Artigo de método

Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

DOI:

10.3791/61648

⸱

15 de setembro de 2020

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O rastreamento de eventos de tradução individual permite estudos cinéticos de alta resolução de mecanismos de tradução dependentes de tampas. Aqui demonstramos um ensaio in vitro de molécula única baseado em interações de imagem entre anticorpos fluorescentes rotulados e peptídeos nascentes marcados por epítope. Este método permite a caracterização de uma molécula de cinética de iniciação e alongamento de peptídeos durante a tradução ativa in vitro dependente de tampas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A síntese proteica dependente da tampa é o caminho de tradução predominante em células eucarióticas. Embora várias abordagens bioquímicas e genéticas tenham permitido estudos extensivos de tradução dependente de tampas e sua regulação, ainda falta caracterização cinética de alta resolução dessa via de tradução. Recentemente, desenvolvemos um ensaio in vitro para medir cinética de tradução dependente da tampa com resolução de molécula única. O ensaio é baseado em anticorpos fluorescentes rotulados para polipeptídeo marcado por epítope nascente. Ao imaginar a vinculação e dissociação de anticorpos de e para os complexos de peptídeos nascentes-ribossome-mRNA, a progressão de tradução em mRNAs individuais pode ser rastreada. Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer este ensaio, incluindo preparações de slides mRNA e PEGylated, imagens em tempo real de tradução e análise de trajetórias de moléculas únicas. Este ensaio permite o rastreamento de eventos de tradução individuais dependentes de tampas e resolve cinéticas de tradução chave, como taxas de iniciação e alongamento. O ensaio pode ser amplamente aplicado a sistemas de tradução distintos e deve beneficiar amplamente estudos in vitro de cinética de tradução dependente de tampa e mecanismos de controle translacional.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A tradução em sistemas eucarióticos ocorre predominantemente através de 7-metilguanosina (m7G) caminhos dependentes de tampa1. Estudos indicam que a etapa de iniciação da tradução eucariótica é limitante e uma meta comum para a regulação2,3,4. Os mecanismos de tradução dependente de tampa têm sido extensivamente estudados utilizando abordagens genéticas5, bioquímicas6,7,8, estrutura9e genômica de10 a granel. Embora esses métodos tenham identificado diversos mecanismos que regulam a iniciação dependente de tampas, sua resolução os limita a apresentar a média de sinais de eventos de iniciação heterogênea e assíncrono. Mais recentemente, eventos individuais de tradução in vivo foram visualizados por métodos que medem a ligação de anticorpos fluorescentes a epítopes em polipeptídeos nascentes11,12,13,14. No entanto, essas novas abordagens também são limitadas em sua capacidade de resolver eventos de iniciação individual, porque vários anticorpos fluorescentes devem ligar um peptídeo nascente para permitir que eventos de tradução única sejam resolvidos a partir de um fundo de fluorescência intracelular elevado. Em muitas interações biológicas, eventos cinéticos individuais resolvidos forneceram insights críticos sobre a compreensão de processos biológicos complexos e repetitivos que não são possíveis de sincronizar a nível molecular. Novos métodos que podem acompanhar a dinâmica dos eventos de tradução individual são necessários para uma melhor compreensão da iniciação e regulação dependentes do limite.

Recentemente desenvolvemos um ensaio in vitro que mede cinética de iniciação dependente da tampa com resolução de molécula única15. Considerando o grande número de fatores proteicos conhecidos e desconhecidos envolvidos nesta via de iniciação3,16, o ensaio de molécula única foi desenvolvido para ser compatível com sistemas de tradução in vitro sem células existentes para se beneficiar da preservação de fatores celulares e atividade de tradução robusta17,18,19,20,21,22,23,24,25. Além disso, o uso de sistemas de tradução sem células permite comparações mais compatíveis entre observações de molécula única e resultados em massa anteriores. Essa abordagem fornece uma integração direta de novas percepções cinéticas de molécula única sobre a estrutura mecanicista existente da iniciação dependente da tampa. Para estabelecer o ensaio de molécula única, o sistema tradicional de tradução livre de células é modificado de três maneiras: uma sequência de codificação de epítopes é inserida no início do quadro de leitura aberta (ORF) de um repórter mRNA; o final de 3′ do repórter mRNA é biotinilado para facilitar o end-tethering mRNA para a superfície de detecção de molécula única; e anticorpos fluorescentes são complementados ao extrato de tradução. Essas modificações requerem apenas técnicas básicas de biologia molecular e reagentes comumente disponíveis. Além disso, essas modificações e as condições de imagem de molécula única preservam a cinética de tradução das reações de tradução sem células a granel15.

