Method Article

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

DOI:

10.3791/61655

⸱

August 29th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O fenótipo celular pode ser invertido ou modificado com diferentes métodos, com vantagens e limitações específicas para cada técnica. Aqui descrevemos uma nova estratégia que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem, para gerar células pluripotentes de mamíferos. Dois passos principais são necessários. Na primeira etapa, as células adultas maduras (terminantemente diferenciadas) são expostas à borracha epigenética 5-aza-cytidina para levá-las a um estado pluripotente. Esta parte do protocolo foi desenvolvida, com base na compreensão crescente dos mecanismos epigenéticos que controlam o destino e a diferenciação celular, e envolve o uso do modificador epigenético para apagar o estado diferenciado celular e, em seguida, dirigir para uma janela transitória de alta plasticidade.

Na segunda etapa, as células apagadas são encapsuladas em micro-bioreatores de politetrafluoroetileno (PTFE), também conhecidos como Mármores Líquidos, para promover o rearranjo celular 3D para estender e manter a alta plasticidade adquirida. O PTFE é um composto sintético hidrofóbico não reativo e seu uso permite a criação de um microambiente celular, que não pode ser alcançado em sistemas tradicionais de cultura 2D. Este sistema incentiva e aumenta a manutenção da pluripotência, embora as pistas relacionadas à bio-mecanosensing.

Os procedimentos técnicos aqui descritos são estratégias simples para permitir a indução e manutenção de um estado de alta plasticidade em células somáticas adultas. O protocolo permitiu a derivação de células de alta plasticidade em todas as espécies de mamíferos testadas. Uma vez que não envolve o uso de transfecção genética e é livre de vetores virais, pode representar um notável avanço tecnológico para aplicações de medicina translacional. Além disso, o sistema micro-bioreator fornece um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco, recriando in vitro um microambixo específico que permite a cultura de longo prazo de células de alta plasticidade, ou seja, como ESCs, iPSCs, células epigeneticamente apagadas e MSCs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante as últimas décadas, o conceito amplamente aceito de progressão unidirecional em direção ao comprometimento e diferenciação celular foi completamente revisto. Foi demonstrado que a especificação celular pode ser revertida, e uma célula terminantemente diferenciada pode ser empurrada para um estado permissivo menos comprometido e mais alto, usando diferentes métodos.

Entre os vários métodos propostos, um dos métodos mais promissores envolve o uso de compostos químicos para induzir células em uma chamada pluripotência quimicamente induzida. As pequenas moléculas utilizadas nesta abordagem são capazes de interagir e modificar a assinatura epigenética de uma célula adulta madura, evitando a necessidade de qualquer vetor transgênico e/ou viral 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Inúmeros estudos têm mostrado recentemente que é possível mudar as células de um fenótipo para outro, fornecendo estímulos bioquímicos e biológicos específicos que induzem a reativação de genes hipermetilados 11,12,13,14,15. Esses eventos de desmetilação permitem a conversão de células terminais diferenciadas em um progenitor primitivo, um multipotente ou uma célula de alta plasticidade/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Paralelamente, muitos estudos têm se concentrado recentemente na compreensão de pistas relacionadas à mecanosensagem e, mais especificamente, na possibilidade de usar forças mecânicas para influenciar diretamente a plasticidade celular e/ou diferenciação 16,17,18,19. De fato, foi claramente demonstrado que a matriz extracelular (ECM) desempenha um papel fundamental no controle do destino celular. Em particular, os sinais biomecânicos e biofísicos produzidos pelo ECM regulam diretamente mecanismos moleculares e vias de sinalização, influenciando o comportamento celular e funções20,21. Esses dados recentes abriram caminho para o desenvolvimento de novos sistemas de cultura 3D que imitam mais de perto o microambiente de células in vivo, replicando estímulos mecânicos e físicos impulsionando o comportamento celular.

