Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Summary

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Abstract

A fração estromal-vascular (FVS) do tecido adiposo branco (TAB) é notavelmente heterogênea e consiste em vários tipos de células que contribuem funcionalmente para a expansão e remodelação do TAB na idade adulta. Uma tremenda barreira para estudar as implicações dessa heterogeneidade celular é a incapacidade de isolar prontamente subpopulações celulares funcionalmente distintas do WAT SVF para análises in vitro e in vivo. A tecnologia de sequenciamento de célula única identificou recentemente subpopulações de células perivasculares PDGFRβ+ fibroinflamatórias e adipogênicas funcionalmente distintas em depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos. Os progenitores fibro-inflamatórios (denominados "FIPs") são células produtoras de colágeno não adipogênico que podem exercer um fenótipo pró-inflamatório. As células precursoras de adipócitos PDGFRβ+ (APCs) são altamente adipogênicas tanto in vitro quanto in vivo após o transplante de células. Aqui, descrevemos vários métodos para o isolamento dessas subpopulações de células estromais de depósitos intra-abdominais murinos de WAT. FIPs e APCs podem ser isolados por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou aproveitando a tecnologia de esferas imunomagnéticas baseadas em anticorpos biotinilados. As células isoladas podem ser usadas para análise molecular e funcional. Estudar as propriedades funcionais da subpopulação de células estromais isoladamente expandirá nosso conhecimento atual da remodelação do tecido adiposo sob condições fisiológicas ou patológicas no nível celular.

Introduction

O tecido adiposo branco (TAB) representa o principal local de armazenamento de energia em mamíferos. Dentro desse tecido, os adipócitos, ou "células de gordura", armazenam o excesso de calorias na forma de triglicerídeos, embalados em grandes gotículas lipídicas uniloculares. Além disso, os adipócitos secretam uma infinidade de fatores que regulam vários aspectos da homeostase energética ^1,2,3. Os adipócitos constituem a maior parte do volume de TAB; no entanto, os adipócitos representam apenas menos de 50% do total de células encontradas no WAT ^4,5. O compartimento não adipócitos do TAB, ou fração estromal-vascular (SVF), é bastante heterogêneo e contém células endoteliais vasculares, células imunes residentes em tecidos, fibroblastos e populações de células precursoras de adipócitos (APC).

O WAT é excepcional em sua notável capacidade de expandir em tamanho à medida que a demanda por armazenamento de energia aumenta. A manutenção dessa plasticidade tecidual é essencial, pois o armazenamento adequado de lipídios no WAT protege contra a deposição de lipídios ectópicos deletérios em tecidos não adiposos⁶. A maneira pela qual os depósitos individuais de WAT sofrem essa expansão em resposta ao excesso calórico é um determinante crítico da sensibilidade à insulina no cenário de obesidade⁷. A expansão patológica do TAB, observada em indivíduos obesos com síndrome metabólica, é caracterizada pela expansão preferencial dos depósitos viscerais do TAB em detrimento do tecido adiposo subcutâneo metabolicamente favorável. Além disso, a resistência à insulina na obesidade está associada ao remodelamento patológico do TAB. Caracteriza-se por crescimento hipertrófico dos adipócitos existentes (aumento de tamanho), angiogênese inadequada, inflamação metabólica crônica, acúmulo de componentes da matriz extracelular (fibrose) e hipóxia tecidual ^8,9. Esses fenótipos de obesidade WAT estão associados à esteatose hepática e resistência à insulina, semelhante ao que é observado na condição de lipodistrofia (ausência de WAT funcional). Em contraste, a expansão saudável do WAT é observada na população obesa metabolicamente saudável e é caracterizada pela expansão preferencial do WAT subcutâneo protetor e expansão do depósito através da hiperplasia dos adipócitos¹⁰. O recrutamento de novos adipócitos é mediado pela diferenciação de adipócitos de novo de células precursoras de adipócitos (APCs) (denominada "adipogênese"). A hiperplasia de adipócitos coincide com graus relativamente mais baixos de fibrose WAT e inflamação metabólica ^6,11. Uma infinidade de tipos de células dentro do microambiente WAT influencia diretamente a saúde e a capacidade de expansão do WAT na obesidade¹². Como tal, definir a função dos vários tipos de células presentes no WAT continua sendo uma alta prioridade para o campo.