Neste ensaio (Figura 1), 5′-end tampado e 3'-end repórter biotinilado mRNA é imobilizado para uma superfície de detecção revestida de streptavidin em uma câmara de fluxo. A câmara de fluxo é então preenchida com uma mistura de tradução livre de células complementada com anticorpos fluorescentes rotulados. Após a tradução mRNA ter ocorrido para aproximadamente 30-40 códons a jusante da sequência de epítope26,27, o epítope emerge do túnel de saída ribossomo e torna-se acessível para interagir com anticorpos fluorescentes rotulados. Essa interação é rápida e sua detecção por técnicas de imagem de fluorescência de molécula única permite o rastreamento de cinéticas de tradução com resolução de molécula única durante a tradução ativa livre de células. Este ensaio deve beneficiar amplamente estudos in vitro de cinética de tradução dependente de tampa e sua regulação, particularmente para sistemas com um ensaio in vitro em massa funcionando.

Um pré-requisito para estabelecer este ensaio de molécula única é um ensaio de tradução livre de células em massa, que pode ser alcançado usando extrato de tradução que esteja comercialmente disponível ou preparado seguindo os métodos descritos anteriormente28. O extrato de tradução eucariótica pode ser obtido de diversas células, incluindo fungos, mamíferos e plantas28. Para imagens, este ensaio requer um microscópio TIRF equipado com intensidade laser e ângulo incidente, um estágio de amostra motorizado, um sistema fluido motorizado e dispositivo de controle de temperatura da amostra. Tais requisitos são genéricos para experimentos modernos in vitro de tirf de molécula única e podem ser alcançados de forma diferente. O experimento aqui apresentado utiliza um sistema TIRF de tipo objetivo composto por microscópio, software e acessórios disponíveis comercialmente, todos listados na Tabela de Materiais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Geração de repórter mRNA

  1. Modifique um modelo de transcrição de DNA que codifica um mRNA repórter "não grampeado" de ensaio em massa inserindo uma sequência de codificação de tags de epitope N-terminus para gerar um modelo de transcrição de DNA para um mRNA repórter "marcado"(Figura 2A).
    NOTA: Recomenda-se interação 3xFLAG/antiflag para este ensaio devido à sua sensibilidade superior e ao curto comprimento da tag 3xFLAG. No entanto, o ensaio é compatível com outros pares de epítope/anticorpos.
  2. Sintetizar RNAs não grampeados e marcados usando modelos de DNA linearizados e um kit de transcrição in vitro (ver Tabela de Materiais). Normalmente, 10-20 pmol de RNA transcrito in vitro é suficiente para o processamento subsequente de RNA para permitir um estudo sistemático de molécula única.
  3. Cape a extremidade RNA 5′(Figura 2B) com um kit de tampa m7G (ver Tabela de Materiais) seguindo a recomendação do fabricante.
  4. Biotinilar a extremidade RNA 3′(Figura 2B) utilizando um kit de biotinilação (ver Tabela de Materiais) conforme o protocolo fornecido com o kit. Purifique as RNAs por extração fenol-clorofórmio seguida de purificação com uma coluna de spin. Elute RNA em 10-20 μL de água sem RNase. Aproximadamente 40-50% do RNA de entrada sem tampa é recuperado.
  5. Avalie a integridade e a concentração do RNA desnaturando a eletroforese do gel de acrilamida e a coloração do RNA, conforme descrito anteriormente29.
  6. Execute a tradução sem células a granel30 com o mRNA repórter marcado por 3'-end biotiningado para confirmar que o mRNA modificado preserva as propriedades de tradução que são de interesse. Como exemplo, a tradução dependente de tampas pode ser confirmada medindo e comparando as atividades dos repórteres em reações de tradução sem células a granel com mRNAs repórteres não tampados e tampados (ver Resultados Representativos).

2. Preparação da câmara de fluxo

  1. Selecione uma espessura de deslizamento de tampa apropriada, conforme especificado pela folha de especificações objetivas do microscópio. Selecione um slide de vidro ou quartzo para sistemas de imagem de fluorescência interna total (TIRF) do tipo objetivo ou prisma, respectivamente.
  2. Realize a limpeza, a salinização, a PEGylation e a montagem da câmara de deslizamento e deslizamento seguindo o protocolo descrito por Chandradoss et al.32 com as seguintes modificações.
    1. Lave lâminas contendo furos perfurados em detergente líquido alcalino de 10% (v/v) por 20 minutos com sônica. Combine os slides e as tampas para todas as etapas de limpeza restantes.
    2. Pule o passo de lavagem de acetona. Amplie o tempo de incubação da cavanha de 20 min para 1 h. Incubar a pegylation da primeira rodada por 3 h. Incubar a pegylation de segunda rodada com MS (PEG)4 por 3 h.

