Distinguindo Células Imunes Intrapulmonares de Populações de Células Imunes Intravasculares: a Abordagem Intrajugular

Resumo

O objetivo do presente estudo é descrever um protocolo para diferenciar entre células imunes intravasculares e intraparenquimatosas em estudos de inflamação pulmonar. Usamos uma injeção intrajugular de um anticorpo marcado com fluorescência antes da coleta do pulmão. Além disso, usamos um processo de digestão pulmonar baseado em inflação para melhorar o rendimento de leucócitos do pulmão.

Resumo

Os ritmos circadianos referem-se a oscilações em vários processos biológicos que ocorrem com um período de 24 horas. No nível molecular, esses ritmos são compostos por uma teia de loops de feedback transcricional-translacional (TTFL) de genes do relógio central. Tecidos e sistemas de órgãos individuais, incluindo o sistema imunológico, têm seu próprio relógio. Na circulação sistêmica, vários membros da população CD45⁺ oscilam ao longo do dia; no entanto, muitos desses ritmos não são idênticos ou mesmo semelhantes na população de leucócitos CD45⁺ residentes no tecido. Ao estudar o papel da regulação circadiana da inflamação pulmonar, o CD45⁺ dentro do pulmão pode precisar ser investigado. No entanto, apesar dos métodos de perfusão otimizados, os leucócitos retidos da circulação persistem nos pulmões. O objetivo ao projetar este protocolo foi distinguir entre leucócitos intravasculares e intraparenquimatosos. Para esse fim, os camundongos são injetados com um anticorpo CD45 marcado com fluorescência por via intrajugular pouco antes da coleta do pulmão. Depois disso, o pulmão é digerido usando uma técnica de digestão pulmonar personalizada para obter uma suspensão de célula única. A amostra é corada para o painel regular de anticorpos para células imunes intraparenquimatosas (incluindo outro anticorpo CD45). As análises de citometria de fluxo mostram uma clara elucidação das populações. Assim, o método de marcação e definição de células CD45⁺ intrapulmonares será particularmente importante onde o comportamento das células imunes intrapulmonares e circulantes são numérica e funcionalmente distintos.

Introdução

Descrevemos aqui métodos eficientes e confiáveis de diferenciação de leucócitos intravasculares de leucócitos pulmonares. Mesmo com as melhores técnicas de perfusão, estudos revelaram que o CD45⁺ residual da circulação persiste no pulmão. Isso prejudica a capacidade de distinguir entre os ritmos da circulação e do pulmão. Este efeito é ainda mais amplificado em casos de inflamação pulmonar. Isso é particularmente relevante para o estudo da regulação circadiana da inflamação.

Os ritmos circadianos referem-se às oscilações diurnas em vários processos biológicos que ocorrem com um período de 24 h. O....

Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia e atenderam às estipulações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

NOTA: O processo geral pode ser dividido em 1) marcação intravenosa de CD45, 2) colheita, 3) digestão e 4) coloração e citometria de fluxo. Essas etapas foram resumidas na Figura 1.

1. Preparação de soluções/reagentes

1. Prepare o meio de dissociação adicionando 5 mL de 2 mM de L-glutamina, 20 mL de soro fetal bovino (FBS), 1 mL de....

Resultados

Usando essa técnica, a contagem total de células dos pulmões dissociados virgens (apenas os lobos esquerdos foram usados para os dados representativos) estava entre 27,3 x 10⁶ a 71,1 x 10⁶ células/mL. Após o gating no tamanho e o gating out de dupletos e células mortas (esquema de gating na Figura 2), a contagem de leucócitos variou de 6,9 x 10⁶ a 13,5 x 10⁶ células/mL. Os leucócitos circulantes que permanecem presos mesmo após a perfusão para limp.......

Discussão

Estudos cuidadosos da inflamação pulmonar e das respostas imunes pulmonares são cruciais para a compreensão de muitas doenças. A citometria de fluxo é rotineiramente usada para enumerar e atribuir relevância funcional aos leucócitos pulmonares. A função dos leucócitos depende, pelo menos em parte, de onde eles são encontrados. Embora haja evidências acumuladas para apoiar que, mesmo após protocolos de perfusão perfeitos, muitos leucócitos intravasculares persistem nos pulmões, a maioria .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Boekel Scientific Banho de Água Médio	Boekel Grant Scientific	290200
Seringas BD de 10 mL com Ponta BD Luer-Lok BD	Biosciences	309604
Seringas BD de 5 mL BD com Ponta BD Luer-Lok	BD Biosciences	309646
Anti-CD45- Pac Blue	Biolegend	103114
Anti-CD45- Pe/Cy7	Biolegend	103114
Filtro de células 70 µ m Nylon	Fisher	352350
Corning Tubo de Centrífuga de Fundo Cônico 50 mL	Avantor	21008-714
Tubo de Ensaio Corning Falcon com Filtro de Células Tampa de Pressão	EMSCO
Microscópio de Dissecção	Olympus	SZX-SDO2
DMEM, alta glicose	Life Technologies	11965084
Dnase	Roche
DPBS sem Ca++ & Mg++		14190136
Bloco Fc	Biolegend	101320
HyClone Fetal Bovine Serum	GE Healthcare	SH30071.03
L-Glutamina (200 mM)	Life Technologies	25030-081
Liberase Research Grade	Sigma	5401127001
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Life Technologies	15140-122
Banho de Água com Agitação de Precisão	Thermo Fisher	TSSWB15
Tampão de Lise de Glóbulos Vermelhos	Sigma	R7757
Sutura Seda 4-0	Roboz	SUT-15-2

10004637 10104159001