Gravações de eletrocardiograma em camundongos anestesiados usando chumbo II

Resumo

Apresentamos um protocolo ECG que é tecnicamente fácil, barato, rápido e acessível em ratos pequenos, e pode ser realizado com maior sensibilidade. Sugerimos este método como uma abordagem de triagem para estudar agentes farmacológicos, modificações genéticas e modelos de doenças em camundongos.

Resumo

O eletrocardiograma é uma ferramenta valiosa para avaliar o sistema de condução cardíaca. A pesquisa em animais ajudou a gerar novas informações genéticas e farmacológicas sobre o eletrocardiograma. No entanto, fazer medições de eletrocardiograma em pequenos animais in vivo, como ratos, tem sido um desafio. Para isso, utilizamos um método de gravação de eletrocardiograma em camundongos anestesiados com muitas vantagens: é um procedimento tecnicamente simples, é barato, tem pouco tempo de medição, e é acessível, mesmo em camundongos jovens. Apesar das limitações com o uso da anestesia, comparações entre controle e grupos experimentais podem ser realizadas com maior sensibilidade. Tratamos camundongos com agonistas e antagonistas do sistema nervoso autônomo para determinar a validade deste protocolo e comparamos nossos resultados com relatórios anteriores. Nosso protocolo ECG detectou aumento das frequências cardíacas e intervalos QTc no tratamento com atropina, diminuição das frequências cardíacas e intervalos QTc após o tratamento de carbachol, e maiores frequências cardíacas e intervalos QTc com isoprenalina, mas não notou qualquer alteração nos parâmetros do ECG na administração do propranolol. Esses resultados são suportados por relatórios anteriores, confirmando a confiabilidade deste protocolo ECG. Assim, este método pode ser utilizado como uma abordagem de triagem para fazer medições de ECG que de outra forma não seriam tentadas devido ao alto custo e dificuldades técnicas.

Introdução

O eletrocardiograma (ECG), um teste que mede a atividade elétrica dos batimentos cardíacos, é uma ferramenta valiosa para avaliar o sistema de condução cardíaca. Os parâmetros medidos por um ECG incluem frequência cardíaca, intervalo de RP, duração de QRS e intervalo QT. Em suma, o intervalo de RP corresponde ao tempo necessário para um impulso elétrico viajar do nó sinusino atrial através do nó atrioventricular às fibras purkinje; A duração do QRS é o tempo para que a despolarização ventricular ocorra através do sistema Purkinje e do miocárdio ventricular; e o intervalo QT é a duração da repolarização ventricular.

As gravações de ECG em camundongos ajudaram os pesquisadores a examinar a função cardíaca e determinar os mecanismos fisiológicos e fisiofisiológicos de fenótipos cardíacos, como arritmia, fibrilação atrial e insuficiência cardíaca. A maioria das pesquisas cardiovasculares envolveu estudos em modelos de camundongos geneticamente modificados. É frequentemente desafiador obter dados significativos sobre gravações de ECG de pequenos camundongos que foram geneticamente manipulados.

Existem vários métodos para realizar ECGs em camundongos¹. Estudos sugerem que as gravações de ECG em animais conscientes são preferidas em vez de animais anestesiados quando possível, uma vez que os efeitos da anestesia na função cardíaca foram bem estabelecidos². Dois protocolos que registram ECG em camundongos conscientes são de nota¹. O sistema de radiotelemetry ECG é o padrão-ouro para monitoramento contínuo a longo prazo do ECG em camundongos conscientes^1,,3. Apesar de sua força em ser registrada em estado consciente, as medições de ECG acopladas à radiotelemetry têm várias limitações, incluindo o alto gasto para a configuração e para o implante, sua exigência de um operador altamente experiente, um período de estabilização de mais de 1 semana, sua necessidade de ratos grandes (> 20 g), e aquisição de apenas uma única liderança de gravação de ECG¹. Outro sistema que usa eletrodos condutores do tamanho de uma pata embutidos em uma plataforma permite gravações de ECG em camundongos conscientes sem anestesia ou implantes^1,,4. Este sistema não invasivo é um método alternativo em situações em que os sistemas de radiotelememetria não estão disponíveis, pois tem muitas vantagens: sem exigência de tratamento cirúrgico, sem necessidade de anestesia, baixo custo por mouse (apenas a configuração inicial é cara), pouco tempo para medição e acessibilidade de recém-nascidos^1,,4. A principal desvantagem desse sistema é que ele não é adequado para monitoramento contínuo a longo prazo¹.