3. Preparação do equipamento

  1. Pelo menos 3 horas antes de realizar um experimento de molécula única, ligue a incubadora de microscópio e reduza o fluxo de ar a uma taxa baixa para evitar perturbações acústicas excessivas de experimentos. Coloque a temperatura da incubadora na temperatura ideal para o sistema de tradução livre de células.
    NOTA: A tradução é extremamente sensível à temperatura. A temperatura de reação ideal é específica para cada sistema de extração celular. A caracterização da temperatura de reação é um passo vital no desenvolvimento de um sistema de tradução sem células a granel. Este ensaio de molécula única deve ser conduzido sob a mesma temperatura ideal da condição de tradução em massa correspondente.
  2. Pelo menos 1 h antes de realizar um experimento de molécula única ligue o laser pressionando o botão de alimentação laser atrás da caixa de laser, gire a tecla de segurança do laser e pressione o botão de partida; ligar o microscópio e tocar no painel de controle da tela de toque para selecionar o modo de imagem, objetivo e conjunto de filtros.
  3. Ligue a câmera EMCCD, o controlador de palco Prior e a bomba de seringa pressionando seus botões de alimentação. Ligue o computador e o software aberto Andor Solis (software 1) para controlar a câmera EMCCD, TirfCtrl (software 2) para controlar o laser, PriorTest (software 3) para controlar o estágio motorizado e Coolterm para controlar a bomba de seringa. Permita que a câmera esfrie e estabilize à temperatura de trabalho designada antes do início da aquisição de dados.
  4. No software 2, confirme que os parâmetros corretos são definidos para comprimento de onda a laser, tipo objetivo e índice refrativo de vidro e amostra. Clique no botão Conectar. Para definir a intensidade do laser, clique no botão Controle ao lado do comprimento de onda laser e, em seguida, na janela de controle de laser, arraste a barra de slides de intensidade. Ajuste o laser no ângulo desejado arrastando a barra de slides da posição de fibra ou inserindo a profundidade de penetração correspondente. Certifique-se de que a caixa do obturador seja verificada para manter o laser no modo Off quando não estiver em imagem.
    NOTA: Abra e feche o obturador a laser verificando a caixa do obturador. Ao estabelecer inicialmente o ensaio, diferentes intensidades de laser e ângulos de incidente devem ser testados para detecção ideal de molécula única. A intensidade laser ideal equilibra fluorescência de molécula única brilhante e fotoblesacing rápido dos fluoroforos. O ângulo do incidente deve ser aumentado além do ângulo crítico para reduzir o alto fundo fluorescente dos anticorpos rotulados de difusão até que os anticorpos ligados ao mRNA sejam claramente resolvidos. Como referência, um laser de 532 nm foi definido para 10 μW no objetivo com o ângulo de incidente a laser definido para 71,5° em um estudo15 usando anti-BANDEIRA rotulado cy3 com uma razão de rotulagem de 2-7 corantes por anticorpo.
  5. No software 1, escolha o Kinetic sob o Modo de Aquisição,insira os parâmetros para tempo de exposição, comprimento da série cinética e valor de ganho EM. Escolha o diretório e atribua nomes de arquivos para salvar o arquivo de imagem de dados.
  6. Coloque a bomba de seringa em uma taxa de fluxo modesta e rápida para a etapa subsequente de lavagem de tubos.
    Pipetar uma alíquota de 70% de etanol em um tubo de microfuge, inserir a extremidade da bomba de seringa na solução de etanol e usar coolterm para alternar a bomba de seringa entre os modos de retirada e distribuição três vezes para lavar o tubo. Repita usando água sem RNase.
    NOTA: O comprimento do tubo deve ser longo o suficiente para permitir que a mistura de tradução seja dispensada na etapa 5 para entrar em contato apenas com a tubulação, não a seringa. O volume de lavagem aqui deve ser maior do que o volume de mix de tradução dispensado para garantir que a mistura de tradução na etapa 5 permaneça em contato com tubos higienizados.
  7. Após a distribuição final da água, remova a água residual do interior da tubulação, cortando a extremidade do tubo em uma limpeza de tecido limpo. Mantenha a extremidade do tubo seca, colocando-a em um tubo de microfuça limpo.

