Artigo de método

Analisando a rede de α-Actinin em Cardiomiócitos derivados do iPSC humano usando microscopia de localização de molécula única

DOI:

10.3791/61605

⸱

3 de novembro de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A maturação dos cardiomiócitos derivados do iPSC é uma questão crítica para sua aplicação em terapia regenerativa, testes medicamentosos e modelagem de doenças. Apesar do desenvolvimento de protocolos de diferenciação múltiplos, a geração de cardiomiócitos iPSC semelhantes a um fenótipo semelhante a um adulto permanece desafiadora. Um aspecto importante da maturação dos cardiomiócitos envolve a formação de uma rede de sarcomere bem organizada para garantir alta capacidade de contração. Aqui, apresentamos uma abordagem baseada em super resolução para análise semi-quantitativa da rede α-actinina em cardiomiócitos. Utilizando microscopia de localização fotoativada foi realizada uma comparação do comprimento do sarcomere e da espessura do disco z de cardiomiócitos derivados do iPSC e células cardíacas isoladas do tecido neonatal. Ao mesmo tempo, demonstramos a importância das condições adequadas de imagem para obter dados confiáveis. Nossos resultados mostram que este método é adequado para monitorar quantitativamente a maturidade estrutural das células cardíacas com alta resolução espacial, permitindo a detecção de até mesmo alterações sutis da organização sarcomere.

Introdução

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Doenças cardiovasculares (DCV) como infarto do miocárdio ou cardiomiopatia continuam sendo a principal causa de morte no mundo ocidental1. Como o coração humano possui apenas baixa capacidade regenerativa, há necessidade de estratégias para promover a recuperação dos DCV. Isso inclui terapias de substituição celular para repor cardiomiócitos perdidos (CM), bem como o desenvolvimento de novos medicamentos anti-arrítmicos para intervenção farmacêutica eficiente e segura. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm se mostrado uma fonte celular promissora para a geração ilimitada de CM humano in vitro, adequado para terapias regenerativas, modelagem de doenças e para o desenvolvimento de ensaios de rastreamento de medicamentos2,,3,4.

Embora existam muitos protocolos de diferenciação cardíaca diferentes, o CM derivado do iPSC ainda carece de certos aspectos fenotípicos e funcionais que impedem a aplicação in vitro e in vivo5,6. Além das alterações eletrofisiológicas, metabólicas e moleculares, o processo de maturação cardíaca envolve a organização estrutural dos sarcomeres, que são as unidades fundamentais necessárias para a geração de força e contração celular7. Enquanto os CMs adultos exibem um aparelho contratil bem organizado, os CMs derivados do iPSC comumente demonstram filamentos sarcomere desaranjados, associados a uma capacidade de contração reduzida e dinâmica de contração alterada8,,9. Em contraste com cm maduros que mostram padrão de contração uniaxial, as estruturas desorientadas em CM imaturos resultam em uma contração radial de toda a célula ou promovem o aparecimento dos pontos focais de contração9,,10.

Para melhorar a maturação cardíaca, foram aplicadas múltiplas abordagens, incluindo métodos de cultura celular 3D, estimulação elétrica e mecânica, bem como o uso de matrizes extracelulares imitando condições in vivo11,,12,,13. Para avaliar o sucesso e a eficiência dessas diferentes condições culturais, são necessárias técnicas para monitorar e estimar o grau de maturação estrutural do CM iPSC, por exemplo, por técnicas microscópicas. Em contraste com a imagem confocal convencional, a resolução em caso de microscopia de localização fotoativada (PALM) é aproximadamente 10x maior. Essa técnica, por sua vez, permite uma análise mais precisa, detectando até mesmo alterações sutis das estruturas celulares14. Considerando a alta resolução da imagem baseada em PALM, o objetivo geral deste método foi a avaliação microscópica da maturidade sarcomere em CMs derivados do iPSC por determinação precisa da espessura do disco z e do comprimento do sarcomere. Em estudos anteriores, essas características estruturais têm se mostrado parâmetros adequados para avaliar a maturidade cardíaca15. Por exemplo, iPSC-CM doente sem distrofina de comprimento total exibe comprimento reduzido de sarcomere e largura de banda z quando comparado com células do tipo selvagem16. Da mesma forma, o comprimento dos sarcomeres individuais foi medido para investigar o impacto das pistas topográficas no desenvolvimento cardíaco16. Assim, aplicamos essa abordagem para avaliar a maturação estrutural da rede sarcomere no iPSC-CM, medindo quantitativamente o comprimento do sarcomere e a espessura do disco Z.

