Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Resumo

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Resumo

O fenótipo celular pode ser invertido ou modificado com diferentes métodos, com vantagens e limitações específicas para cada técnica. Aqui descrevemos uma nova estratégia que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem, para gerar células pluripotentes de mamíferos. Dois passos principais são necessários. Na primeira etapa, as células adultas maduras (terminantemente diferenciadas) são expostas à borracha epigenética 5-aza-cytidina para levá-las a um estado pluripotente. Esta parte do protocolo foi desenvolvida, com base na compreensão crescente dos mecanismos epigenéticos que controlam o destino e a diferenciação celular, e envolve o uso do modificador epigenético para apagar o estado diferenciado celular e, em seguida, dirigir para uma janela transitória de alta plasticidade.

Na segunda etapa, as células apagadas são encapsuladas em micro-bioreatores de politetrafluoroetileno (PTFE), também conhecidos como Mármores Líquidos, para promover o rearranjo celular 3D para estender e manter a alta plasticidade adquirida. O PTFE é um composto sintético hidrofóbico não reativo e seu uso permite a criação de um microambiente celular, que não pode ser alcançado em sistemas tradicionais de cultura 2D. Este sistema incentiva e aumenta a manutenção da pluripotência, embora as pistas relacionadas à bio-mecanosensing.

Os procedimentos técnicos aqui descritos são estratégias simples para permitir a indução e manutenção de um estado de alta plasticidade em células somáticas adultas. O protocolo permitiu a derivação de células de alta plasticidade em todas as espécies de mamíferos testadas. Uma vez que não envolve o uso de transfecção genética e é livre de vetores virais, pode representar um notável avanço tecnológico para aplicações de medicina translacional. Além disso, o sistema micro-bioreator fornece um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco, recriando in vitro um microambixo específico que permite a cultura de longo prazo de células de alta plasticidade, ou seja, como ESCs, iPSCs, células epigeneticamente apagadas e MSCs.

Introdução

Durante as últimas décadas, o conceito amplamente aceito de progressão unidirecional em direção ao comprometimento e diferenciação celular foi completamente revisto. Foi demonstrado que a especificação celular pode ser revertida, e uma célula terminantemente diferenciada pode ser empurrada para um estado permissivo menos comprometido e mais alto, usando diferentes métodos.

Entre os vários métodos propostos, um dos métodos mais promissores envolve o uso de compostos químicos para induzir células em uma chamada pluripotência quimicamente induzida. As pequenas moléculas utilizadas nesta abordagem são capazes de interagir e modificar a assinatu....

Protocolo

Todos os estudos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Milão. Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH). O isolamento de células humanas de indivíduos adultos saudáveis foi aprovado pelo Comitê de Ética do Ospedale Maggiore Policlinico, Milano. Todos os métodos do nosso estudo foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.

1. Isolamento do fibroblasto de pele

NOTA: Todos os procedimentos descritos abaixo podem ser aplicados a fibroblastos isolad....

Resultados

O presente protocolo descreve todas as etapas a serem executadas para gerar e manter as células pluripotentes dos mamíferos a partir de células somáticas adultas. Este método tem sido bem sucedido com fibroblastos isolados de diferentes espécies de mamíferos, ou seja, camundongos, suínos e humanos. Os resultados representativos aqui relatados são obtidos de todas as linhas celulares, independentemente da espécie de origem.

Análises morfológicas mostram que, após a incubação de 18 h com o agent.......

