Artigo de método

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

DOI:

10.3791/61629

⸱

19 de novembro de 2020

 ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo detalha um método adaptado para derivar, expandir e criopreservar células microvasculares microvasculares cerebrais obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e para estudar as propriedades da barreira cerebral no sangue em um modelo ex vivo.

Resumo

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As células-tronco endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) podem ser diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) para desenvolver modelos celulares ex vivo para estudar a função de barreira hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado fornece etapas detalhadas para derivar, expandir e criopreservar BMECs de iPSCs humanos usando um doador e reagentes diferentes dos relatados em protocolos anteriores. Os iPSCs são tratados com meio essencial de 6 por 4 dias, seguidos por 2 dias de cultura endotelial-livre de soro humano complementada com fator básico de crescimento do fibroblasto, ácido retinóico e suplemento B27. No dia 6, as células são subculturadas em uma matriz de colágeno/fibronectina por 2 dias. A imunocitoquímica é realizada no dia 8 para análise de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. A mancha ocidental é realizada para confirmar a expressão do marcador BMEC, e a ausência de SOX17, um marcador endodérmico. O potencial angiogênico é demonstrado com um ensaio brotante. A resistência elétrica trans-endotelial (TEER) é medida usando eletrodos de pauzinho e voltohmômetro a partir do dia 7. A atividade de transporte da Efflux para o membro B da subfamília de fita 1 e atp de ligação c membro 1 é medida usando um leitor de várias placas no dia 8. A derivação bem sucedida de BMECs é confirmada pela presença de marcadores celulares relevantes, baixos níveis de SOX17, potencial angiogênico, atividade de transporte e valores TEER ~2000 Ω x cm2. Os BMECs são expandidos até o dia 10 antes de passar para placas de colágeno/fibronectina recém-revestidas ou criopreservadas. Este protocolo demonstra que os BMECs derivados do iPSC podem ser expandidos e passagens pelo menos uma vez. No entanto, foram observados valores de TEER mais baixos e pior localização dos marcadores BMEC após a criopreservação. Os BMECs podem ser utilizados em experimentos de co-cultura com outros tipos de células (neurônios, glia, pericytes), em modelos cerebrais tridimensionais (organ-chip e hidrogel), para vascularização de organoides cerebrais, e para estudar a disfunção BBB em distúrbios neuropsiquiátricos.

Introdução

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Função de barreira hemencefálica
A barreira hemencefálica (BBB) forma um limite que limita o movimento de substâncias do sangue para o cérebro. O BBB é composto por células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) que formam uma monocamada que reveste a vasculatura. BMECs, juntamente com astrócitos, neurônios, periciosos, microglia e matriz extracelular, formam a unidade neurovascular. Os BMECs possuem uma estrutura paracelular bem regulada que permite ao BBB manter alta resistência elétrica trans-endotelial (TEER), que limita a difusão passiva e serve como indicador de integridade da barreira1,2. Os BMECs também possuem proteínas que auxiliam no movimento transcelular, como endocitose, transcitose e transmigração, bem como extravasação de leucócitos durante uma resposta imune3. Os BMECs contam com transportes de influxo e efflux para nutrição e remoção de resíduos, a fim de manter um equilíbrio homeostático no cérebro3. Por exemplo, a família transportadora solute 2 membro 1 (SLC2A1) é um transportador de fluxo responsável pelo movimento de glicose através do BBB4, enquanto transportadores efflux como o subfamília de de ligação ATP membro B (ABCB1) e o membro C da fita c de ligação ATP 1 (ABCC1) são responsáveis por devolver substratos de volta à corrente sanguínea3,5,6,7. Os substratos ABCB1 incluem morfina, verapamil4e antipsicóticos como olanzapina e risperidona8,enquanto o transportador ABCC1 possui uma variedade de substratos, incluindo conjugados de sulfato, vincristina e conjugados de glucuronídeos4.