4. Imobilização de mRNA biotinilado de 3′/fim

  1. Mantenha o extrato celular e a mistura de tradução congeladas em gelo seco até pouco antes de seu uso. Descongele os reagentes congelados restantes e mantenha-os no gelo.
  2. Coloque a câmara de fluxo no suporte da amostra do microscópio com o lado do deslizamento voltado para baixo e fixe-a no lugar com fita adesiva. Use fita para cobrir as entradas e saídas de canais de fluxo que não estão em uso.
  3. Pipeta um volume de 1,5x (em relação ao volume do canal; também se aplica a outras etapas na etapa 4 e etapa 5) de 0,2 mg/mL streptavidin no canal de fluxo e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
  4. Para remover streptavidin não vinculado, lave o canal três vezes por pipetação em um volume de 3x de tampão de lavagem T50 (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, 0,2 U/μL RNase inibidor de inibição) por lavagem.
    NOTA: É importante evitar que os resíduos líquidos voltem ao canal. Se a saída do canal de fluxo não estiver conectada a um tubo de coleta de resíduos, coloque um papel de tecido dobrado perto da tomada para absorver o líquido que flui para fora do canal.
  5. Transfira o extrato de tradução e misture do gelo seco para o gelo e deixe-os descongelar.
  6. Coloque uma gota de óleo de imersão no objetivo. Coloque o suporte da amostra do microscópio com a câmara de fluxo no estágio do microscópio. Aproxime o objetivo do deslizamento de cobertura até que o óleo de imersão no objetivo entre em contato com o deslizamento de cobertura. Mova o estágio amostral para que a posição do canal de fluxo esteja diretamente acima da lente objetiva.
  7. No software 2, abra o obturador a laser e ajuste o nível de intensidade do laser.
  8. Na tela sensível ao toque de controle do microscópio, selecione a guia Focus e clique no botão Pesquisa e Início do Foco. Um bip é ouvido quando um plano de foco é alcançado com sucesso.
  9. Imagem da superfície do canal de fluxo no modo Live no software 1. Otimize o foco para uma imagem mais nítida ajustando a posição objetiva com o controle de passo fino na tela de toque.
  10. No software 3, mova o estágio para avaliar o nível de fundo de fluorescência em várias áreas da superfície de detecção do canal de fluxo. Se a fluorescência é baixa, continue com o experimento. Se o fundo da fluorescência for excessivamente alto, considere descartar o canal de fluxo.
  11. No software 2, feche o obturador a laser.
  12. Pipeta o tampão de lavagem T50 do canal de fluxo e imediatamente pipeta em um volume de 2x de solução mRNA biotiningada para o canal de fluxo. Incubar por 15 minutos.
    NOTA: Para cada lote de preparação de mRNA, concentrações de mRNA e tempos de incubação devem ser testadas para alcançar a densidade de superfície mRNA necessária para detecção de molécula única. A densidade de superfície mRNA apropriada media a ligação de anticorpos que mostram manchas fluorescentes com não mais de ~5% de sobreposição (ver Resultados Representativos). Como ponto de partida, recomenda-se mRNA biotinilado a uma concentração de 2-20 nM.
  13. Lave o canal três vezes, pipetando um volume de 3x de tampão compatível com tradução por lavagem.

