Relatado aqui é um sistema de imagem de cálcio em se comportar livremente Caenorhabditis elegans com vibração bem controlada e não localizada. Este sistema permite que os pesquisadores evoquem vibrações não localizadas com propriedades bem controladas no deslocamento em nanoescala e quantifiquem as correntes de cálcio durante as respostas de C. elegans às vibrações.
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Artigo de método
Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Forças mecânicas não localizadas, como vibrações e ondas acústicas, influenciam uma grande variedade de processos biológicos, desde o desenvolvimento até a homeostase. Os animais lidam com esses estímulos modificando seu comportamento. Compreender os mecanismos subjacentes a tal modificação comportamental requer quantificação da atividade neural durante o comportamento de interesse. Aqui, relatamos um método de imagem de cálcio em se comportar livremente caenorhabditis elegans com vibração não localizada de frequência, deslocamento e duração específicas. Este método permite a produção de vibração bem controlada e não localizada usando um transdutor acústico e quantificação de respostas de cálcio evocadas na resolução unicelular. Como prova de princípio, demonstra-se a resposta de cálcio de um único interneuron, AVA, durante a resposta de fuga de C. elegans à vibração. Este sistema facilitará a compreensão dos mecanismos neurais subjacentes às respostas comportamentais a estímulos mecânicos.
Introdução
Os animais são frequentemente expostos a estímulos mecânicos não localizados, como vibrações ou ondas acústicas 1,2. Como esses estímulos influenciam a homeostase, o desenvolvimento e a reprodução, os animais devem modificar seus comportamentos para lidar com eles 3,4,5. No entanto, os circuitos neurais e os mecanismos subjacentes a essa modificação comportamental são mal compreendidos.
O comportamento mecanosensorial no nematoide, Caenorhabditis elegans, é um simples paradigma comportamental, no qual os vermes geralmente mudam o comportamento do movimento para a frente para uma resposta de fuga para trás quando encontram vibração não localizada6. O circuito neural subjacente a esse comportamento é composto principalmente por cinco neurônios sensoriais, quatro pares de interneurônios e vários tipos de neurônios motores 7,8. Além disso, os vermes habituam-se a tais estímulos mecânicos após o treinamento espaçado envolvendo estimulação repetida 9,10,11. Portanto, essa simples resposta comportamental constitui um sistema ideal para investigar mecanismos neurais subjacentes tanto ao comportamento e à memória não localizados de vibração. Um protocolo para imagens de cálcio em vermes que se comportam livremente sob a influência de vibrações não localizadas é ilustrado. Comparado com sistemas relatados anteriormente, este sistema é simples na forma de não exigir uma câmera adicional para rastreamento; no entanto, permite-nos alterar a frequência, deslocamento e duração da vibração não localizada. Como a ativação dos interneurônios AVA induz a resposta de fuga para trás, os vermes co-expressando GCaMP, um indicador de cálcio, e TagRFP, uma proteína fluorescente insensível ao cálcio, sob o controle de um promotor específico da AVA foram usados como exemplo (ver Tabela de Materiais para detalhes). O protocolo demonstra a ativação dos neurônios AVA à medida que um verme muda de movimento para frente para trás. Este protocolo facilita a compreensão do mecanismo do circuito neural subjacente ao comportamento mecanosensorial.
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Protocolo
1. Cultivo de vermes até a imagem de cálcio
- Quatro dias antes de um experimento de imagem de cálcio, transfira dois vermes ST12 adultos para uma nova placa de crescimento de nematoides (NGM) na qual escherichia coli OP50 são listrados em um padrão quadrado (aproximadamente 4 mm x 4 mm) usando um espalhador celular para que o verme passe a maior parte do tempo na bactéria durante a imagem de cálcio12.
- Incubar esta placa NGM por 4 dias a 20 °C em uma incubadora (Tabela de Materiais).
