Análise clonal do coração de camundongo neonatal usando modelagem de vizinho mais próximo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para usar rastreamento de linhagem multicolorido e modelagem de vizinho mais próximo para identificar cardiomiócitos derivados clonalmente durante o crescimento e regeneração em camundongos. Essa abordagem é objetiva, funciona em diferentes condições de rotulagem e pode ser adaptada para incorporar uma variedade de pipelines de análise de imagem.

Resumo

Ao substituir o miocárdio perdido ou disfuncional, a regeneração tecidual é uma abordagem promissora para tratar a insuficiência cardíaca. No entanto, o desafio de detectar a regeneração cardíaca genuína limita a validação de potenciais fatores regenerativos. Um método para detectar novos cardiomiócitos é o traçado de linhagem multicolorida com análise clonal. Experimentos de análise clonal podem ser difíceis de realizar, porque as condições de marcação muito esparsas carecem de sensibilidade para eventos raros, como proliferação de cardiomiócitos, e a marcação difusa limita a capacidade de resolver clones. Apresenta-se aqui um protocolo para realizar a análise clonal do coração de camundongo neonatal usando modelagem estatística de distribuições de vizinhos mais próximos para resolver clones de cardiomiócitos. Essa abordagem permite a resolução de clones em uma variedade de condições de marcação e fornece uma abordagem analítica robusta para quantificar a proliferação e regeneração de cardiomiócitos. Este protocolo pode ser adaptado a outros tecidos e pode ser amplamente utilizado para estudar a regeneração tecidual.

Introdução

Uma característica histológica da insuficiência cardíaca é a perda de cardiomiócitos (MCs), seja após lesão, senescência ou apoptose¹. A reposição do miocárdio perdido ou disfuncional por meio da regeneração tecidual representa uma estratégia terapêutica potencial para a cura de pacientes com insuficiência cardíaca. Nas últimas décadas, avanços seminais na biologia do desenvolvimento e regenerativa revelaram uma capacidade limitada do coração dos mamíferos de repor os CMs perdidos 2,3,4,5. Este trabalho emocionante levantou a possibilidade de que mecanismos de crescimento inatos possam ser implantados para regeneração. Como as respostas regenerativas inatas estão funcionalmente ausentes no coração de mamíferos adultos, métodos para melhorar a robustez do reparo endógeno são necessários para que a regeneração terapêutica do coração seja realizada.

Os mecanismos para a regeneração inata do coração parecem ser conservados entre as espécies. Após a lesão, os CMs pré-existentes proliferam para gerar novos CMs em peixe-zebra ^6,7, tritões ^8,9, camundongos ^4,10, ratos¹¹ e porcos^12,13. Nesse sentido, muitos grupos estão buscando identificar mitógenos capazes de promover a cardiomiogênese. No entanto, esse trabalho é desafiador. Não apenas a tarefa de fazer com que os MCs de mamíferos adultos proliferem é assustadora, mas ser capaz de identificar eventos proliferativos raros é difícil ^1,14. O desafio de identificar MCs de ciclo raros é agravado pela tendência dos MCs de mamíferos adultos de sofrerem preferencialmente endomitose. Por exemplo, após uma lesão no coração do camundongo, quase 25% dos CMs na zona de borda reentram no ciclo celular, mas apenas 3,2% dos CMs se dividem⁴. Como a maioria dos CMs cíclicos duplica seu genoma, mas não sofre citocinese, simplesmente testar um aumento no número de CMs cíclicos é ambíguo para a cardiomiogênese genuína. Assim, ensaios para incorporação de nucleosídeos por MCs ou para a presença de marcadores proliferativos em MCs podem não indicar inteiramente regeneração. À medida que surgem mais fatores candidatos à regeneração cardíaca, são necessários ensaios para identificar melhor a hiperplasia do MC.