Aplicação de Modelos BBB em Transtornos Psiquiátricos
A disfunção bbb tem sido implicada em uma série de transtornos neurológicos e psiquiátricos, incluindo esquizofrenia e transtorno bipolar9,10. Recentemente, modelos celulares ex vivo derivados do iPSC estão sendo utilizados para interrogar os fundamentos celulares e moleculares de transtornos psiquiátricos, mas esses modelos atualmente não levam em conta o potencial papel desempenhado pela neurovasculatura11,12,13. É hipótese que citocinas inflamatórias periféricas que circulam no sangue podem impactar negativamente o BBB14,15,16,17, mas também há evidências de paracelular18,19,20,21,122, transcelular23,24,25,26,27,28,29, e matriz extracelular20,29,30,31,32 anormalidades contribuindo para a disfunção BBB. A interrupção do BBB pode resultar no conteúdo do sangue entrando no parenchyma cerebral e ativando astrócitos e/ou microglia para liberar citocinas proinflamatórias, que por sua vez iniciam uma resposta inflamatória33 que pode ter efeitos prejudiciais no cérebro34. Os BMECs são o componente primário do BBB e examinar a estrutura e a função dessas células pode melhorar a compreensão da disfunção BBB em transtornos neurológicos e psiquiátricos.

Modelos alternativos de BMEC
Antes do desenvolvimento de protocolos eficientes para o eduque de BMECs dos iPSCs1,6,35,36, os pesquisadores haviam empregado BMECsimortalizados 37 para estudar a função BBB. No entanto, muitos desses modelos não conseguiram alcançar fenótipos BBB desejáveis, uma gama fisiológica de valores TEER38,39. Utilizar iPSCs tem a vantagem de manter o fundo genético do indivíduo do qual as células são derivadas. Os cientistas estão trabalhando ativamente no estabelecimento de modelos de microambiente ex vivo derivados do iPSC que recapitulem a estrutura e a função do cérebro humano. Pesquisadores desenvolveram métodos para derivar BMECs que são estruturalmente e fisiologicamente semelhantes aos BMECs encontrados in vivo. Os métodos para a obtenção de populações purificadas de BMECs derivados do iPSC exigem uma série de etapas diferentes, com protocolos sendo otimizados nos últimos anos1,6,35,36. Geralmente, os BMECs derivados do iPSC são cultivados em meio Essential 6 (E6) por 4 dias, seguidos por 2 dias em meio endotelial-livre de soro humano (hESFM) complementados com fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF), ácido retinóico (RA) e suplemento B27. As células são então cultivadas em uma matriz de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) para obter >90% BMECs homogêneos1.

A identidade dos BMECs são confirmadas pela imunofluorescência que mostra a co-expressão de proteínas BMEC, incluindo molécula de adesão celular plaquetária-endotelial-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteínas de junção apertadas como proteína de junção apertada 1 (TJP1), occludina (OCLN) e claudin-5 (CLDN5)6. Ensaios de broto têm sido usados para confirmar o potencial angiogênico de BMECs derivados do iPSC. 6 A integridade BBB dos BMECs é avaliada pela presença de valores fisiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 e atividade mensurável para transportadores de efflux como ABCB1 e ABCC11,6,36. Os recentes avanços metodológicos do grupo Lippmann levaram a protocolos BMEC derivados do IPSC com variabilidade experimental reduzida e reprodutibilidade aprimorada1. No entanto, não se sabe se eles podem ser expandidos e passagens para além do estágio de subcultura. Nosso protocolo modificado visa resolver esse problema, aprovando BMECs derivados do iPSC para além do dia 8 e avaliando se eles podem ser expandidos para reter propriedades BBB após a criopreservação. Embora nenhum estudo tenha descrito a passagem de BMECs derivados do iPSC, existe um protocolo para a criopreservação BMEC que retém propriedades fisiológicas do BBB após passar por um ciclo de congelamento40. No entanto, não se sabe se BMECs pós-criopreservação podem ser passagens e reter propriedades BBB.

