Investigando a função do gene alvo em um modelo de colite induzida por anticorpos agonísticos CD40 usando tecnologias baseadas em CRISPR/Cas9

Resumo

Aqui, descrevemos a metodologia para eliminar um gene de interesse no sistema imunológico usando tecnologias baseadas em repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) / endonuclease associada a CRISPR (Cas9) e a avaliação desses camundongos em um modelo de colite induzida por anticorpos agonísticos de cluster de diferenciação 40 (CD40).

Resumo

O sistema imunológico funciona para defender os humanos contra invasores estranhos, como bactérias e vírus. No entanto, distúrbios do sistema imunológico podem levar à autoimunidade, doenças inflamatórias e câncer. As doenças inflamatórias intestinais (DII) - doença de Crohn (DC) e colite ulcerativa (UC) - são doenças crônicas marcadas por inflamação intestinal recorrente. Embora a DII seja mais prevalente nos países ocidentais (1 em 1.000), as taxas de incidência estão aumentando em todo o mundo. Por meio de estudos de associação, os pesquisadores ligaram centenas de genes à patologia da DII. No entanto, a patologia elaborada por trás da DII e o alto número de genes potenciais representam desafios significativos para encontrar os melhores alvos terapêuticos. Além disso, as ferramentas necessárias para caracterizar funcionalmente cada associação genética introduzem muitos fatores limitantes de taxa, como a geração de camundongos geneticamente modificados para cada gene. Para investigar o potencial terapêutico dos genes-alvo, um sistema modelo foi desenvolvido usando tecnologias baseadas em repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) / endonuclease associada a CRISPR (Cas9) e um anticorpo agonístico de diferenciação 40 (CD40). O presente estudo mostra que a edição mediada por CRISPR/Cas9 no sistema imunológico pode ser usada para investigar o impacto de genes in vivo. Limitada ao compartimento hematopoiético, essa abordagem edita de forma confiável o sistema imunológico reconstituído resultante. Os camundongos editados por CRISPR/Cas9 são gerados mais rapidamente e são muito mais baratos do que os camundongos geneticamente modificados tradicionais. Além disso, a edição CRISPR/Cas9 de camundongos tem vantagens científicas significativas em comparação com a geração e criação de camundongos geneticamente modificados, como a capacidade de avaliar alvos embrionários letais. Usando CD40 como alvo modelo no modelo de colite induzida por anticorpos agonísticos CD40, este estudo demonstra a viabilidade dessa abordagem.

Introdução

As doenças autoimunes referem-se a condições nas quais o sistema imunológico de um paciente ataca suas próprias células e órgãos, resultando em inflamação crônica e danos aos tecidos. Quase 100 tipos diferentes de doenças autoimunes foram descritos até o momento, afetando 3-5% da população humana¹. Muitas das condições autoimunes, incluindo lúpus eritematoso sistêmico e DII, carecem de tratamentos eficazes e apresentam necessidades médicas significativas não atendidas. Atualmente afetando cerca de 1,5 milhão de pessoas apenas nos EUA, a DII é uma doença devastadora marcada por inflamação intestinal progressiva, persistente e recidivante, sem cura disponível. Desvendar a patogênese e a fisiopatologia subjacentes é necessário para fornecer as novas estratégias de tratamento e prevenção que os pacientes com DII exigem ^2,3.

Mais de 230 loci diferentes de DII foram identificados por meio de análises de associação genômica ampla (GWAS)⁴. Embora essas associações tenham elucidado novos genes que são potencialmente importantes nos principais mecanismos e vias da DII, apenas alguns genes desses loci foram estudados. Alguns genes foram implicados em vias específicas. Por exemplo, a via de detecção de micróbios tem sido associada à proteína 2 contendo domínio de oligomerização de ligação a nucleotídeos (NOD2); a via da autofagia tem sido associada à autofagia relacionada à 16 como 1 (ATG16L1), GTPase família M relacionada à imunidade (IRGM) e membro da família do domínio de recrutamento de caspase 9 (CARD9); e a via pró-inflamatória tem sido associada a respostas de células T impulsionadas por interleucina (IL)-23⁴. Vários modelos de camundongos in vivo foram usados para caracterizar funcionalmente genes identificados por meio de GWAS ^5,6.