5. Montagem e entrega de mixagem de tradução para um canal de fluxo para detecção de molécula única

  1. No gelo, monte 3x volumes do mix de tradução30 em um tubo de microcentrifuuge seguindo o protocolo de tradução em massa da etapa 1.7, exceto omitir mRNA e suplemento com uma concentração otimizada de anticorpos fluorescentes rotulados. Gire brevemente o tubo de microcentrifuge para coletar a mistura de tradução na parte inferior do tubo.
    NOTA: Ao estabelecer o ensaio, diferentes concentrações de anticorpos são testadas. A concentração ideal mostra baixas quantidades de anticorpos inespecíficos ligados à superfície de detecção e ligação rápida de anticorpos ao peptídeo nascente (ver etapas 7.1. e 7.2., respectivamente, para detalhes de calibração do ensaio).
  2. Transfira a mistura de tradução para o interior de uma tampa de tubo de microfuge de 0,7 mL. Ajuste a bomba de seringa no modo de retirada. Insira a extremidade da tubulação da bomba na mistura de tradução. Inicie a retirada da seringa para coletar a mistura de tradução no tubo da bomba. Inverta a configuração da bomba de seringa para o modo de distribuição e ajuste o fluxo para uma taxa ideal para a entrega do mix de tradução.
    NOTA: Evite gerar bolhas na mistura de tradução ao transferi-la para o tubo da bomba. Evite retirar a mistura de tradução muito profunda na parte da tubulação que não foi higienizada e enxaguada na etapa 3.6. Ao estabelecer o ensaio, diferentes taxas de fluxo de entrega são testadas para determinar a taxa ideal (veja a etapa 6.2. para obter detalhes sobre a calibração do ensaio).
  3. Se houver uma lacuna entre a extremidade da tubulação e a mistura de tradução, inicie a bomba de seringa e permita que a mistura de tradução chegue à extremidade da tubulação, em seguida, pare a bomba de seringa.
  4. Insira a extremidade da tubulação da bomba na entrada do canal de fluxo. Evite introduzir bolhas de ar na mistura de tradução ao executar a conexão. Estabilize a conexão aparafusando o suporte metálico feito sob medida na placa do suporte da amostra do microscópio. Avalie o foco do microscópio e a fluorescência da área de imagem.
    NOTA: A tubulação pode ser fixada na câmara de fluxo com uma peça personalizada como descrito anteriormente33. Outros tipos de sistemas fluidos também podem ser usados para este ensaio34. O campo de visão deve parecer semelhante antes e depois de conectar a tubulação. Se mais pontos fluorescentes aparecerem após a conexão, a mistura de tradução provavelmente vazará da tubulação de entrega. Dependendo do aplicativo, o canal com mix de tradução vazado pode precisar ser descartado.
  5. Confirme que os parâmetros de aquisição do filme estão corretos e que o nome de arquivo e diretório apropriados foram inseridos para salvar arquivos.
  6. Mova o palco para a imagem de uma área no centro da superfície de detecção do canal de fluxo. Na tela sensível ao toque de controle do microscópio, selecione a guia AF contínua e clique no botão Pesquisa focus e iniciar para manter a posição focal durante o experimento. Um bip é ouvido quando um plano de foco é alcançado com sucesso.
  7. No software 2, abra o obturador a laser. No software 1, clique no botão 'Entrar em sinal' para iniciar a gravação. Após aproximadamente 5 s de gravação, digite o comando Executar no Coolterm para entregar a mistura de tradução no canal de fluxo. Registo por até 2h com uma resolução de tempo de 0,5-2 s/frame.
    NOTA: O período máximo de aquisição de dados depende da rapidez com que o extrato de tradução perde atividade ao longo do tempo, o que pode ser convenientemente caracterizado pela realização de tradução livre de células a granel com o repórter luciferase mRNA e a medição da atividade da luciferase nas reações de tradução em diferentes pontos de tempo35.
  8. Quando a aquisição de dados estiver concluída, desligue o laser, desligue o FA contínuo na tela sensível ao toque do controle do microscópio e desmonte o tubo da câmara de fluxo.
  9. Pipeta a mistura de tradução da entrada do canal de fluxo, transfira-a para um tubo de microfuge e congele a solução colocando o tubo em nitrogênio líquido. Mais tarde, armazene a -80 °C.
  10. Lave a tubulação da bomba de seringa três vezes com água sem RNase, depois três vezes com 70% de etanol. Retire 70% de etanol na tubulação da bomba de seringa para armazenamento.
  11. Desligue o microscópio e todos os acessórios. arrumar.

6. Análise de dados

NOTA: A análise de dados para este ensaio requer métodos comuns em estudos biofísicos de molécula única. Todas as etapas computacionalmente intensivas podem ser alcançadas usando algoritmos e softwares existentes (as referências estão incluídas abaixo em suas etapas correspondentes).

