Artigo de método

Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano

DOI:

10.3791/61650

⸱

23 de setembro de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging, Department of Chemistry and Physics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086, 2Kusel Design, Niddrie, Melbourne, Australia, 3042

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo deste protocolo é demonstrar como preparar amostras de cristalografia serial para coleta de dados em um injetor viscoso alto, Lipidico, recentemente encomendado no síncrotron australiano.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma instalação para a realização de medições de cristalografia serial foi desenvolvida no síncrotron australiano. Esta instalação incorpora um injetor viscoso de alto efeito construído, Lipidico, como parte da linha de cristalografia macromolecular (MX2) para medir um grande número de pequenos cristais à temperatura ambiente. O objetivo desta técnica é permitir que cristais sejam cultivados/transferidos para seringas de vidro para serem usados diretamente no injetor para coleta de dados de cristalografia serial. As vantagens deste injetor incluem a capacidade de responder rapidamente às mudanças na taxa de fluxo sem interrupção do fluxo. Existem várias limitações para este injetor de alta viscosidade (HVI) que incluem uma restrição sobre as viscosidades amostrais permitidas para >10 Pa.s. A estabilidade do fluxo também pode ser um problema potencialmente dependendo das propriedades específicas da amostra. Um protocolo detalhado de como configurar amostras e operar o injetor para medições de cristalografia serial no síncrotron australiano é apresentado aqui. O método demonstra a preparação da amostra, incluindo a transferência de cristais de lise em uma alta mídia viscosa (graxa de silicone), e o funcionamento do injetor para coleta de dados em MX2.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cristalografia serial (SX) é uma técnica que foi desenvolvida inicialmente no contexto de Lasers eletrônicos livres de raios-X (XFELs)1,2,3,4. Embora abordagens de alvo fixas possam ser usadas para SX5,6,7, normalmente, sistemas injetores são empregados para fornecer cristais em um fluxo contínuo para o feixe de raios-X. Por combinar dados de um grande número de cristais, o SX evita a necessidade de qualquer alinhamento de cristal durante o experi....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de cristais em uma mídia viscosa alta usando seringas de vidro

  1. Centrifugar a solução de cristal suavemente (~1.000 x g, ~10 min a 22 °C) para formar uma pelota de cristal macio e remover o excesso de tampão. Isso resultará em uma alta concentração de cristais na pelota que podem ser usados para coleta de dados.
    NOTA: Para evitar a diluição da mídia viscosa aumente a concentração de cristal nesta etapa. Otimize a proporção de mídia viscosa ao volume de cristal para cada amostra para obter uma alta concentração de cristais, mantendo uma alta viscosidade para a mídia. Centrifugar a solução de cristal para formar uma pelota e remover o ....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidico é um HVI construído como um sistema de entrega alternativa para uso em MX2 (Figura 1). É ideal para SX onde os cristais são cultivados em fase cúbica lipídica ou transferidos para uma alta mídia inerte viscosa.

Para demonstrar a aplicação injetora, a graxa de silicone misturada com cristais de lisezímola foi usada para coletar dados SX na linha de feixe MX2 no síncrotron australiano. Para montar o injetor na linha de feixe MX2, o bocal criogênico é removi.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um HVI alternativo foi desenvolvido, ideal para a realização de experimentos SX em fontes síncrotrons. Ele tem duas vantagens fundamentais sobre os HVIs existentes. Primeiro, é fácil instalar na linha de trave permitindo uma comutação rápida entre cristalografia convencional e SX, apenas ~30 minutos é necessário para instalação e alinhamento no MX2. Em segundo lugar, as seringas amostrais usadas para cultivar cristais podem ser usadas diretamente como reservatórios para injeção, limitando o desperdício durante a transfer.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MK trabalha para projetos Kusel. Kusel Design, um desenvolvedor de dispositivos de laboratório personalizado, foi contratado pelo Dr. Peter Bentsen da Universidade de La Trobe e pelo Dr. Tom Caradoc-Davies da ANSTO e para desenvolver um dispositivo de baixo custo para permitir estudos viscosos elevados na linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano. O dispositivo foi desenvolvido em estreita consulta com o Dr. Caradoc-Davies. Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Esta pesquisa foi realizada em parte usando a linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano, parte do ANSTO, e fez uso do detector da Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lisozima de clara de ovo de galinhaSigma-AldrichL6876Usada para cultivar cristais para testar o injetor e os cristais são transferidos para a graxa de silicone. https://www.sigmaaldrich.com/
Graxa de silicone de alto vácuoDow CorningZ273554-1EAUsada para teste de injetor. https://www.sigmaaldrich.com/
Agulha do injetor (108 µ m ID)Hamiltonpart No: 7803-05www.hamiltoncompany.com
Seringas de vidro à prova de gás, 100 µ lHamiltonnúmero da peça: 7656-01Seringas usadas para injeção de amostras. www.hamiltoncompany.com
Acoplador de seringa LCPFormulatrix209526Acoplador de seringa para misturar as amostras
Injetor LipidicoLa Trobe Univerity/ANSTOEste é um equipamento específico que pode ser acessado através da La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
  2. Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Pro....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Injetor Lip dicoMeios de Alta ViscosidadeConfigura o de Seringa de VidroConcentra o de CristaisControle da Taxa de FluxoPrepara o de AmostrasMedi o de ViscosidadeMapa de Densidade Eletr nica

Artigos relacionados