Um dos principais modelos usados para estudar a patogênese da DII ^7,8 é o modelo CD40 de colite, que induz inflamação intestinal imune inata após a injeção de um anticorpo agonístico CD40 em camundongos imunodeficientes (células T e B). Usado principalmente para examinar a contribuição da imunidade inata para o desenvolvimento da DII, principalmente macrófagos e células dendríticas⁹, não está claro se a doença pode ser induzida em camundongos do tipo selvagem (WT) totalmente imunocompetentes. Além dos modelos animais, ferramentas específicas de genes também são necessárias para a caracterização funcional de um gene, incluindo compostos químicos e biológicos. Mais importante, os animais geneticamente modificados são essenciais para revelar a função de um gene específico. No entanto, as estratégias normalmente usadas para fazer injeção e reprodução de embriões de camundongos geneticamente modificados geralmente levam mais de um ano e incorrem em um custo financeiro significativo. Esse processo de limitação de taxa apresenta um desafio significativo na busca para elucidar as funções dos genes relacionados à DII identificados pelo GWAS.

O protocolo aqui apresentado fornece uma alternativa viável à criação de camundongos geneticamente modificados. Primeiro, conforme mostrado no esquema da Figura 1 , as células de linhagem negativa, positivas para antígeno de células-tronco 1, positivas para receptor de tirosina quinase Kit (linhagem-Sca1 + c-Kit + ou LSK) são isoladas da medula óssea de camundongos Cas9 knockin (KI) portadores de um alelo específico (CD45.2) para permitir o rastreamento de células imunes do doador. Em seguida, essas células são expostas a lentivírus com diferentes RNAs guia (gRNAs) e um marcador fluorescente, proteína fluorescente verde excitada por violeta (VexGFP), para permitir o rastreamento de células transduzidas. Dois dias depois, as células VexGFP+ são classificadas e injetadas em camundongos Pep Boy receptores letalmente irradiados, que são camundongos C57Bl/6 portadores do alelo CD45.1 para permitir o rastreamento de células imunes do receptor. Doze semanas depois, o sistema imunológico é totalmente reconstituído e os camundongos podem ser inscritos em modelos in vivo.

Além do benefício de economia de custos e tempo de geração mais rápido em comparação com a geração e criação de animais geneticamente modificados, essa metodologia é ideal para alvos embrionários letais, pois visa especificamente o compartimento hematopoiético. Além disso, para alvos onde não há ferramentas disponíveis, como um anticorpo, este sistema fornece uma abordagem viável. Em resumo, para enfrentar os desafios descritos até agora, uma plataforma de edição de genoma baseada em CRISPR/Cas9 in vivo foi desenvolvida para gerar rapidamente modelos animais geneticamente modificados 10,11,12,13,14. Este estudo demonstra que a inflamação intestinal em camundongos WT C57Bl / 6 pode ser induzida por um anticorpo agonístico CD40. O CD40 é um regulador chave da doença neste modelo e, portanto, foi usado como um alvo modelo para validar o nocaute baseado em CRISPR / Cas9 e a perda da função do gene.

Protocolo

Todos os experimentos com animais realizados seguindo este protocolo devem ser aprovados pelo respectivo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pela AbbVie IACUC.