A análise clonal por rastreamento de linhagem é uma abordagem valiosa para o ensaio de cardiomiogênese, pois permite a visualização direta das células e de sua progênie. As abordagens tradicionais para análise clonal envolvem a marcação rara de células únicas com um gene repórter. No entanto, o rastreamento de linhagem de cor única de células raras pode ser de valor limitado para eventos pouco frequentes, como a proliferação de CM, porque as chances de rotular um CM em proliferação são baixas¹⁵. Alternativamente, o rastreamento de linhagem multicolorida pode aumentar a sensibilidade para análise clonal¹⁶. Resumidamente, as células individuais são geneticamente marcadas com uma das várias proteínas fluorescentes aleatoriamente, de modo que as células em proliferação gerarão aglomerados de células de cores homogêneas que podem ser dissolvidas a partir de células fluorescentes vizinhas. Este método tem sido usado para rastrear o crescimento em uma variedade de órgãos e tem sido aplicado mais recentemente em estudos de regeneração cardíaca de mamíferos^17,18. Embora o rastreamento de linhagem multicolorida possa detectar a expansão clonal de MCs em estágios embrionários e neonatais, as respostas regenerativas inatas não são facilmente detectadas no coração de camundongos adultos após lesão cardíaca^17,19. Uma abordagem para aumentar a sensibilidade do rastreamento de linhagem multicolorida seria aumentar o nível de rotulagem e aumentar a probabilidade de visualização de eventos raros. No entanto, uma rotulagem mais ampla tem o custo de não ser capaz de distinguir células marcadas de forma semelhante como surgindo de um ancestral comum versus células que foram marcadas independentemente com o mesmo fluoróforo. Apresentado aqui é um protocolo que usa modelagem de vizinho mais próximo para identificar CMs clonalmente relacionados no coração de camundongos neonatais. Este método é imparcial, quantitativo e funciona em uma variedade de condições de rotulagem.

Protocolo

Todos os procedimentos para manusear camundongos, realizar cirurgias de sobrevivência e colher corações requerem a aprovação de um comitê institucional local de uso de animais.

1. Camundongos para análise clonal de CMs

1. Cruze camundongos Myh6-MerCreMer ²⁰ com camundongos Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw 21} para gerar Myh6-MerCreMer; Camundongos bitransgênicos R26R-Rainbow.
   1. Manter estoques de camundongos homozigotos para o alelo R26R-Rainbow e cruzar com camundongos heterozigotos para o alelo Myh6-MerCreMer, de modo que todos os experimentos sejam realizados em camundongos heterozigotos para o alelo R26R-Rainbow. Como alternativa, use camundongos homozigotos para o alelo R26R-Rainbow para aumentar a diversidade de cores, mas isso exigirá um sistema de imagem que possa discriminar fielmente os fluoróforos EGFP, mCerulean, mOrange e mCherry.
2. Realizar genotipagem no momento da coleta do coração.
   NOTA: Os camundongos Myh6-MerCreMer expressam uma Cre recombinase induzível por tamoxifeno em CMs e podem ser genotipados usando os primers de PCR CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) e GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) para gerar um produto de 200 pares de bases (pb). Os camundongos R26R-Rainbow expressam constitutivamente EGFP, mas expressarão estocásticamente mCerulean, mOrange ou mCherry após a recombinação mediada por Cre. O R26R-Rainbow pode ser genotipado com os primers de PCR CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT (R26-F), CGAGGCGGATCACAAGCAATA (R26-R) e TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R). O alelo do tipo selvagem fornece um produto de 350 pb e o alelo do arco-íris fornece um produto de 250 pb.

2. Criolesão e marcação de cardiomiócitos

1. Realizar criolesões conforme descrito anteriormente com pequenas modificações^22,23. Coloque cuidadosamente camundongos de um dia (P1) em uma cama de gelo picado por 3 minutos para induzir a parada cardíaca. Confirme a anestesia adequada realizando uma pinça do dedo do pé sem retirada reflexiva.
   NOTA: O momento da anestesia é crítico. A sobrevivência pode ser prejudicada se os ratos forem resfriados por muito tempo. Além disso, a idade dos camundongos é crítica. A capacidade regenerativa diminui acentuadamente na primeira semana de vida¹⁰.
2. Posicione o filhote anestesiado em uma compressa fria e sob a objetiva de um microscópio de dissecação cirúrgica. Use uma microtesoura de 6 mm para realizar uma toracotomia entre a 4ª e a 5ª costela para expor a superfície anterior do coração.
3. Usando uma criossonda resfriada em nitrogênio líquido, coloque a sonda no ventrículo esquerdo por 1-2 s. Para lesões simuladas, realize toracotomia sem criolesão.
   NOTA: A duração da criolesão determina a extensão da lesão. Lesões prolongadas diminuirão as taxas de sobrevivência.
4. Feche a incisão com fio de polipropileno 6-0 preso a uma agulha de 0,15 mm de diâmetro.
5. Aqueça o filhote rapidamente e estimule manualmente para retomar o fluxo sanguíneo. Assim que o filhote estiver se movendo espontaneamente, coloque em uma almofada de aquecimento.
6. Injete filhotes recuperados com 20 μg de tamoxifeno por via intraperitoneal. Neste ponto, injete analgésicos, como bupivacaína a 0,25% ao longo da linha de sutura, se necessário. Devolva os filhotes para a barragem.
   NOTA: Filhotes de uma única ninhada são recuperados juntos e devolvidos à barragem juntos. Esse fluxo de trabalho melhora a sobrevivência e a reaceitação da serapilheira pela barragem.