Descrevemos aqui um protocolo de duas etapas que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem, para gerar células pluripotentes de mamíferos. No primeiro passo, as células são incubadas com a molécula desmetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Este agente é capaz de induzir uma significativa desmetilação global de DNA através de um efeito combinado da translocação direta 2 (TET2)-mediada ação 8,10 e a inibição indireta das metiltransferases de DNA (DNMT)22,23. Esta etapa induz a remoção dos blocos epigenéticos com uma posterior reativação da expressão genética relacionada à pluripotency e, portanto, a geração de células de alta plasticidade 1,2,3,8,10, a partir de agora referidas como "células apagadas epigenéticas". Na segunda etapa, as células são encapsuladas em um sistema de cultura 3D. Para isso, o composto sintético hidrofóbico não reativo politetrafluoroetileno (PTFE; com tamanho de partícula de 1 μm) é usado como micro-bioreator, que permite a criação de um microambiente celular inalcançável através do uso de sistemas tradicionais de cultura 2D10. As partículas de pó PTFE aderem à superfície da gota líquida na qual as células são re-suspensas e isolam o núcleo líquido da superfície de suporte, permitindo a troca de gás entre o líquido interior e o ambiente circundante24. O "micro-bioreator PTFE" obtido, também conhecido como "Mármore Líquido", incentiva as células a interagir livremente entre si, promovendo o rearranjo de células 3D 25,26,27, e estende e mantém de forma estável o estado de alta plasticidade adquirido, embora a sinalização relacionada à bio-mecanosensing 10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os estudos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Milão. Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH). O isolamento de células humanas de indivíduos adultos saudáveis foi aprovado pelo Comitê de Ética do Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Todos os métodos do nosso estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.

1. Isolamento do fibroblasto de pele

NOTA: Todos os procedimentos descritos abaixo podem ser aplicados a fibroblastos isolados de diferentes espécies de mamíferos, incluindo camundongos, suínos e humanos. As células murinas foram isoladas de camundongos machos de 7 semanas de idade e tecido da pele suína foram coletados no matadouro local. As células humanas foram isoladas de pacientes adultos, após consentimento por escrito.

  1. Prepare 0,1% solução de gelatina suína.
    1. Pesar 0,1 g de gelatina suína e dissolvê-la em 100 mL de água. Esterilizar a solução de gelatina por autoclaving antes de usar.
    2. Cubra placa de Petri de 35 mm com gelatina suína de 0,1%, adicionando 1,5 mL da solução preparada. Incubar por 2h em temperatura ambiente.
  2. Corte biópsias de pele de mamíferos (camundongos, suínos e humanos) de aproximadamente 2-5 cm de comprimento e coloque-os na linha salina tamponada fosfato (PBS) de Dulbecco contendo 2% de solução antimíctica antimíctica antimíctica. Armazenar a + 4 °C até usar.
    NOTA: As coletas de biópsia devem ser realizadas de acordo e após a aprovação do Comitê de Ética, de acordo com as diretrizes estabelecidas.
  3. Lave extensivamente as biópsias coletadas três vezes em PBS fresco estéril contendo 2% de solução antimicomolética antibiótico.
  4. Coletar biópsias da última lavagem e colocá-las em uma placa de Petri estéril de 100 mm. Use um bisturi estéril para cortá-los em pedaços de aproximadamente 2 mmde tamanho 3 .
  5. Ao final da incubação de 2 h, remova o excesso de solução de gelatina da placa de Petri de 35 mm (descrita na etapa 1.1.2) e, usando uma pinça cirúrgica estéril, coloque imediatamente 5-6 fragmentos de pele em cada prato de cultura pré-revestido.
  6. Molhe os fragmentos adicionando 100 gotículas μL de meio de isolamento do fibroblasto (Tabela 1) sobre cada uma delas. Cultura a 37 °C em 5% incubadora de CO2 .
    NOTA: Para evitar que o meio se evase, coloque a placa de Petri de 35 mm dentro de uma placa de Petri de 100 mm ou maior contendo água estéril. Certifique-se de tampar ambas as placas de Petri.
  7. Após 24h de cultura, verifique a quantidade do meio na placa de Petri cultura de 35 mm. Se necessário, adicione 500 μL de meio de isolamento do fibroblasto para manter molhado os fragmentos.
  8. Remova cuidadosamente o meio e atualize-o pelo menos a cada 2 dias de cultura usando uma pipeta.
  9. Quando os fibroblastos começam a crescer fora dos fragmentos de pele colocados na placa de Petri de 35 mm (descrita na etapa 1.5.) e começam a formar uma monocamada celular (geralmente 6 dias). Remova as peças da pele usando uma pinça cirúrgica estéril e cultura em 2 mL de meio de isolamento do fibroblasto.
  10. Continue a cultivar a monocamada celular a 37 °C em 5% de incubadora de CO2 até 80% de confluência e atualizar o meio a cada dois dias.