Na última década, várias estratégias foram empregadas para definir e isolar APCs nativos de WAT SVF¹³ humano e de camundongo. Tais estratégias isolam APCs com base na expressão da superfície celular de marcadores comuns de células-tronco/progenitoras mesenquimais usando técnicas de separação celular baseadas em anticorpos. Essas abordagens incluem classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), usando anticorpos marcados com fluoróforo, ou separação de esferas imunomagnéticas (ou seja, anticorpos quimicamente modificados). As proteínas de superfície celular direcionadas para o isolamento de APCs incluem PDGFRα, PDGFRβ, CD34 e SCA-1. Essas abordagens ajudaram a enriquecer os APCs; no entanto, as populações de células isoladas com base nesses marcadores são bastante heterogêneas. Estudos muito recentes de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) destacaram a heterogeneidade molecular e funcional das células estromais dentro da fração estromal-vascular isolada (SVF) do WAT murino 14,15,16,17. A partir de nosso próprio scRNA-seq e análises funcionais, identificamos e caracterizamos subpopulações de células perivasculares PDGFRβ+ imunomoduladoras e adipogênicas funcionalmente distintas no compartimento estromal do WAT intra-abdominal em camundongos adultos¹⁵. Os precursores fibroinflamatórios, ou FIPs, representam uma subpopulação proeminente de células PDGFRβ+ e podem ser isolados com base na expressão de LY6C (células LY6C+ PDGFRβ+)¹⁵. As PIF carecem de capacidade adipogênica, exercem forte resposta pró-inflamatória a vários estímulos, produzem colágeno e secretam fatores antiadipogênicos¹⁵. A atividade pró-inflamatória e fibrogênica dessas células aumenta em associação com a obesidade em camundongos, implicando essas células como reguladoras do remodelamento do WAT. A subpopulação LY6C- CD9- PDGFRβ+ representa células precursoras de adipócitos (APCs). Essas APCs são enriquecidas na expressão de Pparg e outros genes pró-adipogênicos e prontamente se diferenciam em adipócitos maduros in vitro e in vivo¹⁵. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento dessas populações de células distintas de depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos usando FACS e separação de esferas imunomagnéticas com anticorpos biotinilados. Este protocolo pode ser usado para isolar subpopulações progenitoras adiposas funcionalmente distintas de vários depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos machos e fêmeas adultos¹⁵. Estudar essas populações de células funcionalmente distintas isoladamente pode contribuir muito para nossa compreensão atual dos mecanismos moleculares que regulam a adipogênese e a remodelação do tecido adiposo intra-abdominal na saúde e na doença.

O protocolo abaixo detalha o isolamento de progenitores adiposos do WAT epididimal murino; no entanto, o mesmo procedimento pode ser usado para isolar as células correspondentes dos depósitos de WAT mesentérico e retroperitoneal de camundongos machos e fêmeas¹⁵. Um protocolo detalhado sobre como identificar e isolar esses depósitos em camundongos pode ser encontrado em Bagchi et ^al.18. Este protocolo foi otimizado para o uso de camundongos de 6 a 8 semanas de idade. A frequência e a capacidade de diferenciação das APCs podem diminuir em associação com o envelhecimento.

Protocol

Todos os protocolos e procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidados com Animais do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas.

1. Isolamento da fração vascular estromal (SVF) do tecido adiposo branco gonadal

1. Disseque o tecido adiposo branco gonadal de camundongos de 6 a 8 semanas de idade e coloque as almofadas de gordura em 1x solução de PBS.
2. Combine até 4 depósitos de gordura (recomenda-se 2-4 depósitos de 1-2 camundongos) e pique o tecido em um béquer de 10 mL contendo 200 μL de tampão de digestão (1x HBSS, 1,5% BSA e 1 mg / mL de colagenase D).
3. Transfira o tecido picado para um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 10 mL de tampão de digestão.
4. Incubar a mistura a 37 °C em banho-maria durante 1 h agitando.
5. Filtrar o tecido digerido através de um filtro de células de 100 μm para remover o tecido não digerido.
6. Dilua a amostra filtrada para 30 mL com PBS contendo 2% de FBS e centrifugue a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante, que contém adipócitos maduros.
7. Prossiga imediatamente para o método de isolamento celular preferido.