  1. Opcional: Se for o caso, converta o arquivo da série de imagens adquirida em um formato compatível com o software de processamento de imagem ou linguagem de programação escolhida.
  2. Determine o ponto de partida da reação de tradução e o tempo de troca de reagentes.
    NOTA: Devido à difusão de anticorpos fluorescentes na mistura de tradução, a intensidade de fluorescência de fundo de uma área imagem aumentará durante a troca de reagentes no canal do buffer compatível com a tradução para o mix de tradução. O ponto de partida da reação de tradução é definido como o ponto de tempo quando a troca de reagentes estiver completa. Este ponto de conclusão é encontrado medindo a intensidade de fluorescência de fundo durante a entrega da mistura de tradução e identificando o ponto de tempo quando a intensidade crescente da fluorescência platôs15,como descrito abaixo.
    1. Calcule a contagem total de fluorescência por quadro de imagem e plote o perfil de tempo correspondente. Identifique o aumento repentino da fluorescência total no gráfico do perfil temporal.
      NOTA: O aumento total da fluorescência deve-se à concentração crescente de anticorpos fluorescentes rotulados durante a troca de reagentes.
    2. Identifique o ponto final da fase de aumento total da fluorescência e defina este ponto de tempo como o ponto de partida (ou seja, tempo 0) da reação de tradução. Identifique os pontos de partida e o final da fase de aumento total da fluorescência e defina a diferença de tempo como o tempo de troca do reagente.
      NOTA: O tempo total de troca de reagentes depende das dimensões do canal de fluxo e da taxa de fluxo selecionada. É possível que alguns fatores de tradução possam começar a vincular ao mRNA antes que a troca de reagentes seja concluída, o que poderia reduzir a resolução do determinado tempo de iniciação em primeira rodada. Por isso, recomenda-se testar diferentes taxas de fluxo ao configurar o ensaio e selecionar taxas de fluxo que permitem a conclusão da troca de reagentes dentro de 3-4 s para velocidades de aquisição de dados de 0,5-2 s/frame.
  3. Opcional: Realize a correção de deriva do filme.
    NOTA: As posições dos anticorpos vinculados na imagem de dados podem mudar ao longo do tempo devido à deriva de peças e acessórios de microscópio. Deriva que é visualmente perceptível em um filme requer correção antes de prosseguir com a análise de dados. Vários algoritmos de correção de deriva espacial e scripts estão disponíveis36,37,38.
    1. Em cada imagem, encontre a máxima local na contagem de pixels para determinar as posições dos anticorpos amarrados em cada quadro com precisão no nível de pixel. Defina um limiar para a contagem de pixels de modo que apenas pontos que estão claramente acima do ruído de fundo são selecionados.
    2. Calcule as alterações das posições individuais de anticorpos em cada direção entre dois quadros de imagem consecutivos.
    3. Plote o histograma de alterações posicionais de anticorpos entre dois quadros consecutivos e faça-o separadamente para cada direção. Gaussian encaixa cada histograma e define a posição central dos picos como a deriva direcional entre dois quadros consecutivos.
    4. Para neutralizar a deriva observada, mude cada quadro de imagem na direção oposta pela quantidade de deriva calculada.
  4. Construa trajetórias de molécula única.
    NOTA: O software de detecção/rastreamento está disponível para identificar pontos brilhantes e extrair suas intensidades das séries de imagem de dados39,40.
    1. Identificar posições de anticorpos conforme descrito na etapa 6.3.1.
      NOTA: Recomenda-se a inspeção visual para garantir que o limiar escolhido não dê origem a excesso excessivo de partículas. A inspeção visual pode ser realizada sobrepondo as posições centroides identificadas sobre cada quadro de imagem e avaliando visualmente seu acordo (ver Resultados Representativos).
    2. Combine as partículas colhidas de todos os quadros e remova as posições de partículas redundantes.
    3. Inspecione visualmente as imagens de anticorpos amarrados e selecione uma área quadrada que inclua os pixels com contagens claramente acima do fundo e representativas de anticorpos ligados individualmente.
      NOTA: A função de propagação de ponto (ou seja, o tamanho do quadrado para uma única molécula) é determinada pela configuração óptica e pelo tamanho do pixel do detector.