1. Geração de lentivírus necessários e colheita de animais doadores e receptores

NOTA: A Tabela de Materiais inclui detalhes de origem e número de pedido para todos os animais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Construa os plasmídeos usando um vetor lentiGuide-puro modificado para VexGFP ou mCherry.
   1. Clone o gRNA não direcionado embaralhado (SgNone) ou o gRNA direcionado a CD40 no vetor modificado.
      NOTA: Neste estudo, as sequências para cada gRNA foram as seguintes: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; e SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Produzir as partículas lentivirais conforme descrito anteriormente¹⁵.
      1. Co-transfectar os plasmídeos codificadores de gRNA em células 293T com plasmídeos de empacotamento VSV-G e pLEX.
      2. Troque o meio de cultura após 18 h de transfecção e colete os sobrenadantes contendo o vírus após 24-48 h após a troca do meio.
      3. Para avaliar a eficiência do gRNA CD40, gere uma linhagem celular 293T estável de CD40 por transfecção de um plasmídeo pcDNA3.1 que codifica para CD40.
   3. Transfectar as células usando os lentivírus descritos e avaliá-las por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) duas semanas depois.
      NOTA: Camundongos Cas9 KI foram usados como camundongos doadores. Certifique-se de que os camundongos Cas9 KI estejam em um fundo C57Bl/6 (e expressando o alelo CD45.2) ao usar camundongos C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy (expressando o alelo CD45.1) como receptores, para que a GvHD seja evitada e rastreie as células doadoras e receptoras.
2. Projete o experimento. Para nocaute genético (KO), use 3-6 gRNAs por gene. Para cada gRNA, prepare 20% de camundongos receptores extras para contabilizar a perda de animais durante e após o transplante.
   NOTA: O modelo de colite induzida por anticorpos agonísticos CD40 requer um mínimo de 8 camundongos por grupo para alimentação estatística. Assim, 10 camundongos por gRNA foram preparados neste estudo. O número de mouses necessários para outros modelos in vivo varia de acordo com o modelo usado.
3. Use camundongos doadores e receptores do mesmo sexo com 8 a 12 semanas de idade.
   NOTA: Os camundongos foram sacrificados de acordo com as diretrizes aprovadas pela IACUC usando um mínimo de 5% de isoflurano e confirmados com luxação cervical como método secundário.

2. Colheita de medula óssea e preparação para triagem celular

1. Usando fórceps e tesouras, colha ossos de cada camundongo doador (fêmur, tíbia, úmero e ulna), removendo cuidadosamente o máximo de músculo / tecido possível.
2. Perfure o fundo de um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL com uma agulha de 23 G e coloque o tubo dentro de um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Faça 2 séries por animal.
3. Corte uma extremidade dos ossos e coloque 4-8 ossos dentro do tubo de microcentrífuga com as extremidades abertas voltadas para o orifício da agulha de 23 G.
   NOTA: O número de ossos por tubo depende do osso, por exemplo, 8 tíbias, úmeros e ulnas ou 4 fêmures cabem.
4. Centrifugue os tubos (com o tubo de microcentrífuga de 0,6 mL contendo os ossos dentro do tubo de centrífuga de 1,5 mL) a 300 × g por 2 min à temperatura ambiente (RT).
5. Descarte o tubo de microcentrífuga de 0,6 mL, agora contendo ossos sem medula, deixando apenas o tubo de centrífuga de 1,5 mL agora cheio de medula. Adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (contendo cloreto de amônio) a cada tubo de centrífuga e ressuspenda o pellet celular por pipetagem. Incubar em RT por 1 min. Repita a etapa de lise, se necessário.
6. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e adicione solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) sem cálcio e magnésio (pelo menos o dobro do volume da suspensão celular) para neutralizar o tampão de lise. Células de pellets a 300 × g por 5 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
7. Carregue um filtro de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL e filtre as células, usando DPBS para lavar o tubo e o filtro. Descarte o filtro e conte as células.
   NOTA: O uso de 30 camundongos doadores (12 semanas de idade) produzirá 200-300 × 10⁶ células em média.