BMECs derivados de iPSCs usando o protocolo Lippmann têm sido utilizados para modelar a interrupção do BBB em distúrbios neurológicos como a doença de Huntington7. Esses BMECs derivados do iPSC também têm sido usados para investigar os efeitos da infecção bacteriana, como neisseria meningitidis ou Estreptococos do Grupo B na interrupção da barreira hemo-CSF eBBB, respectivamente 41,42. Além disso, usando BMECs derivados do iPSC de pacientes com síndrome de exclusão de 22q com esquizofrenia, os pesquisadores observaram um aumento na molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma molécula de adesão importante em BMECs que auxiliam no recrutamento e extravasação de leucócitos no cérebro43. Juntos, esses estudos demonstram a utilidade dos BMECs derivados do iPSC para estudar a interrupção do BBB em distúrbios neuropsiquiátricos complexos.

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Protocolo

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Os iPSCs humanos foram reprogramados dos fibroblastos de doadores saudáveis por meio de protocolo aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional do Hospital Geral de Massachusetts e do Hospital McLean, e caracterizados como descritos em estudos anteriores44,45,46.

NOTA: Brevemente, os fibroblastos foram reprogramados para o iPSC através da reprogramação genética baseada em mRNA47. Os iPSCs foram mantidos em células-tronco média (SCM) (ver lista de material) e armazenados a uma densidade de ~1,2 x 102 células/mL com 1 mL de SCM, 10 μM com inibidor de proteína quinase associada a rho (ROCKi) Y-27632, e 10% (v/v) sulfeto de dimetil (DMSO), em frascos criopreservados em nitrogênio líquido a -160 °C. Todos os procedimentos a seguir são realizados em um gabinete de biossegurança, a menos que seja declarado o contrário.

1. Diluição da matriz da membrana do porão e revestimento da placa

  1. Fator de crescimento diluído (1:50) reduziu a matriz de membrana do porão purificada do tumor Engelbreth-Holm-Swarm no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco sem vermelho fenol.
  2. Placas de cultura de células de revestimento com a quantidade apropriada de matriz de membrana de porão diluída (ou seja, placa de 6 poços = 1mL, placa de 12 poços = 0,5 mL) e incubar essas placas a 37 °C por pelo menos 1 hora.

2. manutenção iPSC

NOTA: A confluência máxima por poço em uma placa de fundo plano de 6 poços é ~1,2 x 106 células.

  1. Descongelar iPSCs criopreservados em SCM com 10 μM Y-27632 e placa em uma placa de 6 poços revestida com fator de crescimento diluído reduziu a matriz de membrana do porão.
  2. Mantenha iPSCs em SCM com 10 μM Y-27632 nas primeiras 24 horas após o descongelamento. Mude para meio fresco após 24 horas.
  3. Mantenha iPSCs em SCM até que as células atinjam 80-90% de confluência antes da passagem.
    1. Calcule quantas iPSCs serão necessárias para diferenciação multiplicando a densidade desejada para diferenciação (15.600 células/cm2) pela área superficial do poço. Para uma placa de fundo plano de 6 poços, multiplique 15.600 células/cm2 por 9,6 cm2 para um total de 149.760 células/poço.
  4. Para passar, lave as células com a Solução de Sal Balanceado (HBBS) da Hanks. Em seguida, incubar as células com ácido etilenodiaminatotraacético não enzimático (EDTA) (ver lista de materiais) por 5 minutos a 37 °C.
    1. Use um raspador de células para retirar suavemente as células. Coletar células em SCM fresco.
    2. Células de placas em placas de cultura celular revestidas com SCM diluído e manter células conforme descrito na etapa 2.3 ou armazená-las em ~1,2 x 106 células/mL em 1 mL de SCM, 10 μM Y-27632, e 10% DMSO (v/v) em frascos criopreservados em nitrogênio líquido a temperatura de -160 °C.

3. Diferenciação de iPSCs para BMECs

NOTA: EDTA não enzimática separa as células em aglomerados. EDTA enzimática (ver Tabela de Materiais) separa as células em suspensão de célula única. O ácido retinóico (RA) deve ser protegido contra a luz.