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Protocolo

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Todas as etapas deste protocolo envolvendo camundongos neonatais e adultos foram realizadas de acordo com as diretrizes éticas para o cuidado animal do Centro Médico da Universidade de Rostock.

1. Cultivo e dissociação de cardiomiócitos derivados do iPSC

  1. Diferencie hiPSC-CMs por 25 dias usando um método de monocamadas 2D, conforme descrito anteriormente17.
  2. Dissociação pré-inaque de médio a 37 °C e suporte temperatura média a ambiente.
  3. Lave as células duas vezes com PBS.
  4. Adicione a dissociação pré-armada de meio às células e incubar por 12 min a 37 °C e 5% de CO2.
  5. Adicione meio de suporte às células.
    NOTA: O volume do meio de suporte adicionado precisa ser o dobro do volume do meio de dissociação utilizado na etapa 1.4.
  6. Desaloja as células usando uma pipeta sorológica de 5 mL.
  7. Centrífugas a 200 x g por 5 min e resuspensam a pelota em 3 mL de cultura hiPSC-CM média17.
  8. Células de sementes em 8 câmaras de fundo de vidro bem a uma densidade celular de 75.000 células/bem e cultura por 3 dias.

2. Isolamento do cardiomiócito adulto

  1. O isolamento e o cultivo de cardiomiócitos adultos de camundongos NMRI foram realizados como relatado anteriormente18.
  2. Células de sementes em 8 bem vidro câmara slide e cultura por um dia.

3. Isolamento e cultivo de cardiomiócitos neonatais

  1. O procedimento de isolamento dos cardiomiócitos neonatais, obtidos a partir de camundongos NMRI, foi realizado conforme descrito anteriormente19.
  2. Célula isolada de sementes em 8 poços de vidro de câmara deslizam a uma densidade celular de 75.000 células/bem e cultura por 3 dias na cultura neonatal CM médio19.

4. Rotulagem de imunofluorescência da rede α-actinin

NOTA: Para obter resultados ótimos, as células são cultivadas em 8 câmaras de fundo de vidro. A rotulagem deve ser realizada um dia antes da imagem.

  1. Pré-aquecimento 4% PFA a 37 °C.
  2. Corrija o iPSC-CM adicionando 4% de paraformaldeído diretamente na mídia cultural (diluição 1:1) e incubar a 37 °C por 15 min. A concentração final de PFA para fixação é de 2%.
  3. Incubar células fixas em 0,2% Triton-X, diluídas em PBS, por 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lave as células duas vezes com PBS, 5 min cada.
  5. Adicione 1% de solução BSA (diluída em PBS) e incubar por 60 min a temperatura ambiente.
  6. Prepare 150 μL de solução de anticorpos primários diluindo anticorpo α-actinin 1:100 em 1% BSA, contendo 0,05% Triton-X. Adicione às células e incubar à temperatura ambiente por 60 minutos.
  7. Lave as células duas vezes com solução BSA de 0,2%, 5 min cada.
  8. Prepare 150 μL de solução secundária de anticorpos diluindo o anticorpo Alexa647 1:100 em 1% BSA, contendo 0,05% Triton-X. Adicione às células e incubar à temperatura ambiente por 40 minutos.
  9. Lave as células duas vezes com solução BSA de 0,2%, 5 min cada.
  10. Lave as células duas vezes com PBS, 5 min cada. Mantenha as células rotuladas no escuro a 4 °C até que a imagem PALM.

5. Preparação do tampão de imagem PALM

NOTA: É fundamental preparar recentemente o tampão de imagem PALM para cada experimento.

  1. Prepare 50% de solução de glicose dissolvendo 25 g de glicose em 50 mL de água destilada.
  2. Prepare o tampão básico contendo 50 mM Tris-HCl, 10% de glicose e cloreto de sódio de 10 mM.
    1. Ajuste o nível de pH para ~8.0 usando ácido clorídrico.
  3. Prepare a solução de pianose oxidase dissolvendo 0,6 mg de pianose oxidase em 316 μL de tampão básico.
  4. Prepare a solução de catalase dissolvendo 7 mg de catalase em 500 μL de buffer básico. Misture bem e centrífugue a 10.000 x g por 3 min. Mantenha o supernatante para uso posterior. A solução catalase pode ser mantida a 4 °C por vários dias.
  5. Prepare 500 μL de tampão de imagem PALM misturando 316 μL de solução de piróanose oxidase, 25 μL de solução catalase, 100 μL de solução de glicose de 50%, 50 μL de cisteamina, 5 μL de ciclooctatetraene e 3,5 μL de β-Merctoapeol. A atividade catalítica final de pianose oxidase e catalase precisa ser de 7,5 U, 35.00U, respectivamente.
    NOTA: O tampão de imagem PALM fornece condições de imagem ideais para 3-5 h. Se a capacidade de piscar do corante fluorescente diminuir, prepare uma nova alíquota tampão.