3. Classificação de células para isolar células LSK para transdução

1. Ressuspenda as células contadas na etapa 2.7 em tampão de classificação magnética de células (MACS) (DPBS, ácido etilenodiamina tetracético 2 mM, albumina sérica bovina a 0,5%, 10 μg / mL de penicilina-estreptomicina) no volume desejado (90 μL por 10⁷ células).
2. Adicione 10 μL de grânulos CD117+ por 10⁷ células. Misture bem, proteja da luz e incube a 4 °C por 15 min.
3. Prepare a coluna MACS LS colocando-a no campo magnético e enxaguando-a com tampão MACS.
4. Lave as células da etapa 3.2 com um volume apropriado de tampão MACS (pelo menos o dobro do seu volume) e centrifugue a 300 × g por 10 min.
5. Aspirar completamente o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de modo que a concentração final seja de 10^{a 8} células em 500 μL de tampão MACS.
6. Aplique a suspensão da célula na coluna LS. Lavar com 3 vezes com 3 ml de tampão MACS.
   NOTA: Uma coluna LS pode ocupar até 10⁸ células rotuladas e 2 × 10⁹ células no total.
7. Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um tubo de coleta adequado. Adicione 5 mL de tampão MACS e lave imediatamente as células marcadas magneticamente empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.
8. Pulverize as células a 300 × g por 10 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
9. Ressuspenda as células em 100 μL de tampão MACS por 10⁷ células e adicione os anticorpos de coloração para linhagem (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) e Sca-1.
   NOTA: O uso de 30 camundongos doadores (12 semanas de idade) produzirá 100-180 × 10⁶ células em média.
10. Misture bem, proteja da luz e incube a 4 °C por 20 min.
11. Lave as células adicionando 5-10 mL de tampão MACS e centrifugue a 300 × g por 10 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
12. Ressuspenda até 10⁸ células em 500 μL de tampão MACS
13. Filtre as células com um filtro de células de 70 μm e execute FACS para a população de linhagem Sca1+.
    NOTA: Aproximadamente 1,8-2,6% da população deve ser linhagem-Sca1+.
14. Colete as células em meio de cultura LSK (100 μL por 10.000 células): meio de expansão sem soro, 100 ng/mL de trombopoietina, fator de células-tronco de camundongo, ligante tirosina quinase 3 relacionado a Fms e IL-7 com 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina.
15. Células de pellets a 300 × g por 10 min. Aspirar completamente o sobrenadante.

4. Transdução e cultura de LSK para gerar células de controle e nocaute

1. Ressuspenda as células em meio de cultura LSK.
2. Semeie 10.000 células por poço em placas de cultura de tecidos (TC) de fundo plano de 96 poços em meio de cultura LSK.
3. Incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂ e 95% de humidade em condições assépticas.
4. Prepare 50 μg / mL de solução de retronectina em DPBS e adicione 300 μL a cada poço de uma placa de poliestireno de 24 poços não tratada com TC. Incubar durante a noite a 4 °C.
5. No dia seguinte, descarte a solução de retronectina, enxágue a placa revestida com 300 μL de DPBS e repita.
6. Transfira 50.000 células LSK em 500 μL de meio (5 poços da placa de 96 poços na etapa 4.2) para cada poço revestido com retronectina da placa de poliestireno de 24 poços da etapa 4.4.Use 100 μL adicionais de meio LSK por 5 poços para enxaguar e coletar quaisquer células extras restantes na placa de 96 poços. Certifique-se de que 600 μL é o volume por alvéolo na placa de 24 poços após esta etapa (5 × 100 μL de poços da placa de 96 poços + 100 μL usados para lavar esses 5 poços).
   NOTA: Após a transferência, olhe ao microscópio para a placa de 24 poços agora vazia para confirmar se todas as células foram coletadas. Use o meio LSK para coletar células que não foram transferidas para minimizar a perda celular dessa pequena população.
7. Adicione 300 μL de sobrenadante de vírus a cada poço e agite a placa a um valor de ajuste de 500 por 5 min. Girar a placa a 600 × g e 37 °C durante 20 min. Use pelo menos 5 × 10⁶ partículas virais por mL.
   NOTA: Neste estudo, foi utilizado um vetor modificado do pLentiPuro, no qual o elemento de resistência à puromicina foi trocado por VexGFP. O vírus foi adicionado a uma multiplicidade de infecção de 50-100.
8. Incubar por 1 h. Adicione 500 μL de meio LSK pré-aquecido.
9. Incubar durante 2 dias a 37 °C com 5% de CO₂ e 95% de humidade em condições assépticas.