Discussão

Durante as últimas décadas, diversos estudos se concentraram no desenvolvimento de estratégias para reverter uma célula terminalmente diferenciada para um estado permissivo menos comprometido e maior. O protocolo aqui descrito permite a geração e manutenção a longo prazo de células pluripotentes a partir de células adultas maduras terminais diferenciadas. O método combina duas etapas independentes que envolvem a indução de um estado permissivo elevado que é alcançado através de apagamento epigenético químico e sua manute.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7522	Componente do meio ESC
5-Azacitidina	Sigma-Aldrich	A2385	5-aza-CR, para apagamento epigenético de fibroblastos
Adenosina	Sigma-Aldrich	A4036	Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
Solução antibiótica antibiótica (100 vezes;)	Sigma-Aldrich	A5955	Componente de fibroblastos e meios ESC
CFX96 PCR em tempo real	Bio-Rad	Laboratories NA	Termociclador para PCR quantitativo
Citidina	Sigma-Aldrich	C4654	Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
DMEM, glicose alta, piruvato	Thermo Fisher Scientific	41966052	Para isolamento de fibroblastos e meio
de culturaDMEM, baixa glicose, piruvato	31885023 científico de Thermo Fisher		para o meio
Dulbecco do ESC ' s Fosfato Tampolado Salino	Sigma-Aldrich	D5652	PBS; para biópsia e lavagem de células e para preparação de solução
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	61021	mRNA estração
ESGRO Recombinante Mouse LIF Proteína	Sigma-Aldrich	ESG1106	Componente do meio ESC
Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor	Thermo Fisher Scientific	10500064	Componente de fibroblastos e meios ESC
FGF-Basic (AA10-155) Proteína Humana Recombinante	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Componente do meio ESC
Gelatina de pele suína	Sigma-Aldrich	G1890	Para revestimento de pratos
Sistema de PCR GeneAmp 2700	Applied Biosystems	NA	Termociclador para PCR
qualitativo Metilação global do DNA ELISA Kit	CELL BIOLABS	STA-380 Estudo de	metilação
GoTaq G2 Flexi DNA Polimerase	Promega	M7801	PCR qualitativo
Guanosina	Sigma-Aldrich	G6264	Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
Mistura de nutrientes F-10 do presunto	Thermo Fisher	Scientific 31550031	para meio ESC
KnockOut Substituição de soro	Thermo Fisher Scientific	10828028	Componente do meio ESC
KOVA lâmina vítrea 10 com grades	Hycor Biomedical	87144	Para contagem de células
Leica MZ APO Stereo Microscope	Leica	NA	Para observação organoide
Solução de L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513	Componente de fibroblastos e mídia ESC
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140035	Componente do meio ESC
Millex-GS 0.22 µ m filtros de poros	Millipore	SLGS033SB	Para esterilização de solução
M-MLV Transcriptase Reversa, RNase H Minus, Ponto Mutante	Promega	M3681	mRNA transcrição reversa
Multiskan FC Microplate Fotômetro	Thermo Fisher Scientific	51119000	Para leitura de placas ELISA
Nikon Eclipse TE300 Microscópio de contraste de fase invertida	Nikon	NA	Para célula observação
Perkin Elmer Termociclador 480	Perkin Elmer	NA	Termociclador para transcrição reversa
Poli(tetrafluoretileno) 1 μ m tamanho de partícula	Sigma-Aldrich	430935	Para geração de micro-biorreator
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	Estração de DNA genômico
TaqMan Células de expressão gênica para CT Kit Thermo	Fisher Scientific	AM1728	PCR quantitativo
Timidina	Sigma-Aldrich	T1895	Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC
Placa de cultura de tecidos 100X20 mm,	833902	Sarstedt	Para isolamento de fibroblastos
Placa de cultura de tecidos 35X10 mm, Sarstedt padrão		833900	Para isolamento de fibroblastos
Placa de cultura de tecidos 35X10 mm, Suspensão	Sarstedt	833900500	Placa de Petri de bacteriologia para cultura de mármore líquido
Placa de cultura de tecidos 96 Well, Standard, F	Sarstedt	833924005	Para cultura de mármore líquido
Solução de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Para dissociação de fibroblastos
Tubo 15ml, 120x17mm, PS	Sarstedt	62553041	Para centrifugação em suspensão celular
Uridina	Sigma-Aldrich	U3003	Componente da mistura de nucleosídeos para meio ESC

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