3. Colheita de corações e processamento para análise histológica

1. Colha corações 20 dias após a lesão (dpi) ou dia pós-natal (P21), pois as respostas regenerativas podem ser observadas neste ponto^{de tempo 10}. Primeiro, eutanasiar camundongos em uma câmara inalatória de CO₂ e depois transferir para um microscópio cirúrgico.
   NOTA: A eutanásia deve ser realizada de acordo com as diretrizes institucionais para o uso de animais.
2. Uma vez confirmada a anestesia suficiente, faça uma toracotomia dupla usando microtesouras cirúrgicas para expor o coração. Em seguida, perfunda o coração com 1 mL de KCl 1 M, 1 mL de paraformaldeído a 4% e 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
   NOTA: A lavagem adequada é necessária para limitar os coágulos sanguíneos intraventriculares que podem causar autofluorescência durante a aquisição da imagem.
3. Após a perfusão, disseque o coração e coloque-o em um tubo contendo pelo menos 1 mL de PBS.
4. Use um microscópio de dissecação para aparar os corações a fim de otimizar a incorporação. Uma fatia horizontal abaixo do átrio fornece uma boa superfície para incorporar os corações para seções de eixo curto.
   NOTA: Alternativamente, pode-se cortar transversalmente o coração se forem desejadas seções de eixo longo.
5. Coloque os corações aparados em 1 mL de sacarose a 30% (peso / vol) a 4 ° C por 12 a 18 h. Remova as amostras da solução de sacarose. Incorpore o tecido aparado em blocos usando meios de congelamento de tecidos.
6. Congele o tecido embutido rapidamente em gelo seco e armazene os blocos a -80 °C.
7. Corte blocos de coração inteiro congelados em seções de 10 μm com um criostato, monte em lâminas carregadas e armazene as lâminas a -20 °C. Seção em série de corações em 10 slides. Isso é feito montando uma seção em cada um dos 10 slides antes de retornar ao primeiro slide para adicionar outra seção. Essa estratégia limita a chance de capturar os mesmos CMs em várias seções em um determinado slide.
   NOTA: Tenha cuidado para limitar a exposição à luz para evitar a perda de fluorescência.
8. Quando estiver pronto para a imagem, descongele as lâminas e reidratie em PBS. Adicione um meio de montagem anti-desbotamento antes de aplicar uma lamínula de vidro #1.5. Conservar as lâminas em lamínula num recipiente coberto a 4 °C.
   NOTA: Para resultados esperados para criolesão, o leitor é direcionado para trabalhos anteriores sobre este tópico²³. Os cortes cardíacos apresentam altos níveis de autofluorescência. O uso de agentes de têmpera, como o Sudan Black, antes da aplicação de uma lamínula pode ajudar a mitigar a autofluorescência. No entanto, deve-se ter cuidado para evitar a extinção de fluoróforos de interesse.

4. Exames por imagem

NOTA: As etapas abaixo se aplicam ao uso de um microscópio comercial (consulte a Tabela de Materiais) que possui um sistema de fluorescência de campo amplo vertical com cubos de filtro equipados para discriminar fluoróforos mCerulean, EGFP, mOrange e mCherry e software associado a essa configuração (consulte a Tabela de Materiais). As etapas adicionais variam dependendo do sistema de imagem exato usado.