2. Isolamento de APCs e FIPs usando FACS

1. Dissolva o pellet em 1 mL de tampão de lise de 1x eritrócitos agitando o tubo suavemente.
2. Incubar em RT por 1-2 min.
3. Adicione 10 mL de 2% de FBS / PBS e passe por um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga limpo de 50 mL.
4. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Aspire o meio e ressuspenda o pellet em 400-800 μL de 2% de FBS / PBS contendo bloco Fc (1:200).
6. Incubar a 4 °C durante 10 min.
7. Transfira 400 μL-800 μL de suspensões celulares contendo ≤10⁶ células por mL para tubos de 1,5 mL e adicione anticorpos. As concentrações de anticorpos estão listadas na seção Tabela de Materiais .
   1. Prepare tubos de controle separados para 1) células não coradas, 2) controles de cor única e 3) controles FMO (fluorescência menos um).
   2. Corar as amostras com anticorpos PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.
8. Incubar a 4 °C durante 15 min protegido da luz.
9. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
10. Aspire o meio e ressuspenda as células em 400 μL de 2% de FBS / PBS.
11. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
12. Aspire o meio e ressuspenda as células em 400-800 μL de 2% de FBS / PBS. Em seguida, passe por tampas de filtro de 40 μm em tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL para FACS.
13. Siga as etapas a seguir para fechar.
    1. Use controles sem coloração e de cor única para compensação.
    2. Use os controles FMO para definir portas experimentais.
    3. Use a estratégia de gating mostrada na Figura 1 para obter APCs e FIPs. APCs de porta como células CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C^- CD9^- e FIPs como células CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C⁺ .
14. Colete as células classificadas em tubos contendo 500 μL de soro 100% e mantenha as células no gelo.
15. Centrifugar as células a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Adicione 2% de FBS / PBS para lavar as células centrifugando novamente a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante e utilizar as células peletizadas.
16. Ressuspenda as células peletizadas no volume apropriado de meio de cultura APC gonadal (para cultura de células) ou tampão apropriado para análise subsequente.

3. Separação imunomagnética de frações adipogênicas e não adipogênicas

1. Isole o SVF do tecido adiposo branco gonadal seguindo as etapas 1.1-1.7.
2. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet SVF em 10 mL de 1x tampão MS disponível comercialmente.
3. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 40 μm.
4. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células peletizadas em 100 μL de 1x MS Buffer.
6. Realize a depleção de células CD31⁺ e CD45⁺ conforme discutido abaixo (Figura 2A, Etapa 1). Isso é feito para remover células de linhagem endotelial e hematopoiética.
   1. Conte as células usando um contador de células e ajuste a concentração para ≤ 1 x 10⁸ células / mL.
   2. Adicione os anticorpos CD31 e CD45 conjugados com biotina à suspensão celular, cada um na concentração de ≤ 0,25 μg por 10⁶ células e incube em gelo por 15 min.
   3. Lave as células adicionando 4 mL de 1x MS Buffer.
   4. Centrifugue a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 100 μL de tampão 1x MS.
   6. Adicione 10 μL de nanoesferas de estreptavidina e incube as células no gelo por 15 min.
   7. Lave as células adicionando 4 mL de tampão 1x MS.
   8. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C e, em seguida, aspirar o sobrenadante.
   9. Ressuspenda as células em 2,5 mL de tampão 1x MS e transfira para um tubo de polipropileno de 5 mL.
   10. Coloque o tubo no suporte magnético por 5 min.
   11. Colete células não marcadas despejando a suspensão celular em um tubo de centrífuga limpo de 15 mL.
       NOTA: Evite sacudir ou enxugar as gotículas pendentes, pois isso leva à contaminação por uma fração celular indesejada.
   12. Remova o tubo do ímã e repita as etapas 3.6.9. ao ponto 3.6.11. mais duas vezes para um total de 3 lavagens.
7. Separação das fracções adipogénicas e não adipogénicas (figura 2A, passo 2)
   1. Continue trabalhando com fração não rotulada (ou seja, fração CD45-CD31^-).
   2. Centrifugue o tubo de 15 ml contendo células não marcadas a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
   3. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão 1x MS.
   4. Adicione anticorpos LY6C e CD9 conjugados com biotina, respectivamente, a uma concentração de ≤ 0,25 μg por 10⁶ células e incube em gelo por 15 min.
   5. Siga as etapas 3.6.3. para 3.6.12. para completar a segunda separação.
   6. Colete frações não ligadas. Células não marcadas (LY6C-CD9^-) representam fração adipogênica contendo APCs (Figura 2A, Etapa 3).
   7. Remova o tubo do ímã, ressuspenda e elua as células ligadas em 1x tampão MS. Eluatos ou fração marcada (LY6C⁺ CD9⁺), representa fração não adipogênica contendo FIPs (Figura 2A, Etapa 3).
   8. Centrifugar fracções marcadas e não marcadas a 600 x g durante 5 min para granular células a 4 °C.
8. Proceder imediatamente à cultura de células (etapa 6) ou utilizar precursores indiferenciados para as análises preferidas (etapa 4 e/ou etapa 5).