2. Cultura da linha celular primária do fibroblasto

  1. Quando os fibroblastos atingirem 80% de confluência, remova cuidadosamente as células de isolamento do fibroblasto e lave as células três vezes com 3 mL de PBS contendo 1% de solução antimicocótica antibiótico.
  2. Para desapego celular, adicione 600 μL de solução trypsin-EDTA de 0,25% no prato de cultura e incubar a 37 °C por 3-5 min.
  3. Adicione 5,4 mL de cultura fibroblasto para neutralizar a trippsina quando as células começarem a se desprender do prato de cultura (Tabela 1).
  4. Desalojar células por tubulação repetida e suave. Células de placas em novos pratos de cultura (sem gelatina), mantendo a razão de passagem entre 1:2 e 1:4 (dependendo da taxa de crescimento).
    NOTA: A centrifugação não é necessária.
  5. Manter as células na cultura e mudar de meio a cada 2 dias, até que elas tenham atingido 80% de confluência e passá-las.
    NOTA: Propagar fibroblastos duas vezes por semana para manter o crescimento vigoroso.

3. Exposição do fibroblasto ao 5-aza-CR

  1. Prepare a solução fresca de estoque 1 mM 5-aza-CR.
    1. Pese 2,44 mg de 5-aza-CR e dissolva-o em 10 mL de DMEM de alta glicose. Resuspend o pó por vórtice. Esterilize a solução com filtro de 0,22 μm.
      NOTA: A solução de estoque de 5 aza-CR deve ser preparada imediatamente antes do uso.
    2. Prepare a solução de trabalho de 5 aza-CR diluindo 1 μL de solução de estoque de 5 aza-CR (3.1.1.) em 1 mL de meio de cultura fibroblasto.
      NOTA: A concentração da solução de trabalho de 5 aza-CR é de 1 μM 1,2,3,8,9.
  2. Células de trypsinize como descrito anteriormente (2.1.-2.3.) e desalojam células repetidamente e suavemente.
  3. Pegue a suspensão da célula e transfira-a para um tubo cônico.
  4. Conte células usando uma câmara de contagem sob um microscópio óptico à temperatura ambiente. Calcule o volume de células médias necessárias para re suspendê-los para obter 4 x 104 células em 30 μL de cultura fibroblasto complementada com 1 μM 5-aza-CR (ver passo 3.1.2.).
    NOTA: A fórmula a ser utilizada depende do tipo específico de câmara.
    figure-protocol-1
  5. Centrifugar a suspensão celular a 150 x g por 5 min a temperatura ambiente. Remova a pelota supernascedora e resuspend com o meio de cultura fibroblasto suplementado com 1 μM 5-aza-CR (ver passo 3.1.2.). Para que o volume do meio de cultura do fibroblasto seja utilizado, consulte o passo 3.4.
    NOTA: Como controle negativo, as células resuspend ad a mesma concentração no meio de cultura fibroblasto sem 5-aza-CR e proceder com encapsulamento celular em pó PTFE (passo 4.1.-4.13.).