1. Visualize o slide inteiro com ampliação de 5x com apenas o filtro GFP para criar um mapa de slides.
2. Selecione seções individuais no mapa de slides que estejam intactas e com autofluorescência limitada para geração de imagens. Devido ao corte serial em conjuntos de 10 lâminas, as seções adjacentes estarão separadas por pelo menos 100 μm, impedindo a obtenção de imagens dos mesmos CMs.
3. Execute imagens de varredura de blocos para as seções individuais usando uma objetiva de 20x com os filtros mCerulean, mOrange, mCherry e EGFP. As imagens representativas são mostradas na Figura 1.
4. Salve as imagens em um formato que permita que as informações individuais do canal sejam recuperadas. Tenha o cuidado de nomear os arquivos em um formato que permita identificar o coração, o fluoróforo e a posição da seção dentro do coração. Uma abordagem sistemática de nomenclatura é necessária para as etapas computacionais abaixo.

5. Análise de imagens para identificação de CMs rotulados

1. Selecione as seções de imagem que estão intactas de cada conjunto e distribua aleatoriamente para todos os rastreadores. Certifique-se de que os rastreadores sigam as etapas a seguir para cada imagem.
2. Para cada canal (mCerulean, mOrange e mCherry), use a ferramenta 'Color Balance' no ImageJ²⁴ para ajustar o brilho e o contraste da imagem para ajudar o usuário a identificar as células rotuladas.
   NOTA: ImageJ é uma ferramenta gratuita de análise de imagem que pode ser baixada do https://imagej.net. Este protocolo usou a versão 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. No ImageJ, selecione 'Definir medidas' no menu suspenso 'Analisar' . Na janela que se abre, selecione 'Área | Centro de massa | Retângulo delimitador | Limite ao limiar».
   NOTA: O módulo de subtração de imagem às vezes pode ser usado para melhorar o sinal do fluoróforo em relação à autofluorescência de fundo. No entanto, se executada, a subtração deve ser feita sistematicamente para todas as imagens em um conjunto de dados.
4. Com a imagem de interesse aberta, selecione 'Ferramentas' e, em seguida, selecione 'Gerenciador de ROI' no menu suspenso 'Analisar'. Isso abrirá a janela 'ROI Manager'.
5. Selecione a ferramenta 'Seleções à mão livre' na barra de ferramentas ImageJ e rastreie a célula de interesse (Figura 2A). Uma vez rastreado, pressione 't' ou use o botão 'Adicionar [t]' na janela 'ROI manager' (Figura 2B). Repita para todas as células de um único canal.
   NOTA: A segmentação e os ROIs devem ser feitos para cada canal separadamente.
6. Depois que todas as células de um determinado canal forem selecionadas, salve os ROIs como um arquivo .zip. Faça isso selecionando primeiro 'Desmarcar' na janela 'Gerenciador de ROI' para garantir que nenhum ROI seja destacado. Em seguida, clique na guia 'Mais' na janela 'Gerenciador de ROI' e selecione a opção 'Salvar'. Isso abrirá o navegador da área de trabalho, onde as ROIs são salvas como um arquivo .zip.
7. Exporte as medições para cada um dos ROIs como um arquivo .csv. Para fazer isso, certifique-se de que nenhum ROI único seja destacado, novamente selecionando 'Desmarcar' e, em seguida, selecione 'Medir' na janela 'Gerenciador de ROI'. Isso abrirá uma nova janela 'Resultados' com todas as medições selecionadas anteriormente.
8. Na janela 'Resultados' , selecione 'Arquivo' e, em seguida, selecione 'Salvar como' no menu suspenso (Figura 2C). Isso abrirá novamente o navegador da área de trabalho, para que o arquivo possa ser salvo no formato .csv.
   NOTA: Certifique-se de salvar os ROIs e as medições antes de passar para a segmentação do próximo canal.
9. Tenha o cuidado de nomear os arquivos em um formato que permita identificar o coração, o canal e a posição da seção dentro do coração. Por exemplo, 'HeartType#_Set#_Section#_Channel' (por exemplo, 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' para os ROIs e 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' para as medições correspondentes).
   NOTA: O código abaixo pressupõe a convenção de nomenclatura acima. Uma convenção de nomenclatura diferente exigirá modificação no código.