4. Avaliar a pureza das frações adipogénicas e não adipogénicas por citometria de fluxo

1. Ressuspenda frações de células isoladas em 200-400 μL de 2% de FBS / PBS contendo bloco Fc (1: 200).
2. Incubar a 4 °C durante 10 min.
3. Transfira a suspensão celular para tubos de 1,5 mL e adicione anticorpos. As concentrações de anticorpos estão listadas na Tabela de Materiais.
   1. Prepare tubos de controle separados para 1) células não coradas, 2) controles de cor única e 3) controles FMO.
   2. Às amostras, adicione os anticorpos CD45, CD31, CD9 e LY6C.
4. Incubar a 4 °C durante 15 min protegido da luz.
5. Centrifugar a 600 x g durante 5 minutos a 4 °C.
6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 400 μL de 2% de FBS / PBS.
7. Centrifugue a suspensão a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
8. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 400-800 μL de 2% FBS / PBS. Filtre através de tampas de filtro de 40 μm em tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL para análise por citometria de fluxo.
9. Análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza
   1. Use controles sem coloração e de cor única para compensação.
   2. Use os controles FMO para definir portas experimentais.
   3. Use a estratégia de gating para células ativas e únicas, conforme mostrado na Figura 2B.
   4. Execute o gating conforme mostrado na Figura 2B para CD45, CD31, LY6C e CD9.
   5. Use o software de citometria de fluxo para avaliar as frequências das células CD45^- CD31^- LY6C^- CD9^- (APCs) e células CD45^- CD31^- LY6C⁺ (FIPs) dentro de frações isoladas.

5. Análise de expressão gênica usando PCR quantitativo para avaliar a pureza de FIPs e APCs

1. Extraia o mRNA de células isoladas magneticamente ou FACS usando o kit de extração disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
2. Use 1 μg de RNA para sintetizar o cDNA usando um kit de transcriptase reversa de cDNA (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
3. Determine os níveis relativos de mRNA de genes seletivos de APC e FIPs (Tabela 1) por PCR quantitativo usando SYBR green PCR master mix.
   1. Configure a reação da amostra para PCR da seguinte forma: 5 μL de corante verde 2x SYBR, 1 μL de cDNA (~ 50 ng / μL), 0,5 μL de cada primer direto e reverso (10 μM) e 3 μL de água.
   2. Use as seguintes condições de PCR padrão para a execução de PCR quantitativa: estágio de espera: 50 °C por 2 min, 95 °C por 10 min; Estágio de PCR (40 ciclos): 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min.
4. Normalize os valores para os níveis do gene de manutenção da casa (Rps18) calculando ΔΔ-Ct.
5. Para avaliar a significância estatística, realizar o teste t de Student não pareado.