  1. Lave iPSCs uma vez com o Phosphate Buffer Saline (DPBS) de Dulbecco. Incubar com EDTA enzimática (1 mL para placa de 6 poços, 0,5 mL para placa de 12 poços e 0,25 mL para placa de 24-bem) por aproximadamente 5 minutos a 37 °C para produzir uma única suspensão celular.
  2. Coletar células e centrífugas a 300 x g (força centrífuga relativa) por 5 minutos à temperatura ambiente. Pelotas de células resuspendas em SCM contendo 10 μM Y-27632.
  3. Determine a densidade celular usando o Trypan Blue e o contador de células automatizado ou um dispositivo hemótmetro. Células de placa a uma densidade de 15.600 células/cm2 ou 149.760 células/poço de uma placa de fundo plano de 6 poços (com uma área superficial de 9,6 cm2/bem) em SCM contendo 10 μM Y-27632 por 24 horas.
  4. Inicie a diferenciação após 24 horas mudando SCM para E6 médio. Mude o E6 diariamente para os próximos 4 dias.
  5. No dia 4 de diferenciação, substitua o E6 médio por hESFM suplementado com suplemento B27 diluído (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA. Não troque este meio pelas próximas 48 horas.
  6. Prepare 200 mL de hESFM com diluído (1:200) B27, misture 1 mL de suplemento B27 concentrado de 50x a 199 mL de hESFM.
  7. Prepare 20 ng/mL de bFGF reconstituindo 50 μg de bFGF em 250 μL de buffer Tris (5 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl) para fazer 200 μg/mL solução de estoque. Prepare 200 mL de hESFM contendo 20 ng/mL bFGF misturando 20 μL de 200 μg/mL bFGF com 200 mL de hESFM.
  8. Prepare 10 μM RA fazendo primeiro uma solução de estoque de 40 mg/mL de RA adicionando 2,5 mL de DMSO a 100 mg de pó de RA. Diluir esta concentração para 3 mg/mL para fazer uma solução de estoque de 10 mM. Prepare 200 mL de hESFM contendo RA de 10 μM misturando 200 μL de RA de 10μM em 200 mL hESFM.

4. Revestimento de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) Matriz para Purificação de BMEC derivado do iPSC

  1. Adicione 2 mL de água estéril a 2 mg de FN para fazer uma solução de estoque de 1 mg/mL FN. Adicione 5 mL de água estéril a 5 mg de COL4 para fazer uma solução de estoque COL4 de 1 mg/mL.
    1. Deixe a FN dissolver por pelo menos 30 minutos a 37 °C e o COL4 se dissolver à temperatura ambiente.
  2. Solução de estoque FN diluída em água estéril para uma concentração final de 100 μg/mL e solução de estoque COL4 para uma concentração final de 400 μg/mL.
  3. Cubra as placas desejadas (placa de 6-bem = 1 mL de solução COL4/FN, placa de 12 poços = 0,5 mL, placa de 24-bem= 0,25 mL e placa filtrada de 12 transwell = 0,25 mL) com a mistura de 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN.
  4. Incubar placas por uma mínima de 2 horas ou durante a noite a 37 °C; para placas filtradas Transwell, recomenda-se um mínimo de 4 horas.

5. Subcultura e purificação de BMECs derivados do iPSC

NOTA: A incubação com EDTA enzimática pode levar mais de 15 minutos, dependendo da confluência das células no dia 6 de diferenciação.

  1. No dia 6 de diferenciação, lave as células duas vezes com DPBS. Incubar com 1 mL de EDTA enzimática por pelo menos 15 minutos a 37 °C até obter uma única suspensão celular.
  2. Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Pelotas de célula resuspend com hESFM fresco com suplemento B27 diluído (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA.
  3. Células de sementes em placas revestidas com uma mistura de 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN. Células de sementes usando uma razão de 1 poço de uma placa de 6 poços para 3 poços de uma placa de 12 poços, 3 poços de uma placa filtrada de 12 transwell, ou 6 poços de uma placa de 24 poços.
  4. IPSCs indiferenciados da mesma linha celular em placa filtrada de 12 transwell revestidas de COL4/FN como controle negativo para análise de TEER.
  5. Após 24 horas de subcultura, troque de médio para hESFM apenas com suplemento B27. Não são necessárias alterações médias após esta etapa.

6. Ensaio de broto

  1. Colete os BMECs derivados do iPSC do dia 8 e semeeá-los a 100.000 células/poço em uma placa de fundo plano de 24 poços recém-revestida com 200 μL/cm2 de matriz de membrana de porão.
  2. Trate essas células com hESFM com diluído (1:200) B27 e 40 ng/mL do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA165).
  3. Observe as células a cada 24 horas e troque o meio a cada dois dias.