4. Encapsulamento de fibroblasto em micro-bioreatores PTFE

  1. Encha uma placa de Petri de 35 mm com pó de politetrafluoroetileno (PTFE) para produzir uma cama (Figura 1A).
    NOTA: Use placas de Petri de bacteriologia de 35 mm para evitar a adesão ao mármore líquido. Para obter uma fina concha hidrofóbica e porosa, use um pó PTFE com um tamanho médio de partícula de 1 μm e produzido com uma moagem máxima de 2,0 NPIRI. Isso permite a criação de mármores líquidos permeáveis a gás. Além disso, o revestimento translúcido facilita a observação de processos de agregação celular em tempo real Tamanho de partícula maior leva a alta polidispersidade que pode causar evaporação elevada, deformidade e perda da forma esférica, e a dissolução prematura dos micro-bioreatores.
  2. Dispense 30 μL de gotícula única contendo 4 x 104 células (ver passos 3.4.- 3,5.) no leito de pó (Figura 1B).
  3. Gire suavemente a placa de Petri de 35 mm em um movimento circular para garantir que o pó PFTE cubra inteiramente a superfície da gota líquida para formar um micro-bioreator de mármore líquido (Figura 1C).
  4. Pegue o micro-bioreator de mármore líquido usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL, cortada na borda, para acomodar o diâmetro do mármore (Figura 1D,E). Coloque o micro-bioreator de mármore líquido em uma placa de Petri bacteriologia limpa para estabilizá-la (Figura 1F).
    NOTA: Para criar um atrito para segurar o mármore dentro da ponta, corte as pontas da pipeta com um diâmetro aproximadamente ligeiramente menor do que o diâmetro do mármore líquido.
  5. Transfira o micro-bioreator de mármore líquido da placa de Petri para uma placa de 96 poços (um mármore/bem) (Figura 1G).
  6. Adicione lentamente 100 μL de mídia da margem do poço. O micro-bioreator começa a flutuar em cima da mídia (Figura 1H).
    NOTA: O micro-bioreator quebra em contato líquido direto, devido ao rompimento da hidrofobiidade ptfe. Como abordagem alternativa, os micro-bioreatores de mármore líquido podem ser colocados individualmente em um prato de cultura bacteriologia de 35 mm. Neste caso, para evitar a evaporação líquida do mármore, a placa de Petri de 35 mm contendo o micro-bioreator deve ser inserida em uma placa de Petri de 100 mm, anteriormente aliquoed com água estéril
  7. Incubar micro-bioreator de mármore líquido por 18 h a 37 °C em incubadora de CO2 de 5% 1,2,3,8,9.
    NOTA: O tamanho da partícula PTFE de 1 μm pode garantir uma troca de gás ideal entre o líquido interior e o ambiente circundante.
  8. Após a incubação de 5 aza-CR por 18 h, colete o micro-bioreator de mármore líquido usando um corte de ponta de pipeta de 1.000 μL na borda (ver passo 4.5).
  9. Coloque o micro-bioreator em uma nova placa petriologia de 35 mm (Figura 1D-F).
  10. Use uma agulha para perfurar o mármore líquido e quebrá-lo.
  11. Recuperar esferoides formados com uma ponta de pipeta de 200 μL, cortada na borda, sob um estereomicroscope (Figura 1I,J).
    NOTA: Células epigeneticamente apagadas encapsuladas em PTFE formam uma estrutura esférica 3D (um agregado em cada mármore líquido).
  12. Para avaliar a aquisição de estado pluripotente em resposta ao 5-aza-CR, verifique o início da expressão genética relacionada à pluripotência, OCT4, NANOG, REX1 e SOX2, por PCR qualitativo (Tabela 2).
  13. Prossiga com a segunda etapa do protocolo, conforme descrito abaixo.

5. Cultura em micro-bioreatores ptfe de células epigeneticamente apagadas

  1. Prepare o meio de cultura ESC fresco (Tabela 1).
  2. Transfira organoides em uma placa de Petri contendo meio ESC para lavagem de resíduos de 5 aza-CR (ver etapas 5.1.-5.2.).
  3. Prepare uma nova placa petriologia de 35 mm contendo cama de pó PTFE (veja também o passo 4.1.).
  4. Dispense um organoide único em uma gotícula de 30 μL ESC meio de cultura no leito de pó usando uma ponta de pipeta de 200 μL, cortada na borda (ver passos 4.9.; 5.3.).
  5. Gire suavemente a placa de Petri de 35 mm em um movimento circular para formar um novo micro-bioreator de mármore líquido, pegue-a usando uma ponta de pipeta de 1.000 μL, corte na borda e coloque o micro-bioreator recém-formado em um poço de placa de 96 poços (um mármore/bem) (ver passos 4.3.-4.6.).
  6. Para flutuar os micro-bioreatores, adicione 100 μL de mídia da margem do poço para banhar lentamente o mármore (ver nota 4.7.).
  7. Micro-bioreatores de mármore líquido de cultura a 37 °C em incubadora de CO2 de 5% pelo tempo necessário. Troque de meio a cada dois dias, seguindo o procedimento descrito em 5.3.-5.7.
    NOTA: No presente manuscrito, são fornecidos resultados obtidos com cultura organoides durante 28 dias. No entanto, se necessário, um período de cultura mais longo pode ser realizado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve todas as etapas a serem executadas para gerar e manter as células pluripotentes dos mamíferos a partir de células somáticas adultas. Este método tem sido bem sucedido com fibroblastos isolados de diferentes espécies de mamíferos, ou seja, camundongos, suínos e humanos. Os resultados representativos aqui relatados são obtidos de todas as linhas celulares, independentemente da espécie de origem.