2. Configuração de hardware
- Prepare um microscópio equipado com um dispositivo piezoelétrico para estimulação13, uma lente objetiva de 2x, uma câmera sCMOS de alta velocidade, óptica de divisão de imagem, um estágio motorizado x-y, uma fonte de luz LED para excitação e um computador (Figura 1). As especificações essenciais da câmera sCMOS incluem 2560 x 2160 pixels ativos, 6,5 μm de tamanho, com um link de câmera de 10 toques como opção de interface. As principais especificações do estágio motorizado X-Y incluem 110 mm x 75 mm de alcance de viagem, velocidade máxima de 250 mm/s, aceleração máxima de 2.000 mm/s2 e repetibilidade unidirecional de 0,25 μm.
- Ligue o computador e o controlador de estágio motorizado x-y.
- Ligue o amplificador e ajuste o ajustador de volume para 10 e os ajustadores Bass e Treble para 8.
- Para excitar GCaMP e TagRFP, ligue as luzes de 488 nm e 560 nm da fonte de luz LED. Coloque os medidores de 470 nm e 550 nm da cápsula de controle na fonte de luz até 5% para que a intensidade da luz LED seja adequada para a imagem.
NOTA: Nesta intensidade de LED, o fotobleaching da fluorescência GCaMP e TagRFP não ocorre durante a gravação.
3. Configuração de software para imagem de cálcio
- Baixe e instale três pacotes de software no Windows: software de macro do mouse, software para controle de propriedade de vibração, software para execução de software de rastreamento e software para análise de dados (Tabela de Materiais).
- Clique duas vezes no arquivo do software de rastreamento.
- Pressione o botão Executar e aguarde por 5 minutos para estabilizar o software (Figura 2A).
- Forneça informações sobre o tempo de exposição e binning. O tempo de exposição de 0,033 com binning 2 x 2 garante uma aquisição suave de imagem (Figura 2B).
NOTA: Somente a cada 10imagens adquiridas é exibida para reduzir a carga de memória. - Fornecer as informações para aquisição de imagens (Figura 2C). Por exemplo, quando 500 imagens são gravadas duas vezes com um intervalo de 10 s, digite 1.000 na caixa Images Total, 500 na caixa Imagens e 10 na caixa Intervalo (s).
- Ligue o botão Aquisição (Figura 2D).
- Divida a imagem de fluorescência usando óptica de divisão de imagens, e as duas imagens (canal GCaMP, 500-525 nm (Figura 2E); O canal TagRFP, 584-676 nm (Figura 2F)) são projetados em duas metades da câmera sCMOS. Calibrar as coordenadas dos canais GCaMP e TagRFP (Figura 2G). Salve as configurações do software.
- Defina o diretório para a saída do arquivo de dados (Figura 2H).
- Desligue o botão Aquisição (Figura 2D).
- Clique duas vezes no software do sistema de macro do mouse (Figura 3A) e defina as propriedades de vibração (Figura 3B). Leia o arquivo Assay.txt com o sistema de macro do mouse para que o cursor do mouse seja controlado com base nas coordenadas e no cronograma desse arquivo (Figura 3A). Defina as coordenadas do cursor do mouse (quadrados magenta na Figura 3A) e espere tempo até a estimulação após iniciar a gravação (magenta na Figura 3A). Defina a frequência e os valores de amplitude no software para controle de vibração (Figura 3B).
4. Preparação de vermes para imagem de cálcio
- Transfira um único worm expressando gcamp e tagrfp da placa incubada para uma nova placa NGM fresca na qual E. coli OP50 foi listrado.
- Conecte a placa NGM ao transdutor acústico piezoelétrico usando fita adesiva transparente (Figura 4). Não pressione a placa sobre o atuador porque isso altera a frequência de vibração.
5. Imagem de cálcio sob o controle de propriedades de vibração específicas
- Ligue o botão Aquisição (Figura 2D).
- Encontre o verme sob luz brilhante e luz de excitação (488 nm e 560 nm).
- Defina o valor de zoom da microscopia para 2,5x. O campo de visão é de 1,1 mm x 1,1 mm com resolução de 2,6 μm/pixel.
- Desligue a luz brilhante e ligue o botão Homing (Figura 2I) para rastrear o ponto fluorescente de um worm. Este botão de ving inicia o movimento do estágio X-Y para manter a região de intensidade máxima do worm no meio do campo de visão na imagem TagRFP.