7. Imunocytoquímica (ICC)

NOTA: O ICC é realizado em placas de fundo plano de 24 poços.

  1. Após 48 horas de subcultura (dia 8), lave as células duas vezes com DPBS. Fixar células com 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos.
  2. Lave as células três vezes com DPBS, 5 minutos por lavagem. Células pré-bloco por 1 hora à temperatura ambiente em DPBS com 5% de soro de burro e 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Incubar com anticorpos primários: camundongo anti-humano-PECAM1 (1:100, estoque 0,5 mg/mL), coelho anti-humano-TJP1 (1:200, estoque 0,53 mg/mL), rato anti-humano-CLDN5 (1:200, estoque 0,5 mg/mL), camundongo anti-humano-OCLN (1:200, estoque 0,5 mg/mL), e coelho anti-humano-SLC2A1 (1:100, estoque 0,2 mg/mL) em DPBS contendo 5% de soro de burro durante a noite a 4°C.
    1. Enxágüe células uma vez com DPBS e depois lave cinco vezes por 5 minutos por lavagem com DPBS.
  4. Incubar células com anticorpos secundários: burro-anti-coelho Alexa Fluor 555 (1:200) e burro-anti-mouse 488 (1:200) em DPBS contendo 5% de soro de burro por 1 hora.
  5. Após esta incubação, adicione Hoechst 33342 trihidrocloide trihidrocloride diluído (1:1000) em DPBS por 10 minutos.
    1. Remova a solução Hoechst 33342 e enxágue uma vez com DPBS e lave quatro vezes com DPBS por 5 minutos por lavagem.
  6. Visualize células em microscópios de fluorescência para procurar expressão e localização de fabricantes de células.

8. Medição e Análise do TEER

NOTA: As placas filtradas de Corning 12-Transwell são equipadas com filtros compostos por 1,12 cm2 membranas tereftalatos de polietileno e poros de 0,4 micrômetros. As medições teer são obtidas em réplicas técnicas (3 por poço) e biológicas (3 poços por linha celular e/ou condição).

  1. 24 horas após a subcultura (dia 7), meça o TEER usando eletrodos de pauzinho e um voltohmômetro a cada 24 horas. Consulte o manual do usuário voltohmômetro para obter instruções específicas sobre a obtenção de medições.
    1. Para medir o TEER, carregue o instrumento voltohmômetro na noite anterior. Limpe levemente o instrumento e os eletrodos de pauzinho com 70% de etanol antes de colocá-los no capô de segurança.
    2. Ligue a potência e calibra o medidor ohm conforme recomendado pelo fabricante.
    3. Conecte os eletrodos de pauzinho e enxágue os eletrodos com 70% de etanol seguidos pelo DPBS.
    4. Coloque o eletrodo final mais curto na pastilha trans-bem (a câmara apical) e a extremidade mais longa na câmara basolateral.
    5. Primeiro meça um poço em branco que é revestido apenas com COL4/FN. Então meça os outros poços.
    6. Enxágüe rapidamente eletrodos de pauzinho com 70% de etanol seguidos por DPBS ao medir diferentes condições (ou seja, medir diferentes linhas celulares).
  2. Depois de todas as medidas (em Ω) terem sido registradas, enxágue eletrodos de pauzinho com 70% de etanol e, em seguida, água estéril. Limpe suavemente o eletrodo e deixe-o secar no capô de segurança.
  3. Em média, os valores de TEER triplicado (em Ω) do poço em branco e subtraia esse valor médio de cada valor TEER bruto por condição.
    1. Média dos valores subtraídos e multiplicá-los por 1,12 cm2 (a área superficial da inserção de 12 transwell).
    2. Use valores transformados a partir da etapa 6 para gerar o gráfico mostrando o valor do TEER e os erros padrão para cada dia de medição do TEER.