5. Irradiação animal para se preparar para o enxerto de células-tronco do doador

1. Após 2 dias de incubação, irradiar os animais receptores com 475 cGy duas vezes em um intervalo de 4 h. Após a segunda rodada de irradiação, coloque os animais em gaiolas autoclavadas e trate-os como animais imunodeficientes por 12 semanas. Os camundongos receberam enriquecimento, hidrogel e monitoramento lateral da gaiola para fornecer cuidados de suporte e intervenção conforme necessário. Os camundongos podem receber alimentos antibióticos ou água, além de cuidados de suporte e métodos de intervenção.
   NOTA. As dosagens de irradiação podem diferir com diferentes irradiadores. Realize uma titulação da dose do irradiador para identificar a melhor dosagem. Doses entre 700 e 1300 cGy para camundongos C57Bl/6 são consideradas eficazes em vários exemplos da literatura¹⁷. Selecione 3-4 doses neste intervalo e avalie 5 camundongos por dose para sobrevivência e enxerto. Se o enxerto não for bem-sucedido ou a dose de radiação for muito alta, os camundongos não viverão mais de 3 semanas após o enxerto. Às 4 semanas após o enxerto, sangrar os camundongos sobreviventes para avaliar o enxerto por FACS. Realizamos coletas de sangue retro-orbital (RO) de ~ 50-100 μL por camundongo para avaliar o enxerto. Os camundongos estavam sob anestesia (2-3% de isoflurano) durante a coleta e receberam lubrificante ocular e 1,0 mL de solução salina subcutânea como cuidados de suporte após as coletas de sangue de RO.

6. Preparação e injecção de células em animais receptores irradiados

1. Pipetar as células de cada poço a partir da etapa 4.9, mantendo os grupos separados agora que as células foram transduzidas com diferentes gRNAs, e pellet-as a 300 × g por 10 min.
2. Ressuspenda as células no tampão MACS, filtre com um filtro de 70 μm e classifique a população VexGFP+.
   NOTA: Aproximadamente 10-15% das células devem ser VexGFP+.
3. Pulverize as células a 300 × g por 10 min. Ressuspenda-os na solução salina balanceada de Hank: 5.000 ou mais células por camundongo em 200 μL.
   NOTA: O HBSS é de grau não farmacêutico. Você também pode considerar o uso de uma solução salina estéril de grau farmacêutico para injeção.
4. Injete as células por via intravenosa 3 h após a última dose de irradiação.
   NOTA: Doze semanas depois, os camundongos terão um sistema imunológico totalmente enxertado e poderão ser inscritos em modelos in vivo.

7. Modelo de colite induzida por anticorpos agonísticos CD40 em camundongos selvagens

NOTA: Pese e avalie os animais diariamente. Forneça cuidados de suporte conforme necessário: 1,0 mL de solução subcutânea de cloreto de sódio com perda de peso a 10% ou se estiverem desidratados. O controle positivo para este modelo é o anti-p40 administrado por via intraperitoneal a 25 mg / kg duas vezes por semana, começando no dia -1.

NOTA: Neste estudo, os grupos experimentais incluíram controle ingênuo, controle veicular (negativo) e controle anti-p40 (positivo). Juntos, esses grupos controlam o comportamento normal do modelo de colite induzida por anticorpos agonísticos CD40. Grupos vetorial, SgNone e SgRNA: Os controles vetoriais para o vetor lentiviral comum, SgNone é um controle guia não direcionado embaralhado, e os grupos SgRNA são os grupos de "tratamento" com expressão reduzida do gRNA alvo.

