ver passos 2.1.4 e 2.1.5). Divida o sobrenadante e o lisado celular em dois alvéolos separados (50 μL cada) para duplicação do ensaio.
      2. Adicione 50 μL de solução de substrato de β-hexosaminidase a cada poço. Incubar a placa a 37 °C durante 30 min. Adicione 50 μL de solução de parada (glicina 100 mM, pH 10,7) à mistura de reação.
      3. Leia OD das misturas de reação (consulte a etapa 1.4.3). Calcule a extensão da degranulação dos mastócitos da seguinte forma.
        % de degranulação =sobrenadante OD /(sobrenadante OD +lisado OD) X 100%
    7. Efectuar o ensaio de histamina.
      1. Adicione 100 μL de PBS 1x a outros dois poços dos sobrenadantes e os lisados celulares correspondentes salvos após a degranulação para elevar o volume total das amostras a 200 μL. Divida cada amostra em dois poços separados em uma placa ELISA de histamina fornecida com o kit ELISA de histamina.
      2. Realize o ensaio ELISA seguindo o manual do fabricante. Leia o OD das amostras com um leitor de microplacas de absorbância UV-visível no comprimento de onda de 450 nm. Calcular a extensão da degranulação como indicado no ponto 2.1.6.3.
        % Degranulação = [histamina]sup /([histamina]sup + [histamina]lisado) X 100%
  2. Avalie os efeitos dos medicamentos antialérgicos nos mastócitos exercidos in vivo com o ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo.
    1. Administrar por via oral (p.o.) 200 μL de dexametasona19 (DEX) e cetotifeno20 (KET), respectivamente, a camundongos (6 semanas de idade, machos) uma vez ao dia durante 3 dias (6 camundongos/grupo).
    2. Injete os camundongos por via intravenosa (i.v.) com 3 μg de IgE anti-DNP após o3º tratamento. Divida cada grupo de ratos em duas gaiolas separadas (3 ratos/gaiola); um para o ensaio de PSA e outro para o ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo.
    3. Realize o ensaio de PSA
      1. Injete nos camundongos DNP-BSA (80 μg) um dia após a injeção de IgE anti-DNP. Meça a temperatura corporal com um termômetro retal a cada 15 minutos por 1 h, começando imediatamente após a injeção de DNP-BSA.
      2. Retire o sangue um dia após a injeção de DNP-BSA. Meça os níveis de MCPT-1 no soro com ELISA.
    4. Realizar o ensaio de degranulação ex vivo dos mastócitos.
      1. Isole as PECs dos camundongos um dia após a injeção de IgE anti-DNP. Conte o número de PECs isolados.
      2. Placa de 90 μL de PECs brutos (5,5 x 106/mL) em uma placa de 96 poços (4 poços por camundongo). Incubar as placas em uma incubadora de CO2 umidificado a 37 °C por 30 min.
      3. Adicione 10 μL de DNP-BSA (5 ng/mL). Incubar a placa durante 10 min a 37 °C incubadora de CO2 humidificado.
      4. Centrifugar a placa a 300 x g durante 5 min a 10 °C. Pegue os sobrenadantes (100 μL) com cuidado, deixando as células para trás nos poços.
      5. Adicione 100 μL de tampão de lise celular aos poços. Incube o prato no gelo por 60 min.
      6. Efectuar o ensaio de β-hexosaminidase e o ensaio ELISA de histamina como descrito nos pontos 2.1.6 e 2.1.7. Calcule a % de degranulação como na etapa 2.1.6.3.

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Resultados

Determinação do número ideal de PECs para ensaio de degranulação de mastócitos ex vivo

Mastócitos (c-kit+· Células IgE+ duplamente positivas)15 representam apenas cerca de 2% das PECs (Figura 1A). Estimando os níveis máximos de moléculas específicas de mastócitos a serem detectadas nos sobrenadantes de cultura na suposição de que 100% dos grânulos foram liberados pelos mastócitos em PECs, medimos as qu...

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Discussão

A descoberta de que o ensaio de degranulação de mastócitos pode ser realizado com um número relativamente pequeno de PECs brutos de camundongos é significativa. Embora as PECs devam ser uma excelente fonte de mastócitos primários de camundongos, é exigente purificar mastócitos em PECs. Embora um meio de gradiente de densidade, como o Percoll25 , tenha sido usado com sucesso para purificação de mastócitos de PECs de ratos, seu uso para purificação de mastócitos per...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Sr. Wonhee Lee e à Sra. Eunjoo Lee por sua assistência técnica e administrativa. Também agradecemos à Dra. Thi Minh Nguyet Nguyen por seus comentários atenciosos. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de pesquisa da Universidade Nacional de Chungnam (CNU Research Grant 2017-2098-01) e da National Research Foundation of Korea (NRF-2019R1F1A1061894 e NRF-2019M3A9G4067293).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringade
microtubo de 1,5 mLHisolMT-15003
Seringa1757593161
tubo cônico de 15 mLThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InovaçãoBPB-9121-500mL
4-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminaSIGMAN9376
5 mL de tubo de fundo redondo de poliestirenoda vida352003
tubo cônico de 50 mLThermo Fisher scientific14-959-49A
Alumínio FiolBioFactTS1-3330
Anti-mouse CD117 (c-kit)Biolegend135129manter em 2-8° C
Anti-mouse IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81mantenha em 2-8° C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGmantém em -20°
CentrífugaC HANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DexametasonaSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360manter em -20° C
EDTABiofactPB131-500
Soro bovino fetalThermo Fisher científico11455035
gelatinaSIGMAG1890
GlicinaJUNSEI27185-0350
hemocitômetroZEISS176045
HEPESThermo Fisher científico15630130
Kit ELISA de histaminaAbcamGK3275957-4mantenha em 2-8° C
Agitador de placa quenteLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
sal de fumarato de cetotifenoSIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitThermo Fisher scientific88-7503-22mantenha em 2-8° C
Mouse Fc blockBD Biosciences553141manter em 2-8° C
Propidium iodioleSIGMA81845mantenha em 2-8° C
RBC lise tampãoBiolegend420301
Fundo redondo 96 poçosSPL-life sciences30096
Filtro de seringa de uso únicoStartoriusag16555
Microesferas de estreptavidinaMilteryiBiotec130-048-101mantenha em 2-8° C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Banho-mariaCHANGSHINSCIENCE190107
1 mL 1757589701 de 10 mL Ciências

Referências

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