9. Atividade e Análise do Transporte Efflux

NOTA: O ensaio de atividade do transportador Efflux é realizado em uma placa de fundo plano de 24 poços. Os transportadores de interesse da Efflux incluem a ABCB1 e a ABCC1. Recomenda-se que cada condição seja realizada em triplicado com poços de controle (ou seja, poços em branco sem os respectivos inibidores).

  1. Após 48 horas de subcultura (dia 8), incubam células com Valspodar de 10 μM (inibidor ABCB1) ou 10 μM MK571 (inibidor ABCC1) por 1 hora a 37 °C.
    1. Prepare 10 mM de estoque valspodar dissolvendo 5 mg de pó (1214,64 g/mol) em 412 μL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM Valspodar, misture 10 μL de 10 mM de estoque valspodar com 10 mL de hESFM.
    2. Prepare 10 mM MK571 de estoque dissolvendo 5 mg de pó (537,07 g/mol) em 931 μL e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM MK571, misture 10 μL de 10 mM MK571 com 10 mL de hESFM.
  2. Após 1 hora, incubar células com 10 μM de rhodamina 123 (substrato ABCB1) ou 10 μM 2',7'-diclorodihifluoresceína (H2DCFDA, substrato ABCC1) com ou sem seus respectivos inibidores por 1 hora a 37 °C.
    1. Prepare 10 mM de rhodamina 123 dissolvendo 10 mg de pó (380,82 g/mol) em 875 μL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM de rhodamina 123, misture 10 μL de 10 mM rhodamina 123 estoque com 10 mL de hESFM.
    2. Prepare 10 mM H2DCFDA dissolvendo 50 mg de pó (487,29 g/mol) em 10,26 mL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM de rhodamina 123, misture 10 μL de 10 mM rhodamina 123 estoque com 10 mL de hESFM.
  3. Lave as células duas vezes com 0,5 mL de DPBS e lise utilizando DPBS contendo 5% triton-X (v/v).
  4. Meça fluorescência das células líssedas usando um leitor de várias placas ou microplaca (ver lista de materiais).
    1. Defina o instrumento do leitor de placas fluorescentes para excitação de 485 nanômetros e 530 nanômetros e meça fluorescência nesses comprimentos de onda.
    2. Para poços não utilizados no ensaio do transportador, lave as células duas vezes com DPBS antes de corrigi-las com 4% de PFA para quantificação de núcleos celulares.
  5. Incubar células com Hoechst 33342 trihidroclorito trihidrodlorida diluída (1:1000) em DPBS por 10 minutos. Imagem múltiplos campos visuais em cada poço para calcular a contagem média de núcleos celulares usando microscópios de fluorescência.
  6. Conte núcleos usando Fiji e normalize valores de fluorescência em uma base por célula para essas contagens.
    1. Calcule o acúmulo médio de fluorescência subtraindo o valor de acumulação de fluorescência bruta para cada condição a partir de seu respectivo valor em branco.
    2. Valores subtraídos médios para cada condição.
    3. Divida os valores médios da etapa 9.6.1 pela contagem média de células. Use esses valores para normalizar os valores de fluorescência em uma base por célula.
    4. Utilize valores normalizados para gerar uma representação gráfica para cada condição inibidora e realizar qualquer análise estatística necessária.