6. Cultura e diferenciação celular

1. Centrifugar células isoladas magneticamente ou FACS a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
2. Ressuspenda o pellet em 500 μL de meio de cultura APC gonadal e coloque 40K células/poço de cada fração em uma placa de cultura de 48 poços.
3. Substitua a mídia a cada 1-2 dias. As APCs começarão a sofrer diferenciação em adipócitos à medida que se aproximam da confluência. As PIFs mantidas no mesmo meio são resistentes à adipogênese.

Results

Este protocolo descreve duas estratégias que permitem o isolamento de populações distintas de células estromais de depósitos intra-abdominais de WAT de camundongos adultos. APCs e FIPs podem ser isolados por FACS (Figura 1) ou separação imunomagnética de esferas com anticorpos biotinilados (Figura 2). Ambas as abordagens utilizam reagentes e anticorpos que estão disponíveis comercialmente. A separação imunomagnética do grânulo leva à separação de células adipogê...

Discussion

A cepa de camundongos C57BL/6 é a cepa de camundongo mais usada em estudos de obesidade induzida por dieta. Camundongos C57BL/6 ganham peso rapidamente quando colocados em uma dieta rica em gordura (HFD) e desenvolvem algumas das características proeminentes da síndrome metabólica associada à obesidade (por exemplo, resistência à insulina e hiperlipidemia). Notavelmente, a expansão do WAT que ocorre em associação com a alimentação com dieta rica em gordura (HFD) ocorre de maneira específica do depósito 19,20,21,22,23.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparação Mecânica de Tecidos e Isolamento SVF
40 e 100 µ filtros de células m	Fisher Scientific	352340/352360
1X solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Fisher Scientific	21040CV
tubos de polipropileno de 5ml	Tampão	Fisher Scientific 352053
Digestion Buffer (para 10mL)
10 ml HBSS	Sigma	H8264
10 mg de colagenase D (1 mg/ml cc final)	Roche	11088882001
0,15 g de BSA (1,5% cc final)	Fisher Scientific	BP1605-100
Immunomagnetic separação de APCs e não-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)	BioLegend	480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)	BioLegend	480019
100 µ L MojoSort Streptavidin Nanobeads	BioLegend	480015
Verificação de Pureza e FACS
10X Tampão de Lise de Glóbulos Vermelhos	eBioscience	00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)	eBioscience	553141
Anticorpos
Biotina CD45	BioLegend	103103	Concentração: ≤ 0,25 µ g por 10 ^ 6 células Espécie: Mouse Clone: 30-F11
Biotina CD31	BioLegend	102503	Concentração: ≤ 0,25 µ g por 10^6 células Espécie: Mouse Clone: MEC13.3
Biotina CD9	BioLegend	124803	Concentração: ≤ 0.25 µ g por 10^6 células Espécie: Mouse Clone: MZ3
Biotina LY6C	BioLegend	128003	Concentração: ≤ 0,25 µ g por 10^6 células Espécie: Mouse Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5	BioLegend	102419	Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5	BioLegend	103131	Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PE	BioLegend	136006	Concentração: Diluição 1:50 Espécie: Mouse Clone: APB5
LY6C-APC	BioLegend	128016	Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: HK1.4
CD9-FITC	BioLegend	124808	Concentração: Diluição 1:400 Espécie: Mouse Clone: MZ3
Cultura de células e Diferenciação
Gonadal APC Meios de cultura (para 500mL)
288 mL DMEM com 1 g/L de glicose	Corning	10-014-CV
192 mL MCDB201	Sigma	M6770
10 mL Soro fetal bovino (FBS)** lote#14E024	Sigma	12303C
5 mL 100% ITS premix	BD Bioscience	354352
5 mL 10 mM L-ácido ascórbico-2-2fosfato	Sigma	A8960-5G
50 µ L 100 g/ml FGF-básico	R& D systems	3139-FB-025/CF
5 mL Pen/Strep	Corning	30-001-CI
500 µ L Gentamycin	Gibco	15750-060
**NOTA: A capacidade adipogênica dos APCs primários pode variar de lote para lote de FBS comercial. Vários lotes/fontes de FBS devem ser testados.