Artigo de método

Detecção de variantes genéticas no gene CALR usando análise de fusão de alta resolução

DOI:

10.3791/61642

⸱

26 de agosto de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A análise de fusão de alta resolução (HRM) é uma solução sensível e rápida para detecção de variantes genéticas. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes mudando a forma da curva de fusão. Ao pentear o HRM e a agarose gel eletroforesis, diferentes tipos de variantes genéticas, como indels, podem ser identificados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A análise de derretimento de alta resolução (HRM) é um método poderoso para genotipagem e varredura de variações genéticas. A maioria das aplicações de HRM dependem de corantes de DNA saturados que detectam diferenças de sequência, e heterodúplexos que mudam a forma da curva de fusão. Excelente resolução de instrumentos e software especial de análise de dados são necessários para identificar as pequenas diferenças de curva de fusão que identificam uma variante ou genótipo. Diferentes tipos de variantes genéticas com diversas frequências podem ser observadas no gene específico para pacientes com uma doença específica, especialmente câncer e no gene CALR em pacientes com neoplasias mieloproliferativas nômodas negativas da Filadélfia. Alterações de nucleotídeos únicos, inserções e/ou exclusões (indels) no gene de interesse podem ser detectadas pela análise do HRM. A identificação de diferentes tipos de variantes genéticas baseia-se principalmente nos controles utilizados no ensaio qPCR HRM. No entanto, à medida que o comprimento do produto aumenta, a diferença entre curvas de tipo selvagem e heterozigoto torna-se menor, e o tipo de variante genética é mais difícil de determinar. Portanto, quando os indels são a variante genética predominante esperada no gene de interesse, um método adicional como a eletroforese de gel de agarose pode ser usado para o esclarecimento do resultado do HRM. Em alguns casos, um resultado inconclusivo deve ser re-verificado/re-diagnosticado pelo sequenciamento Sanger padrão. Neste estudo retrospectivo, aplicamos o método a pacientes JAK2 V617F negativos com MPN.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As variantes genéticas somáticas do gene da calreticulina (CALR)foram reconhecidas em 2013 em pacientes com neoplasias mieloproliferativas (MPN), como trombocythemia essencial e mielófibrose primária1,2. Desde então, mais de 50 variantes genéticas no gene CALR foram descobertas, induzindo um quadro de 3 +1 (−1+2). As duas variantes genéticas CALR mais frequentes são uma exclusão de 52 bps (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), também chamada de mutação tipo 1, e uma inserção de 5 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da República da Eslovênia. Todos os procedimentos estavam de acordo com a declaração de Helsinque.

1. Análise quantitativa de PCR (qPCR) e pós-qPCR baseada em fluorescência e análise pós-qPCR pelo HRM

  1. Primers resuspend listados na Tabela de Materiais a 100 μM com estéril, RNase e DNase livre H2O (ver Tabela de Materiais). Faça um primer de concentração de trabalho de 10 μM. Os primers utilizados no protocolo foram publicados antesdo 2.
  2. Quantitate granulocitos DNA pelo método de coloração de fluorescência....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A região de interesse do DNA amplificado com sucesso com um aumento exponencial da fluorescência que excede o limiar entre os ciclos 15 e 35 e valores muito estreitos do ciclo de quantificação (Cq) em todas as amostras e controles replicados (Figura 2) é um pré-requisito para a identificação confiável de variantes genéticas pela análise do HRM. Isso é conseguido usando uma determinação precisa do DNA com coloração de fluorescência e uma quantidade igual de DNA no experimento qPCR HRM (ver pa.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O derretimento de alta resolução do DNA é uma solução simples para genotipagem e escaneamento de variantesgenéticas 14. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes que mudam a forma da curva de fusão. Diferentes tipos de variantes genéticas com frequências diversas podem ser observadas no gene específico para um determinado grupo de pacientes com câncer1,2,15,

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a todos os especialistas acadêmicos e colaboradores do Laboratório Especializado de Hematologia, Departamento de Hematologia, Divisão de Medicina Interna do Centro Médico Universitário Ljubljana.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
E-Gel EX 4% AgaroseInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG401004
Fuorômetro 3.0 QUBITInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ33216
Invitrogen E-Gel iBase e E-Gel Safe Imager Combo KitInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2XApplied Biosystem, Thermo Fischer Scientific4415440Componentes: AmpliTaqGold 360 DNA Polimerase, corante MeltDoctor trade HRM, mistura dNTP incluindo dUTP, sais de magnésio e outros componentes tampão, formulados com precisão para obter resultados ótimos de HRM
Placa de reação MicroAmp Fast de 96 poços (0,1 mL)Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4346907
Filme adesivo óptico MicroAmpApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4311971
NuGeniusSyngeneNG-1045Sistemas de documentação em gel
Primer CALRex9 Sequência genômicaEurofins: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (alta pureza, sem sal)
Primer CALRex9 Sequência genômicaEurofins5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (alta pureza, sem sal)
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51306Kit de isolamento de DNA com o tampão para diluição de DNA.
Tubos de ensaio QubitInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32856
QUBIT dsDNA HS ensaioInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32854
Trackit 100bp DNA LadderInvitrogen, Thermo Fischer Scientific10488058Ladder consiste em 13 fragmentos individuais com as bandas de referência em 2000, 1500 e 600 bp.
ViiA7 Sistema de PCR em Tempo RealApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4453534
Água livre de nucleaseVWR, Life Science436912CRNase, água livre de DNase e Protease
direta reversa:

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
  2. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproli....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Neoplasias MieloproliferativasJAK2 V617FEletroforese em Gel de AgaroseEnsaio de qPCR HRMAn lise de Curva de Dissocia oTriagem Gen ticaMuta es Som ticas

Artigos relacionados