10. Troca de passes, expansão e criopreservação de BMECs

  1. Reabastecer as culturas do dia 8 BMEC com hESFM fresco suplementado com B27 diluído (1:200) e permitir que as células se expandam por mais dois dias na matriz COL4/FN.
  2. Cubra uma nova placa filtrada de 12 Transwell e uma placa de fundo plana de 24 poços com 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN e incubar por 4 horas.
  3. No dia 10, lave as células com DPBS e incuba com 1 mL de EDTA enzimática por pelo menos 15 minutos a 37°C até que uma única suspensão celular seja obtida.
  4. Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
    1. Para criopreservar essas células, resuspend pelotas de células com hESFM fresco com 30% de soro bovino fetal (FBS) e 10% DMSO.
    2. Armazene BMECs derivados do iPSC em frascos criopreservados em um recipiente isopropanol durante as primeiras 24 horas a -80 °C, em seguida, coloque em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo a -160 °C.
    3. Para a passagem dessas células, resuspend pelotas de células com hESFM fresco suplementado com diluído (1:200) B27.
  5. Células de sementes em placas revestidas preparadas na etapa 10.2. Células de sementes usando uma razão de 1 poço de uma placa de 6 poços para 3 poços de uma placa filtrada de 12 transwell e para 6 poços de uma placa de 24 poços. Permitir que as células cresçam e se expandam por 24 horas.
  6. No dia 11, meça o TEER seguindo as etapas listadas na Etapa 8.
  7. No dia 12, execute o ICC seguindo as etapas listadas na Etapa 9.
  8. Para descongelar BMECs criopreservados, coloque os frascos criopreservados em uma água morna ou banho de contas a 37oC. Em seguida, transfira os BMECs descongelados para 5 mL de hESFM complementados com B27 diluídos (1:200).
    1. Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Resuspend as células em hESFM complementadas com diluído (1:200) B27, 10 μM RA e 10 μM Y-27632.
    2. Após 24 horas, mude de médio para hESFM complementado com diluído (1:200) B27 e 10 μM Y-27632 sem RA.

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Resultados

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Diferenciação BMEC
Alguns passos críticos neste protocolo devem ser seguidos com precisão(Figura 1). O uso médio do E6 no dia 1 é importante, uma vez que é frequentemente usado para obter linhagem neuroectoderme de iPSCs dentro de um período relativamente curto de tempo produzindo resultados reprodutíveis em múltiplas linhas celulares36. Outro passo importante é no dia 4 de diferenciação, onde o meio E6 deve ser trocado para hESFM com BMECs derivad...

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Discussão

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Modificações e solução de problemas

Neste protocolo, fizemos algumas modificações no uso de uma matriz extracelular comumente usada e meios de cultura celular durante a cultura iPSC para derivação de BMECs (Figura 1). Essas mudanças não impactaram a capacidade de derivar BMECS de iPSCs humanos, conforme descrito no protocolo Lippmann1. Uma linha iPSC de um doador saudável diferente foi usada para demonstrar que este protoco...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio R01MH113858 (para R.K.), do National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS), r01MH113858 (para R.K.), prêmio kl2 TR002542 (PL). um National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (para R.K.), um Sydney R Baer Jr Foundation Grant (para P.L.) o Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (para R.K.), a Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (para R.K.), o Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (para R.K.), o Harvard Stem Cell Institute (para R.K.) e por Steve Willis e Elissa Freud (para R.K.). Agradecemos à Dra.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetatoSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Burro anti-rato IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Burro anti-coelho IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SuplementoThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Sinalizaçãode Células3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Colágeno IV da placenta humanaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Frasco Criogênico de Polipropileno com Rosca Interna Corning  8670
Corning  Placas de Cultura de Células de Fundo Plano Costar (6 poços)Corning353046
Corning  Placas de Cultura de Células de Fundo Plano Falcon (24 poços)Placa de
Corning Transwell com Inserções de Membrana de Poliéster Permeável (12 poços)Corning3460
Lâminas CountessThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (sem vermelho de fenol)Thermo Fisher Scientific 
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Soro de burroSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Medidor14040-117
(EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher Scientific
Soro Fetal Bovino (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinaSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Fator de Crescimento Reduzido Matriz de Membrana BasalThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance com cálcio e magnésio Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Tricloridrato, TrihidratoThermo Fisher ScientificH3570
Meio humano sem soro endotelialThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen  Contador de Células Automatizado CountessThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldeído 16% Serviços deMicroscopia Eletrônica15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-placa Leitor:Perkin Elmer, N/A
Humano Recombinante VEGF 165Peprotech100-20
Humano Recombinante FGF-básico (154 a.a.)Peprotech100-18B
Ácido retinóicoSigma AldrichR2625-100MG
Rodamina 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Sinalização Celular81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0,4%) para uso com o contador de células automatizado CountessThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (ciclosporina A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene soluçãoThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dicloridrato (inibidor de ROCK)Tocris/ Thermo Fisher Scientific1254
mAb de Camundongo Múltiplos Poços Corning 353047 A1413202 de Volt/Ohm Epitelial (TEER) da Fisher Scientific A1516401

Referências

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