Análises morfológicas mostram que, após a incubação de 18 h com o agent...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante as últimas décadas, diversos estudos se concentraram no desenvolvimento de estratégias para reverter uma célula terminalmente diferenciada para um estado permissivo menos comprometido e maior. O protocolo aqui descrito permite a geração e manutenção a longo prazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras terminais diferenciadas. O método combina duas etapas independentes que envolvem a indução de um estado permissivo elevado que é alcançado através de apagamento epigenético químico e sua manute...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pela Fundação Carraresi e pelo MiND Foods Hub ID: 1176436. Todos os autores são membros do COST Action CA16119 In vitro 3D total cell guidance and fitness (CellFit).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoetanolSigma-AldrichM7522Componente do meio ESC
5-AzacitidinaSigma-AldrichA23855-aza-CR, para apagamento epigenético de fibroblastos
AdenosinaSigma-AldrichA4036Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
Solução antibiótica antibiótica (100 vezes;)Sigma-AldrichA5955Componente de fibroblastos e meios ESC
CFX96 PCR em tempo realBio-RadLaboratories NATermociclador para PCR quantitativo
CitidinaSigma-AldrichC4654Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
DMEM, glicose alta, piruvatoThermo Fisher Scientific41966052Para isolamento de fibroblastos e meio
de culturaDMEM, baixa glicose, piruvato31885023 científico de Thermo Fisherpara o meio
Dulbecco do ESC ' s Fosfato Tampolado SalinoSigma-AldrichD5652PBS; para biópsia e lavagem de células e para preparação de solução
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021mRNA estração
ESGRO Recombinante Mouse LIF ProteínaSigma-AldrichESG1106Componente do meio ESC
Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calorThermo Fisher Scientific10500064Componente de fibroblastos e meios ESC
FGF-Basic (AA10-155) Proteína Humana RecombinanteThermo Fisher ScientificPHG0024Componente do meio ESC
Gelatina de pele suínaSigma-AldrichG1890Para revestimento de pratos
Sistema de PCR GeneAmp 2700Applied BiosystemsNATermociclador para PCR
qualitativo Metilação global do DNA ELISA KitCELL BIOLABSSTA-380 Estudo demetilação
GoTaq G2 Flexi DNA PolimerasePromegaM7801PCR qualitativo
GuanosinaSigma-AldrichG6264Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
Mistura de nutrientes F-10 do presuntoThermo FisherScientific 31550031para meio ESC
KnockOut Substituição de soroThermo Fisher Scientific10828028Componente do meio ESC
KOVA lâmina vítrea 10 com gradesHycor Biomedical87144Para contagem de células
Leica MZ APO Stereo MicroscopeLeicaNAPara observação organoide
Solução de L-GlutaminaSigma-AldrichG7513Componente de fibroblastos e mídia ESC
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Componente do meio ESC
Millex-GS 0.22 µ m filtros de porosMilliporeSLGS033SBPara esterilização de solução
M-MLV Transcriptase Reversa, RNase H Minus, Ponto MutantePromegaM3681mRNA transcrição reversa
Multiskan FC Microplate FotômetroThermo Fisher Scientific51119000Para leitura de placas ELISA
Nikon Eclipse TE300 Microscópio de contraste de fase invertidaNikonNAPara célula observação
Perkin Elmer Termociclador 480Perkin ElmerNATermociclador para transcrição reversa
Poli(tetrafluoretileno) 1 μ m tamanho de partículaSigma-Aldrich430935Para geração de micro-biorreator
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Estração de DNA genômico
TaqMan Células de expressão gênica para CT Kit ThermoFisher ScientificAM1728PCR quantitativo
TimidinaSigma-AldrichT1895Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
Placa de cultura de tecidos 100X20 mm,833902SarstedtPara isolamento de fibroblastos
Placa de cultura de tecidos 35X10 mm, Sarstedt padrão833900Para isolamento de fibroblastos
Placa de cultura de tecidos 35X10 mm, SuspensãoSarstedt833900500Placa de Petri de bacteriologia para cultura de mármore líquido
Placa de cultura de tecidos 96 Well, Standard, FSarstedt833924005Para cultura de mármore líquido
Solução de tripsina-EDTASigma-AldrichT3924Para dissociação de fibroblastos
Tubo 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041Para centrifugação em suspensão celular
UridinaSigma-AldrichU3003Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
padrão

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

Related Articles