Aqui introduzimos outro método de gravação de ECG barato, simples e rápido em camundongos anestesiados e demonstramos sua validade e sensibilidade realizando um ECG após bloqueio/estimulação autônoma do sistema de condução cardíaca. Sugerimos este método ECG para triagem dos efeitos de agentes farmacológicos, modificações genéticas e modelos de doenças em camundongos.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo comitê local de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, Universidade Kyung Hee (número de licença: KHUASP(SE)-18-108) e conformes ao Guia Nacional de Saúde dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Animais experimentais

1. Mantenha todos os camundongos (39 camundongos, Balb/c, macho, 7\u20129 semanas de idade) em uma instalação livre de patógenos, conforme o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório.
2. Mantenha os ratos em um ciclo claro/escuro de 12 horas em temperatura constante com livre acesso a alimentos e água.

2. Preparação de anestésicos

NOTA: Tribromoetanol é usado sobre combinações de cetamina e isoflurano, com base na estabilidade da frequência cardíaca e na reprodutibilidade da ecocardiografia em camundongos tribromoetanol-anesthetizados^1,,5,6

1. Faça uma solução de estoque de 2,2,2 tribromoetanol a uma concentração de 1 g por 1 mL de álcool amilitante terciário. Aqueça a 40\u201245 °C por 24 h. Armazene a 4 °C por 12 meses.
2. Para solução de trabalho, diluir 0,5 mL de solução de estoque em 19,5 mL de soro fisiológico (0,9% NaCl) a 25 mg/mL. Aqueça a 40\u201245 °C por 1 h. Armazene a 4 °C durante 1 mês.

3. Configuração do sistema ECG

1. Certifique-se de configurar o sistema de tal forma que não haja ruído ou vibração dentro de 2 m, uma vez que os sinais de ECG em um mouse são sensíveis ao ruído e movimento ambiental.
2. Prepare a configuração de hardware: um sistema de aquisição de dados, um amplificador bio e um computador instalado com um software de análise de dados ECG.
   1. Conecte o sistema de aquisição de dados à rede elétrica (AC) usando o cabo de alimentação.
   2. Conecte o sistema de aquisição de dados ao computador usando um cabo USB.
   3. Conecte a saída de sinal no painel traseiro do amplificador bio a uma entrada analógica no painel frontal do sistema de aquisição de dados usando um cabo.
   4. Conecte a saída I²C do sistema de aquisição de dados à entrada I²C do amplificador bio usando o cabo I²C.
   5. Conecte o cabo bio amplificador de 3 chumbo ao soquete de entrada de 6 pinos no painel frontal do amplificador bio.
   6. Ligue o sistema de aquisição de dados usando o interruptor no painel traseiro.
      NOTA: Em suma, os sinais são amplificados através de um bio amplificador e registrados utilizando um sistema informatizado de aquisição e análise de dados com as seguintes configurações do canal: taxa de amostragem de 2 k/s, alcance de 20 mV e configuração de filtro de baixa passagem de 200 Hz.
3. Abra o programa de software de análise e configure-o para aquisição de dados ECG.
   1. Ir para Configuração | Configurações do canal. Defina a Taxa de Amostra para 2 k/s. Defina o intervalo para 20 mV. Defina o amplificador de entrada para 200 Hz de Low Pass.
   2. Vá para análise do ECG | Configurações do ECG. Escolha "Mouse" nas configurações Predefinição de Detecção e Análise.
   3. No painel Média, opte por concatenar N (por exemplo, 4 batidas ou 60 s) ciclos cardíacos consecutivos em um único sinal médio para exibição média e visualização da tabela.
   4. No painel QTc, selecione o método "Bazett", que é definido como o valor corrigido pela frequência cardíaca do intervalo QT: QTc = QT / (RR/100)^0,5, intervalo RR = 60 / frequência cardíaca⁷.

4. Medição do ECG

1. Coloque um mouse em uma balança de precisão e grave seu peso.
2. Induzir anestesia no camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução de trabalho de tribromoetanol (18 mL de solução de trabalho por kg de peso corporal (b.w.)).
3. Coloque um rato anestesiado em posição supina. Certifique-se de que o mouse está completamente anestesiado (menos de 2 minutos).
4. Insira os eletrodos com agulhas de acupuntura subcutâneas nos membros dianteiros direito e esquerdo e na parte traseira esquerda de acordo com o esquema ECG de chumbo II e fixe-os com fita(Figura 1). Certifique-se de que a profundidade e a posição dos eletrodos inseridos sejam consistentes ao longo dos experimentos.
5. Conecte as outras extremidades dos eletrodos clicando-as nos três conectores de encaixe na outra extremidade dos fios de chumbo do cabo bio amplificador de 3 chumbo.
6. Injete drogas (i.p.) 3 min após o parto dos anestésicos(Figura 2).
7. Comece a gravar o ECG 10 min depois de injetar anestésicos. Uma vez concluída a gravação, use os dados do ECG de 12 a 17 minutos após a injeção de anestésicos para análise.
8. No final da sessão de gravação do ECG, remova cuidadosamente os eletrodos.