6. Aquisição de imagem palm

  1. Ligue o microscópio pelo menos 3 h antes de usar e leve a amostra à temperatura ambiente antes da imagem para permitir o equilíbrio térmico. Se o microscópio estiver equipado com uma câmara de incubação, ajuste a temperatura para 30 °C.
  2. Limpe o objetivo e o fundo do slide da câmara usando um solvente de limpeza adequado.
  3. Adicione 300 μL de tampão de imagem PALM em um poço de células rotuladas e insira o slide da câmara no suporte do estágio do microscópio.
  4. Defina os parâmetros de aquisição de imagem PALM.
    1. Selecione 1,57 N.A. 100x objetivo de óleo para aquisição.
    2. Selecione o modo PALM e ative as configurações de TIRF.
    3. Ajuste o número de quadros a serem adquiridos. Normalmente 5.000-10.000 quadros são suficientes para obter resultados ideais. No entanto, o número de quadros adquiridos depende fortemente da eficiência de rotulagem e da capacidade piscando do corante fluorescente e pode ser ajustado pelo usuário.
    4. Defina a potência laser UV para 0,1% e 647 laser para 0,2%.
    5. Defina o nível de ganho para 50-100.
    6. Ligue a iluminação laser e selecione uma célula alvo. O nível de ganho pode ser aumentado se a intensidade do sinal for baixa (dependendo da rotulagem de fluorescência).
    7. Desligue a iluminação laser
  5. Aquisição de imagem PALM
    1. Reduza o ganho para 0 e aumente a potência laser (ex 647) para 100%.
    2. Alvejar a célula alvo por ~5 s.
    3. Aumente o ganho para 50 e inicie a aquisição de imagem palm.
      NOTA: O ganho precisa ser ajustado para obter intensidade de sinal suficiente, enquanto pixels supersaturados devem ser evitados. Se a intensidade do sinal reduzir, aumente o nível de ganho.
  6. Opcionalmente, melhore constantemente a potência do laser UV (0,1%-10%) para aumentar a intensidade do sinal e promover o piscar do fluorforo.

7. Reconstrução de dados palm

  1. Abra o software Image J e importe os dados do PALM.
  2. Plugin de tempestade aberta e "análise de execução"
    1. No menu "Configuração da câmera" digite o tamanho do pixel e o ganho EM.
      NOTA: Ao usar objetivos de 100x e lente de ampliação de 1,6x, o tamanho de 100 nm pixel é apropriado. No entanto, como o tamanho do pixel depende dos recursos de hardware do microscópio e da câmera usado para imagens PALM, os usuários precisam verificar cuidadosamente e adaptar este parâmetro. Os valores de ganho EM podem ser obtidos a partir dos metadados.
    2. No menu de análise "Executar" definir parâmetros da seguinte forma: ordem B-spline: 3, escala B-spline: 2.0, limiar de intensidade máxima: stf (Wave.F1), raio de montagem: 3, sigma inicial: 1.6, ampliação: 5.0, frequência de atualização: 50, mudanças laterais: 2. Confirme clicando no botão "Ok".
  3. Pós processamento de imagem PALM reconstruída
    1. No menu "Plot histogram" selecione o parâmetro "Sigma".
    2. Use a ferramenta "Retângulo" para selecionar um ROI, excluindo possíveis artefatos e aplicar ROI no filtro. Os valores do ROI aparecerão na caixa de comando do filtro.
    3. Adicione "& incerteza e 25" aos valores do ROI. Um possível comando de filtro será assim: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & incerteza <25". Aplique valores sigma selecionados.
    4. No menu "Remover duplicatas", digite um limiar de distância de "10 nm" e aplique.
    5. No menu "Merging", defina distância máxima para "20", quadros máximos por molécula a "0" e máximo off frames para "1". Aplique as configurações.
    6. No menude correção " Drift", selecione correlação cruzada e defina " Número decaixas" para "5" e "Ampliação" para "5.0". Aplique as configurações de correção de deriva.
    7. Salve a imagem PALM final e exporte dados processados pós-processo, se desejar.