NOTA: Em termos do promotor flp-18 , a intensidade fluorescente dos neurônios AVA é mais forte e os de outros neurônios são fracos ou não detectados. Portanto, o sistema de baixa ampliação não é necessário para o rastreamento e o estágio se move ao longo da gravação. - Certifique-se de que os valores das barras de intensidade nas Figuras 2E e 2F são aproximadamente 1.000. Se não estiverem, ajuste os medidores de 470 nm e 550 nm da cápsula de controle na fonte de luz.
- Pressione o botão Executar no sistema de macro do mouse para permitir o controle do cursor do mouse de acordo com um cronograma descrito na Figura 3A. Isso começa a gravar usando o software de rastreamento e estimular por software genético de ondas enquanto rastreia o worm.
- Verifique se o arquivo BMP de saída foi criado adequadamente.
6. Análise de dados
- Crie uma pasta na área de trabalho e nomeie-a Como Cálcio.
- Crie uma pasta dentro da pasta CalciumImaging e nomeie-a COMO CIResult, para os arquivos de resultado de saída.
- Clique duas vezes no arquivo DualViewImaging.nb escrito no software de análise de dados para Windows.
- Insira o caminho do arquivo para a pasta CIResult (por exemplo, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figura 5).
- Insira o caminho do arquivo para a pasta, incluindo o arquivo BMP (por exemplo, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figura 5), no qual XXX denota o nome da pasta, incluindo arquivos BMP.
- Empurre as teclas Shift e Return simultaneamente para iniciar uma análise automática. Esta análise utiliza o valor de uma região de intensidade máxima de campo de visão na imagem TagRFP (Veja a legenda da Figura 6 para procedimento de cálculo detalhado no programa).
- Verifique se os seguintes arquivos de saída são criados adequadamente na pasta CIResult.
XXX-GCaMP.tif (arquivo de imagem ilustrando traços de intensidades GCaMP para todas as imagens)
XXX-GCaMP.xls (arquivo de planilha listando intensidades GCaMP em todas as imagens)
XXX-TagRFP.tif (arquivo de imagem ilustrando traços de intensidades do TagRFP para todas as imagens)
XXX-TagRFP.xls (lista de arquivos de planilhas de intensidades tagRFP em todas as imagens)
XXX-Ratio.tif (arquivo de imagem ilustrando traços do valor da razão para todas as imagens)
XXX-Ratio.xls (arquivo de planilha listando o valor da razão em todas as imagens)
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Resultados
Aqui, um worm expressando gcamp e tagrfp sob controle do promotor específico de internação AVA é usado como um exemplo de imagem de cálcio em se comportar livremente C. elegans. Os dados do canal GCaMP e TagRFP foram obtidos como uma série de imagens, algumas das quais são mostradas na Figura 6 e como um filme (Filme Suplementar 1). O deslocamento da placa de Petri induzido pelo nosso sistema de vibração não localizado (Figura 7) também...
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Discussão
Geralmente, a quantificação da atividade neural requer a introdução de uma sonda e/ou restrições ao movimento do corpo animal. No entanto, para estudos de comportamento mecanosensorial, a introdução invasiva de uma sonda e as próprias restrições constituem estímulos mecânicos. C. elegans fornece um sistema para contornar esses problemas, pois suas características são transparentes e porque tem um circuito neural simples e compacto que compreende apenas 302 neurônios. Combinando essas vantagens com o método previ...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis por fornecer as cepas utilizadas neste estudo. Esta publicação foi apoiada pela JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sobre áreas inovadoras do projeto "Ciência do Robô Macio" (Grant no. JP18H05474), prime da Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (número de subvenção 19gm611002h001), e a fundação Shimadzu.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Software de análise de dados | |||
| DualViewImaging.nb | autor | Para análise dos dados adquiridos | |
| Mathematica12 | Wolfram | Para executar o software de análise de dados DualViewImaging | |
| Escherichia coli e C. elegans cepas | |||
| E. coli OP50 | Centro de Genética de Caenorhabditis | OP50 | Alimento para C. elegans. Uracila auxotrófica. E. coli B. |
| lite-1(ce314) cepa | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | mutante insensível à luz |