6. Análise estatística

NOTA: As células que carregam o mesmo fluoróforo são uma mistura de células derivadas clonalmente (parentes) e células não relacionadas que sofreram um evento de recombinação aleatória para expressar o mesmo fluoróforo (não parentes). Com base em dados anteriores¹⁷, presume-se que as células parentes tenham uma proximidade física mais próxima do que as células não parentes que expressam o mesmo fluoróforo. Assim, as células parentes e não parentes podem ser diferenciadas com base em um limite de distância. No entanto, para determinar o limiar, as distribuições vizinhas mais próximas para células parentes e não parentes precisam ser desconvolvidas. Felizmente, as distribuições de vizinhos mais próximos para células não parentes podem ser estimadas avaliando os valores de vizinhos mais próximos de cada célula para a célula mais próxima que carrega um fluoróforo diferente. Aqui, a metodologia é apresentada para determinar estatisticamente uma distância limite para definir clonalidade e para atribuir uma probabilidade de parentesco entre as células.

1. Usando os arquivos .csv obtidos na seção 5, calcule as distâncias vizinhas mais próximas para cada célula dentro de uma fatia de coração. Compile esses resultados em distâncias dentro do canal (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange e mCherry-mCherry) e entre canais (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry e mCherry-mCerulean). Salve os resultados em dois arquivos .csv: um para distâncias dentro do canal e outro para distâncias entre canais.
   1. Instale o código Python²⁵ que requer as bibliotecas numpy e pandas.
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. Calcule distâncias e exporte arquivos .csv para distâncias dentro do canal e distâncias entre canais usando o python snippet_6_1.py.
2. Leia as distâncias dentro e entre canais em um quadro de dados R²⁶ , convertendo os identificadores cardíacos em uma variável categórica. Aplique um limite escolhido ad-hoc observando os histogramas do vizinho mais próximo (Figura 3A, C) para minimizar os valores discrepantes. Certifique-se de escolher um limite que cubra mais de 90% das distâncias entre canais e dentro do canal, excluindo a cauda longa para evitar o ajuste excessivo ao ruído em grandes distâncias vizinhas mais próximas. Este protocolo usa um limite de 400 μm (Figura 3). Use Rscript snippet_6_2.R para executar esta etapa.
   NOTA: Alternativamente, pode-se modelar várias fatias como variáveis individuais. Este protocolo limita a complexidade do modelo ao nível do coração para facilitar a modelagem e a estimativa.
3. Obtenha os logaritmos naturais para as distâncias dentro do canal e entre canais. Como as células ocupam espaço e não são entidades pontuais, a distribuição mínima da distância do vizinho mais próximo é centrada em torno de um valor diferente de zero e tem caudas assimétricas, uma vez que a distância máxima entre pares de células pode ser substancialmente maior do que os valores medianos (Figura 3A, C). Use a distribuição log-normal para modelar tais distribuições (Figura 3B,D). Faça isso usando Rscript snippet_6_3.R.
4. Use o seguinte modelo bayesiano para estimar as médias e variâncias das distribuições de parentesco (α₂, σ²₂) e não-parentesco (α₁, σ²₁) e a probabilidade de distâncias dentro do canal decorrentes da distribuição de parentesco (π=e^β/(1+e^β)):
   dist.bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   onde Unif(a,b) é a distribuição uniforme no intervalo [a,b], N(μ,σ²|l2 restrito ao intervalo (l,u), T₁(0,1|x>0) é a distribuição de Cauchy padrão (T com 1 grau de liberdade) restrita à meia reta positiva, bw.dist_i é a^i-ésima distância do par entre canais registrada e wi.dist_i é a^i-ésima distância do par dentro do canal. Observe que as distâncias registradas dentro do canal têm uma distribuição de mistura de dois componentes refletindo a mistura de pares de células parentes e não parentes.
   1. Forneça ao modelo priors informativos, se possível. Por exemplo, este protocolo espera que as células parentes estejam mais próximas umas das outras do que as células não parentes, portanto, isso é fornecido como um prior para a média da distribuição das distâncias. Em seguida, use os pacotes runjags²⁷ e coda²⁸ R e o programa JAGS²⁹ para estimativa de parâmetros (Rscript snippet_6_4.R).
5. Execute o modelo JAGS com o número de cadeias correspondente ao número de CPUs disponíveis. Use Rscript snippet_6_5.R para executar esta etapa. Permita que o software seja executado até a convergência.
6. Use métricas para testar a convergência do algoritmo, como o tamanho efetivo da amostra (disponível com runjags), o diagnóstico de convergência de Gelman-Rubin (disponível com runjags) e sua autocorrelação (autocorr/autocorr.diag disponível em coda). Verifique a qualidade do ajuste do modelo estimado para as distâncias do vizinho mais próximo inspecionando um gráfico Q-Q, que plota uma comparação em nível de quantil dos valores reais e estimados para as distâncias do vizinho mais próximo usando Rscript snippet_6_6.R (Figura 4C,F). Esse script requer que o usuário edite os valores nas linhas 25 a 29 do snippet_6_6.R com base na saída do Comando 6.
   NOTA: Idealmente, um tamanho amostral efetivo (SSeff) superior a 10.000 deve ser obtido para cada um dos parâmetros³⁰. No entanto, um SSeff maior que 2.500 pode ser adequado para alguns modelos complexos. O diagnóstico de Gelman Rubin é 1,00 para convergência perfeita e deve ser menor que 1,05 para convergência satisfatória. Alta autocorrelação indica mistura lenta dentro das cadeias e é um indicador de convergência lenta. O gráfico de autocorrelação deve seguir um decaimento exponencial no caso de um bom modelo. O gráfico Q-Q das distribuições reais e modeladas do vizinho mais próximo (Figura 4C,F) deve seguir a diagonal o mais próximo possível.
7. Depois de verificar a precisão dos modelos, obtenha a probabilidade de um par de células ser parente em função de sua distância. Para determinar uma distância limite para determinar se as células dentro do canal provavelmente são parentes, identifique a distância na qual a probabilidade de parentesco cai abaixo de 0,5. Isso pode ser feito usando o Rscript snippet_6_7.R.
   NOTA: Limites alternativos podem ser escolhidos com base em objetivos experimentais. Para algumas aplicações, os limiares podem não ser relevantes e a probabilidade de ser um par de parentesco pode ser usada diretamente para pesar pares de células.