5. Análise de dados do ECG

1. Vá para análise do ECG | Visualização média e garantir que o software identifique corretamente o início e o fim da onda P, complexo QRS e onda T em batidas individuais. Se necessário, a correção manual dessas ondas e intervalos é possível movendo os cursores extraviados para as posições apropriadas.
   NOTA: Como descrito na Figura 3A, o intervalo de RP abrange o início da onda P para o do complexo QRS (a maioria faltando onda Q em um ECG do mouse). A duração do QRS estende-se desde o início da onda Q (principalmente uma onda R em um ECG do mouse) até o final da onda S. O intervalo QT compreende o início da onda Q (principalmente a onda R em um ECG do mouse) até o final da onda T. Observe a menor duração e ausência de uma onda Q e segmento ST no ECG do mouse em relação ao ECG^{humano 8}.
2. Vá para análise do ECG | Visualize a tabela e selecione os dados ECG corretamente identificados verificando batidas individuais na janela Exibição de média.
   NOTA: A Figura 3 mostra vários exemplos de sinais eCG reais do mouse. A Figura 3A representa um sinal normal do tipo selvagem que foi corretamente identificado em relação à onda P, complexo QRS e onda T. A seleção computadorizada de ondas PQRS pode incorrer em deslocamentos errôneos, como na Figura 3B um sinal normal do tipo selvagem que perde o início da onda P. Na Figura 3C um sinal ECG que extravia o fim do complexo QRS, resultando em uma superestimação da duração do QRS. Na Figura 3D um sinal ECG que perde o final do complexo QRS, resultando na subestimação do complexo QRS devido à onda T ambígua e à Figura 3E um sinal ECG com uma onda T não identificável. Sem exclusão ou correções manuais, os intervalos PQRS podem ser mais ou subestimados. Certifique-se de selecionar os sinais ECG que foram corretamente identificados e os sinais que não erram os picos de destino. Consequentemente, tais casos, incluindo B, C, D e E (Figura 3),são excluídos na estimativa precisa dos parâmetros de ECG em geral.
3. Selecione os dados ECG de interesse na Exibição da Tabela e copie/cole-os em um arquivo de planilha.

6. Análise estatística

1. Realizar a análise estatística utilizando um programa estatístico. Analise os dados com as condições experimentais cegas. Realize o teste tdo student e o teste U de Mann-Whitney para comparações de 2 grupos. Os números em cada figura indicam o número de ratos que são usados para cada grupo. Informe os resultados como média ± SEM.
2. Considere as diferenças com p < 0,05 por U-test para ser estatisticamente significante: *, p < 0,05; **, p < 0,01; e ***, p < 0,005 contra respectivos controles.

Resultados

Experimentos farmacológicos

Para determinar se nossa medição não invasiva do ECG reflete a influência da modulação autônoma no sistema de condução cardíaca, os camundongos Balb/c normais foram desafiados com agonistas e antagonistas do sistema nervoso autônomo (ANS). Atropina e carbachol foram utilizados para efetuar bloqueio e estimulação autônoma parassimpáticos, respectivamente, enquanto propranolol e isoprenalina foram administrados para provocar bloqueio e estimulação aut...

Discussão

Há várias etapas críticas no protocolo. O ambiente circundante deve estar livre de ruído e vibração. Os eletrodos ECG devem ser inseridos sob a pele de forma estável e consistente, dos quais a etapa de inserção requer experimentos preliminares até que o pesquisador seja tecnicamente experiente. Além disso, o anestésico deve ser preparado e armazenado adequadamente e usado na dose adequada. Finalmente, as ondas PQRS devem ser localizadas adequadamente em batidas individuais de ECG na janela Exibição média.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,2,2-tribromoetanol	Anestésicos	Sigma-Aldrich	T48402-25G
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japão		Camundongos Balb/c, machos, com idade entre 7 e 9 semanas
Atropina	Sigma-Aldrich	A0123	antagonista parassimpático
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Austrália	ML132	bio amplificador
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	agonista parassimpático
Eletrodos com agulhas de acupuntura	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Coréia	DB106	0,20 x 15 mm
Isoprenalina	Sigma-Aldrich	I2760	agonista simpático
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Austrália		software de análise de dados
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, EUA	5L79	Dieta do rato
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Austrália		sistema de aquisição de dados
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	antagonista simpático
SPSS Programa de estatísticas SPSS