    4. Para cada posição de partícula, construa uma trajetória de molécula única calculando a intensidade total de todos os pixels na área quadrada ao redor da posição das partículas. Trajetórias são construídas para cada posição, quadro a quadro e para todo o filme de dados.
  5. Opcional: Aplique um filtro para frente-para-trás não linear41 para reduzir o ruído de fundo em trajetórias de molécula única.
  6. Opcional: Digitalizar trajetórias com algoritmos de detecção de etapas existentes42,43,44,45.
    NOTA: A escolha do algoritmo de detecção de etapas depende da complexidade da dinâmica de uma molécula. Para o cenário mais simples de tradução ribossa isolada (ou seja, sem formação de polissomo) e boa relação sinal-ruído, uma aplicação limiar para a contagem de fluorescência é suficiente para identificar o tempo de eventos de ligação e dissociação de anticorpos nas trajetórias de molécula única. Recomenda-se uma inspeção visual de pelo menos 100 trajetórias para cada condição para garantir que as etapas de trajetória tenham sido adequadamente selecionadas por uma estratégia de detecção de etapas.
  7. Determine o tempo do primeiro evento de ligação de anticorpos para cada trajetória (ou seja, primeiro tempo de chegada, t1), seja usando trajetórias digitalizadas ou aplicando um limiar a trajetórias nãodigitadas.
    NOTA: O valor médio da primeira distribuição de tempo de chegada pode ser comparado entre diferentes condições de tradução. Alternativamente, a primeira distribuição de tempo de chegada pode ser encaixada em uma função normal de log (3 parâmetros) deslocada para determinar o valor médio15 <t1>. Como a distribuição do tempo de chegada é tipicamente distorcida e tem uma cauda longa, não calcule a média por média direta sobre os tempos de primeira chegada observados.
  8. Opcional: Análise de tempo de moradia e cálculo da taxa média de síntese de peptídeos.
    1. Use trajetórias digitalizadas para identificar eventos de tradução monossóbicos (ribossomos únicos) em cada trajetória e calcular os tempos de moradia de evento de ligação única como a diferença de tempo entre os eventos correspondentes de ligação de anticorpos e dissociação.
      NOTA: Algoritmos de detecção de passos para digitalizar trajetórias são geralmente menos confiáveis quando múltiplos eventos moleculares se sobrepõem no tempo. Recomenda-se, portanto, a exclusão de eventos polissóis da análise do tempo de moradia. Para sistemas de tradução altamente ativos que são enriquecidos com eventos polissóis e raramente exibem eventos monosários, uma mistura de anticorpos rotulados e não rotulados pode ser usada para aumentar a chance de observar eventos isolados de tradução em trajetórias de molécula única.
    2. Encaixe a distribuição em uma função log-normal e use a função instalada para calcular o tempo médio de moradia.
      NOTA: Calcular a média diretamente pela média dos tempos de moradia observados não é recomendado porque as distribuições de tempo de moradia são tipicamente distorcidas com caudas longas.
    3. Determine o número de aminoácidos que são traduzidos durante o tempo de ligação de anticorpos subtraindo a soma do comprimento do aminoácido epitope e 35 (o comprimento médio de aminoácidos de peptídeo nascente dentro do túnel de saída ribossomo) do número total de códons ORF.
    4. Para determinar a taxa média de síntese de peptídeos, divida o número de aminoácidos traduzidos pelo tempo médio de consumo.
  9. Opcional: Cálculo do tempo médio de iniciação na primeira rodada (<t1_I>).
    NOTA: As condições de iniciação e alongamento, como o contexto da sequência do local de iniciação e a sequência de codificação, são geralmente preservadas deliberadamente para estudos de cinética de iniciação. Portanto, o tempo médio de primeira chegada <t1> a partir do passo 6.7. pode ser usado diretamente para calcular a alteração na cinética de iniciação da primeira rodada entre diferentes condições. A correção a seguir só é necessária para determinar o valor real do tempo de iniciação da primeira rodada.
    1. Divida a soma do comprimento do epítope e 35 (o comprimento médio de aminoácidos do peptídeo nascente dentro do túnel de saída ribossomo) pela taxa média de síntese de peptídeos (a partir da etapa 6,8,4.) para calcular o tempo médio de alongamento do peptídeo desta região n-terminal (<t1_tag>).
    2. Como a primeira vez é a soma do tempo de iniciação da primeirarodada e t1_tag, subtrair <t1_tag> a partir do tempo médio de primeira chegada <t1> para calcular o tempo médio de iniciação da primeira rodada <t1_I>: <t1_I> = <t1>1_tag-