Resultados

Seguindo o protocolo para criolesão neonatal, deve-se produzir corações P21 com e sem lesão. Os corações criolesionados têm uma lesão bem circunscrita, enquanto a superfície dos corações simulados é lisa e homogênea. Em corações criolesionados, a área da lesão deve ser consistente de coração para coração. Após a microscopia, imagens semelhantes à Figura 1 devem ser obtidas. Observe que a resolução da imagem permite a identificação de CMs individuais e as condições de imagem permitem que cada...

Discussão

O rastreamento de linhagem multicolorida é uma abordagem poderosa para identificar padrões de crescimento de órgãos com resolução de célula única. No entanto, uma grande limitação ao rastreamento de linhagem multicolorida é a necessidade de rotulagem esparsa de células, o que pode reduzir a sensibilidade para identificar eventos raros. Para órgãos como o coração com níveis notoriamente baixos de renovação de células parenquimatosas, isso pode levar a subestimar as respostas de cresciment...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
#1.5 lamínula de vidro	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Meio de montagem anti-desbotamento	FisherScientific	00-4958-02
Câmara
Cryomolds
	VWR	15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Cubos de
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw ratos
Software ImageJ			https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 criostato
Microtesoura de Nitrogênio Líquido
, 6mm	Ratos World Precision Instruments	14003
Myh6-CreERT2	O Laboratório Jackson	005657
Needler titular	World Precision Instruments	14109
Paraformaldeído 4%	FisherScientific
Fosfato tampolado com solução salina
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Shaker
Rotativo Estereoscópio
Sacarose 30% (peso / vol)	FisherScientific	BP220
Tesoura de dissecação cirúrgica	World Precision Instruments	14393
Seringa para tamoxifeno	VWR	BD328438
Tamoxifeno, 20 μ g	Sigma	T5648
Mídia de congelamento de tecidos	VWR	15148-031
Branco Fosco / Plus slides	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 sistema
Zen 2.5 Blue software