1. Dia 0: Injetar anticorpo agonístico CD40 a 10 mg/kg por via intraperitoneal na sapb em todos os animais, exceto no controlo sem tratamento.
2. Dias 3 e 6: Realizar videoendoscopia para avaliar a progressão da doença conforme descrito anteriormente¹⁶.
   1. Anestesiar os camundongos com 2-3% de isoflurano. Forneça suporte térmico por meio do mecanismo interno da máquina de anestesia e/ou almofada térmica externa durante a recuperação.
   2. Assim que os camundongos estiverem sob anestesia, administre um enema de DPBS (sem cálcio e magnésio) para preparar o cólon para endoscopia.
      NOTA: Aproximadamente 1-2 mL são necessários para realizar um enema.
   3. Após um enema e sob anestesia, mova o mouse para o cone do nariz da máquina de anestesia.
   4. Insira suavemente o endoscópio no cólon, avance lentamente para o cólon proximal enquanto mantém a câmera centralizada e o cólon inflado com ar (usando a bomba de ar incluída ou conecte um tubo/seringa para inflar manualmente) e, em seguida, retire lentamente o endoscópio e colete um vídeo e imagens a 3 cm, 2 cm e 1 cm do ânus.
      NOTA: Para minimizar a irritação do cólon, lubrificante estéril pode ser adicionado à ponta do endoscópio.
   5. Pontuar cada imagem individualmente com base no padrão vascular e espessamento da mucosa, conforme descrito na Tabela 1. Combine as pontuações das 3 imagens por rato para atribuir uma pontuação de soma a cada animal.
3. Dia 7: Eutanásia de todos os camundongos por overdose de isoflurano ou câmara de CO₂ e colete o máximo de sangue possível por punção cardíaca para soro. Pesar o baço para medir a esplenomegalia e coletar para citometria de fluxo e coletar o cólon para histopatologia.
   NOTA: Seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina do cólon de camundongos foram preparadas e usadas para imuno-histoquímica (IHQ), conforme descrito anteriormente por Wang et al¹⁹.

Resultados

Seguindo o procedimento descrito acima, camundongos expressando gRNA direcionado a CD40 foram gerados. Na semana 2, células B, macrófagos CD11b+ e células dendríticas CD11c+ (DCs) foram enxertadas (Figura 2). As células T, no entanto, como esperado com base na literatura anterior¹⁸, levaram mais tempo para enxertar completamente e exigiram 12 semanas após o enxerto para atingir ~ 90% (Figura 2). Órgãos imu...

Discussão

Os resultados mostrados aqui apresentam uma nova plataforma de edição de genoma baseada em CRISPR / Cas9 capaz de investigar a função do gene neste modelo de colite induzida por anticorpos agonísticos CD40. A classificação de células enriqueceu o conjunto de células LSK geneticamente modificadas, resultando em mais de 90% de redução na expressão de CD40 nos animais reconstituídos - em apenas 4 meses. Além disso, a expressão reduzida de CD40 no sistema imunológico teve um efeito profundo ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de cultura de tecidos de 6 poços	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µ unidade de filtro m	Millipore	#SLHV013SL
tubo de microcentrífuga de 0,6 mL Axygen		MCT-060-C-S
1,5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL cônico	VWR	21008-918
23 G Agulha	VWR	#305145
24 poços placas não-TC	Falcon	#351147
Placas TC de 24 poços	Falcon	#353047
Tubo cônico de 50 mL	VWR	21008-951
Seringa de 5 mL	BD Biosciences	#309647
70 µ m Filtro	Miltenyi	#130-098-462
Placas de fundo plano de 96 poços	Corning	#3599
Placas de fundo em U de 96 poços	Corning/Costar	#3365
VetEquip - COMPAC5	#901812
Anticorpo monoclonal anti-CD40 Agonista	BioXcell	BE-0016
Anticorpo monoclonal anti-p40	BioXcell	BE-0051
B220 PE Anticorpo	BioLegend	#103208
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Camundongos	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 fundo
CD117+ Grânulos	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Anticorpo	BioLegend	#101208
CD3 PE Anticorpo	BD Biosciences	# 553240
Centrífuga	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrífuga
bancada Centrífuga	Eppendorf	5424
DPBS	ThermoFisher	# 14190136
Dulbecco ' s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ácido etilenodiamina tetracético (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscópio	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Citômetro de fluxo	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tirosina quinase 3 ligante (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Anticorpo	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Soro bovino fetal inativado por calor	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 fator
células-tronco de camundongo de fundo (mSCF)	PeproTech	#250-03
Cloreto de sódio (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM mídia sem soro	Invitrogen	#31985-070
Penicilina-estreptomicina (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Agitador de Placas	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µ g/µ L)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	eBioscience	#00-4333
Retronectina	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Anticorpo	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Anticorpo	eBioscience	#12-5921
Trombopoietina (TPO)	PeproTech	#315-14
Irradiador de Raios-X	de Precisão Raio-X X-Rad	320