7. Calibração do ensaio

NOTA: Realize as seguintes etapas de calibração ao estabelecer inicialmente o ensaio.

  1. Para examinar a especificidade de ligação de anticorpos, execute as etapas do protocolo nas seções 4 e 5 separadamente para mRNAs não grampeados e marcados(Figura 2). Os níveis de ligação de anticorpos nos canais com estes respectivos mRNAs representam a extensão da ligação de anticorpos inespecíficos à superfície de detecção e da ligação de anticorpos específicos ao peptídeo nascente.
    NOTA: Recomenda-se que a relação de ligação específica a não específica seja >10 e pode ser aumentada com diferentes estratégias de passivação da superfície, menor concentração de anticorpos ou maior densidade de superfície mRNA.
  2. Para medir a taxa de ligação de anticorpos, execute o protocolo com um passo extra entre a etapa 4 e a etapa 5.
    1. Após a etapa 4, incubar o canal com mistura de tradução que não tem anticorpos para pré-gerar complexos de mRNA/ribossome/peptídeo.
    2. Em seguida, prossiga para a etapa 5 e flua mistura de tradução complementada por anticorpos para o canal.
    3. Quantifique a taxa média de ligação de anticorpos para peptídeo nascente pré-gerado com ajuste exponencial ao histograma da primeira chegada.
      NOTA: A ligação de anticorpos ao peptídeo pré-gerado deve ser rápida, na ordem dos segundos, e deve ser mais rápida do que a cinética de tradução. Uma maior concentração de anticorpos pode ser usada para aumentar a taxa de ligação de anticorpos.
  3. Fotoestabilidade de anticorpos fluorohore-labeled.
    1. Prepare um slide de acordo com o protocolo na etapa 2, mas pule a etapa PEGylation. Monte a câmara de fluxo após a etapa de salinização. O revestimento de silano permite uma ligação eficiente de anticorpos não específicos à superfície de detecção.
    2. Adicione os anticorpos fluorescentes rotulados no canal para alcançar a densidade de molécula única de anticorpos inespecíficos ligados à superfície de detecção. Comece adicionando anticorpos fluorescentes que é altamente diluído no tampão de lavagem T50 e aumente gradualmente a concentração de anticorpos até que a densidade de molécula única desejada seja alcançada.
    3. Imagem da superfície de detecção até que a maior parte da fluorescência de anticorpos não seja mais detectável.
    4. Plote o número total de anticorpos visíveis ao longo do tempo para avaliar a taxa de perda de fluorescência de anticorpos devido ao fotobleaching fluorohore.
      NOTA: A rotulagem de anticorpos normalmente produz vários fluoroforos por anticorpo. Anticorpos individuais permanecem detectáveis até que todos os fluoroforos conjugados fotobleach.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguindo o protocolo descrito permite a imagem de interações individuais de anticorpos com polipeptídeos com marca de n-terminal com resolução de molécula única durante a tradução ativa livre de células do repórter mRNA(Figura 1). Um experimento mínimo de demonstração é relatado com o uso de três mRNAs sintéticas: LUC (codificação de luciferase não grampeada), BANDEIRA LUC(codificação de luciferase marcada por 3xFLAG) e hp-LUCF...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em comparação com os típicos experimentos de tirf de molécula única in vitro, a imagem de molécula única com o ensaio descrito aqui é adicionalmente complexa devido ao uso de extrato celular e a uma alta concentração de anticorpos fluorescentes rotulados. Em comparação com a prática mais comum de uma rodada de PEGylation de superfície, uma segunda rodada de PEGylation (passo 2) reduz consideravelmente a ligação de anticorpos inespecíficos à superfície de detecção15. A alta concentração de...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [R01GM121847]; o Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); e iniciativa de genômica funcional MSKCC.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Objetiva de óleo 100X, N.A. 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
Acrilamida / bis (40%, 19: 1)Bio-Rad161-0144
Detergente líquido alcalinoDecon5332
Aminosilano (N- (2-Aminoetil) -3-Aminopropiltrimetoxissilano)UCT Specialties, LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Andor Solis softwareAndorPara controlar o Andor EMCCD
Filtro passa-bandaChroma532/640/25
Filtro passa-bandaChromaNF03-405/488/532/635E-25
Biotina-PEG-SVALaysan Bio IncBiotina-PEG-SVA
Coenzima A ácido livreProlume309-250
Software CooltermPara controlar a bomba de seringa
Computador desktopDellPara controlar o microscópio, a câmera, a platina e a bomba.
Espelho dicróicoSemrockR405 / 488/532/635
Microprep de RNA Direct-zol 50RNXFisher ScientificNC1139450
Sistema de Ensaio de Repórter de Luciferase DuplaPromegaE1910
EpóxiDevcon14250
Firefly luciferina D-Luciferina ácido livreProlume306-250
Ácido acético glacialFisher ScientificBP1185500
Perióxido de hidrogênioSigma-Aldrich216763-500ML
Óleo de imersãoOlympusZ-81226Aluciferase de baixa autofluorescência
PromegaE1500
MEGASCRIPT T7 Kit de transcriçãoThermo fisherAM1334
MetanolFisher MicroscópioMMX04751
CientíficoOlympusIX83
Lâmina de microscópioThermo Scientific3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS(PEG)4Thermo Scientific22341
NaCl (5M)Thermo ScientificAM9760G
No 1.5 microscópio Vidro de coberturaFisherband12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mMOlympus digital Sistema de laserCMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl softwareOlympusPara controlar a intensidade do laser e ângulo de incidência
Tabela ópticaControle de vibração TMC63-563Com isolamento de vibração
Mistura de álcool isoamílico de clorofórmio de fenolSigma-Aldrich77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation KitThermo Scientific20160
Pellets de hidróxido de potássioSigma-AldrichP1767-500G
Estágio de tradução XY motorizado prévioPS3J100
Prior Software PriorTestPriorPara controlar o estágio motorizado anterior
Inibidor de RNase recombinantePromegaN2515
Incubadora superior de estágioIn vivo scientific (instrumentos de precisão mundial)98710-1Com uma gaiola de acrílico personalizada
Frasco de coloraçãoFisher Scientific08-817
StreptavidinThermo Scientific43-4301
Ácido sulfúricoFisher ScientificA300212
SYBR green IIFisher ScientificS7564
SeringaHamilton1725RN
Bomba de seringaAparelho Harvard55-3333
Tris (1M), pH = 7,0Thermo ScientificAM9850G
Banho UltrassônicoBranson
UreiaSigma-AldrichU5378-500G
Sistema de nivelamento VacciniaNew England BiolabsM2080S
Zymo-Spin ICColunas Zymo ResearchC1004
Sistema de ensaio de CPX1800H

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6(2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24(2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357(2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Liga o de Anticorpos FluorescentesRastreamento de Polipept deos NascentesImagem em Tempo RealTrajet rias de Mol cula nicaSistema de Tradu o Sem C lulasImobiliza o de mRNAPrepara o de Canal de Fluxo

Artigos relacionados