| lite-1(ce314) cepa expressando NLS-GCaMP-NLS e TagRFP sob o controle do autor do promotor AVA-especirico | ST12 | lite-1(ce314) mutante portador dos genes que expressam NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; sinal de localização nuclear) e TagRFP sob o controle do flp-18 promotor como um vibrômetro extracoromossomal arrays | |
| Laser Doppler | |||
| Lase Doppler vibrômetro | Polytec Japan | IVS-500 | Para quantificar a frequência e o deslocamento gerados pelo transdutor acústico |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Autor | Script para controlar temporalmente e especialmente o cursor do mouse no Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Software de download gratuito para controlar o cursor do mouse com base em um script |
| Nematode placa de mídia de crescimento | |||
| Agar purificado, pó | Nakarai tesque | 01162-15 | Para preparação de placas NGM |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Para preparação de placas NGM |
| Cloreto de cálcio | Wako | 036-00485 | Para preparação de placas NGM |
| Colesterol | Wako | 034-03002 | Para preparação de placas NGM |
| hidrogenofosfato di-fotássio | Nakarai tesque | 28727-95 | Para preparação de placas NGM |
| Caldo LB, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Para cultura de E. coli OP50 |
| Sulfato de magnésio anidro | TGI | M1890 | Para preparação de placas NGM |
| Di-hidrogenofosfato de potássio | Nakarai tesque | 28720-65 | Para preparação de placas NGM |
| Cloreto de sódio | Nakarai tesque | 31320-05 | Para preparação de placas NGM |
| Placas de Petri (60 mm) | Nunc | 150270 | Para preparação de placas NGM |
| Dispositivo de vibração não localizada | |||
| Amplificador | LEPY | LP-A7USB | Para estimulação com vibração controlável |
| Transdutor acústico | MinebeaMitsumi | LVC25 | Para estimulação com vibração controlável |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Software de download gratuito para controlar a propriedade de vibração |
| < imagem de cálcio não invasiva>< / forte> | |||
| canais de bancada 3 fases sem escova DC | Thorlabs | BBD202 | para MLS203-1 estágios |
| 479/585 nm BrightLine filtro passa-banda de banda dupla | Semrock | FF01-479/585-25 | Para aquisição de imagens de dois canais (GCaMP e TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dichroic beamsplitter de epifluorescência padrão de borda dupla | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | Para aquisição de imagens de dois canais (GCaMP e TagRFP) |
| Filtro passa-banda de banda única BrightLine de 512/25 nm | Semrock | FF01-512/25-25 | Para aquisição de imagens de dois canais (GCaMP e TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine filtro passa-banda de banda única | Semrock | FF01-630/92-25 | Para aquisição de imagens de dois canais (GCaMP e TagRFP) |
| Computador | Dell | Precision T7600 | Windows7 com CPU Intel Xeon ES-2630 e 8 GB de RAM |
| Platina motorizada x-y de alta velocidade | Thorlabs | MLS203-1 | Platina de varredura XY rápida |
| Óptica de divisão de imagem | Fotônica Hamamatsu | A12801-01 | Para aquisição de imagens de dois canais (GCaMP e TagRFP) geradas por W-VIEW GEMINI Óptica de divisão de imagem |
| Fonte de luz LED | CoolLED | pE-4000 | Para geração de luz de excitação de 470 nm e 560 nm |
| Microscópio | Olympus | MVX10 | |
| câmera sCMOS | Andor | Zyla | |
| x 2 Lente objetiva | Olympus | MVPLAPO2XC | Distância de trabalho 20 mm e numérica abertura 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 autor do plasmídeo | pKDK66 | Marcador de co-injeção | |
| pTAK83 autor do plasmídeo | pTAK83 | Plasmídeo para expressão de TagRFP sob o controle de o promotor flp-18 | |
| plasmídeo pTAK144 | pTAK144 | Plasmídeo para expressão de NLS-GCaMP5G-NLS sob o controle de o flp-18 promoter | |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | autor | Arquivo SubVi para rastrear um ponto fluoresent de um verme através do controle de feedback da câmera sCMOS e da platina motorizada x-y | |
| LabVIEW | National instruments | Para executar o software de rastreamento | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | autor | Para rastrear um ponto fluoresent de um verme através do controle de feedback da câmera sCMOS e do estágio motorizado x-y |
Referências
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Reimpressões e permissões