8. Análise de filamentos de sarcomere

  1. Análise do comprimento do sarcomere
    1. Abra o software Imagem J e importe a imagem PALM reconstruída.
    2. Desenhe uma linha entre estruturas de sarcomere selecionadas perpendiculares ao disco z para medir a menor distância entre filamentos de actinin.
    3. Selecione "Plot profile" no menu "Analisar" e adquira o comprimento entre dois picos. Como o comprimento do sarcomere pode variar dentro de uma célula, um mínimo de 20 sarcomeres deve ser medido em diferentes áreas da célula alvo.
  2. Análise da espessura do z-Disco
    1. Abra o software Imagem J e importe a imagem PALM reconstruída.
    2. Converta a imagem PALM reconstruída em uma imagem de modo de 8 bits.
    3. Abra o plugin de detecção de cume e digite os seguintes parâmetros: largura de linha: 20, alto contraste: 230, baixo contraste: 10, sigma: 0,79, limiar inferior: 25,84, comprimento mínimo da linha: 20.
    4. Definir "Largura de estimativa", " Linhaestendida" e " Resultadosde exibição".
    5. Clique em "Ok" e use "Largura de linha média" da tabela de resultados para novas análises.

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Resultados

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Para a estimativa do grau de maturação estrutural de CM, adulto neonatal, adulto totalmente maduro e CM iPSC foram inicialmente rotulados como CM com anticorpo α-actinin para visualizar a rede de sarcomere. Após a aquisição do PALM, as imagens foram reconstruídas e a espessura do disco z foi medida por meio de um software de processamento de imagem baseado em plugin para a detecção automática da largura dos filamentos individuais. O comprimento de Sarcomere foi calculado medindo a distância entre dois picos de intensidad...

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Discussão

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A geração de CM in vitro derivada do iPSC funcional é importante para terapias regenerativas, modelagem de doenças e desenvolvimento de plataformas de rastreamento de medicamentos. No entanto, a maturidade insuficiente desses CM é um grande obstáculo na pesquisa cardiovascular20. Nesse sentido, são necessárias técnicas de imagem de alta resolução que permitam o monitoramento do estado de maturação estrutural do CM derivado do iPSC. Ao mesmo tempo, a microscopia de super resolução pode ser uma ferr...

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Divulgações

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Os autores não declaram conflito de interesses.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pelo Fundo Estrutural da UE (ESF/14-BM-A55-0024/18). Além disso, o H.L. é apoiado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade de Rostock (889001 e 889003) e pela Fundação Josef e Käthe Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. é apoiado pelo Programa de Cientistas Clínicos do Centro Médico da Universidade de Rostock. A R.D é apoiada pelo DFG (DA1296/6-1), pela fundação DAMP, pela Fundação Alemã do Coração (F/01/12) e pela BMBF (VIP+ 00240).

Agradecemos a Madeleine Bartsch por seu apoio técnico na cultura celular iPSC e diferenciação cardíaca.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
linha celular humana iPSCTakaraY00325
µ-Slide 8 Poço Fundo de Vidroibidi80827
0.5ml tubo eppendorf Eppendorf30121023
Albumina de soro bovinoSigma AldrichA906
Kit de Dissociação de CardiomiócitosTecnologias de Células-Tronco05025
CatalaseSigma AldrichC40-1G
CiclooctatetraenoSigma Aldrich138924-1G
CisteaminaSigma Aldrich30070-10g
salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem Ca2+ e Mg2+Thermo Fisher14190169
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
Software de processamento de imagem Fiji (Imagem J)
GlicoseCarl RothX997.2
Ácido clorídricoSigma AldrichH1758
LSM 780 ELYRA PS.1 sistemaZeiss
ParaformaldeídoMerck8187150100
Piranose oxidaseSigma AldrichP4234-250UN
anticorpo sarcômrico de &alfa;-actinina [EA-53]Abcamab9465
Cloreto de sódioSigma AldrichS7653
água estérilCarl Roth3255.1
Triton X-100Sigma AldrichX100
Base TrizmaSigmaAldrich T1503
β-mercaptoetanolSigma AldrichNº 63689
Solução

Referências

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Alpha Actinin NetworkPhotoactivated Localization MicroscopySarcomere Length AnalysisZ Disc Thickness MeasurementCardiomyocyte Maturation AssessmentSuper Resolution ImagingPALM Image ReconstructionFluorescent Molecule Localization

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