Uma técnica de mancha ocidental de ultra-alta velocidade é desenvolvida melhorando a cinética da ligação antígeno-anticorpo através da tecnologia de drenagem e reposição cíclica (CDR) em conjunto com um agente de aumento de imunoreaction.
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Artigo de método
Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é um método canônico para pesquisa biomédica. É comumente usado para determinar o tamanho relativo e abundância de proteínas específicas, bem como modificações de proteína pós-translacional. Esta técnica tem uma rica história e permanece em uso generalizado devido à sua simplicidade. No entanto, o procedimento de mancha ocidental leva horas, até dias, para ser concluído, com um gargalo crítico sendo os longos tempos de incubação que limitam seu rendimento. Estas etapas de incubação são necessárias devido à lenta difusão de anticorpos da solução a granel para os antígenos imobilizados na membrana: a concentração de anticorpos perto da membrana é muito menor do que a concentração a granel. Aqui, apresentamos uma inovação que reduz drasticamente esses intervalos de incubação, melhorando a ligação de antígeno através da drenagem cíclica e reposição (CDR) da solução de anticorpos. Também utilizamos uma tecnologia de aprimoramento da imunoreação para preservar a sensibilidade do ensaio. Uma combinação do método CDR com um agente de aumento de imunoreaction comercial aumentou o sinal de saída e reduziu substancialmente o tempo de incubação de anticorpos. A mancha ocidental de ultra-alta velocidade resultante pode ser realizada em 20 minutos sem qualquer perda de sensibilidade. Este método pode ser aplicado a manchas ocidentais usando a detecção de chemiluminescente e fluorescente. Este protocolo simples permite que os pesquisadores explorem melhor a análise da expressão proteica em muitas amostras.
Introdução
Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é uma técnica poderosa e fundamental em uma ampla gama de disciplinas científicas e clínicas. Esta técnica é usada para examinar a presença, abundância relativa, massa molecular relativa e modificações pós-translacionais de proteínas1. Combinado com a análise digital de imagens, este método pode analisar de forma confiável a abundância de proteínas e modificações proteicas2. Embora a mancha ocidental seja realizada rotineiramente, é um método demorado e intensivo em mão-de-obra. São necessárias longas incubações do anticorpo com membranas. Aqui, descrevemos uma modificação do método de incubação que supera essa limitação sem sacrificar a sensibilidade.
Durante a incubação da membrana, os anticorpos flutuam em solução enquanto os antígenos são imobilizados na membrana. Devido à sua alta afinidade, a taxa de ligação de anticorpos ao antígeno é mais rápida do que a difusão de anticorpos da solução a granel para a membrana. Isso cria uma baixa concentração "camada de esgotamento"(Figura 1). Pode levar horas para anticorpos mais distantes chegarem à membrana por meio da difusão passiva, que é o principal fator responsável por longos tempos de incubação nesta técnica. Esse efeito é chamado de limitação de transporte de massa (MTL)3. Foi proposto que a drenagem repetitiva e a reposição da solução contendo anticorpos podem interromper a camada de esgotamento e superar o MTL4. Aqui, elaboramos uma técnica única que implementa este conceito de drenagem e reposição cíclica (CDR) para diminuir o efeito do MTL em um protocolo tradicional de manchas ocidentais e comentou encurtar o período de incubação necessário.
Para manter a sensibilidade de detecção com um curto tempo de incubação, fizemos uso de uma tecnologia de aprimoramento da imunoreaction que acelera a reação de anticorpos de antígeno, melhorando assim a relação sinal-ruído5. Muitos agentes de imunoreação disponíveis comercialmente (IRE) consistem em 2 componentes (Solução 1 e 2, ver Tabela de Materiais). A composição proprietária ou mecanismo de ação do IRE não foi divulgada, mas descobrimos anteriormente que o IRE diminuiu a constante de dissociação entre o antígeno e o anticorpo em ensaios de ligação de fase sólida, indicando que o aumento da afinidade é, pelo menos em parte, responsável pelo efeito de aumento do IRE6. A combinação de CDR com IRE produz um protocolo de manchas ocidentais de ultra-alta velocidade que reduz todo o tempo de procedimento sem sacrificar a sensibilidade.
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Protocolo
1. SDS-PAGE e transferência para uma membrana PVDF
- Execute o SDS-PAGE para separar proteínas com base no tamanho relativo.
NOTA: Qualquer sistema de gel comercial ou caseiro está bem. Por favor, siga o protocolo do fabricante. - Transfira proteínas separadas de um gel para uma membrana PVDF.
NOTA: Os métodos comuns de transferência (transferência semi-seca ou úmida) são adequados. Por favor, siga o protocolo do fabricante.
2. Bloqueio de membranas PVDF
- Incubar as membranas em tampões de bloqueio apropriados por 1h com agitação à temperatura ambiente.
NOTA: Dependendo do sistema de anticorpos e detecção primário, um buffer de bloqueio apropriado deve ser selecionado. Por exemplo, os bloqueadores mais típicos são BSA, leite seco sem gordura, caseína e polímeros sintéticos comerciais. PBS e/ou TBS com 0,1% Tween20 são os buffers mais utilizados. Esta etapa de bloqueio pode ser feita durante a noite a 4 °C.
3. Incubação com anticorpo primário
- Prepare 10% de imunoreaction melhorando a solução agent-1 (IRE-1) com água destilada. Vórtice bem.
- Prepare o anticorpo primário diluído com 10% de IRE-1. Misture-o suavemente e bem.
- Se usar uma membrana maior (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm), adicione 8 mL da solução de anticorpos em tubos de centrífuga cônica de 50 mL. Se utilizar uma membrana menor (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm), adicione 3 mL da solução de anticorpos em tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mL(Tabela de Materiais).
- Pegue a membrana PVDF com pinças e drene brevemente a solução de bloqueio. Insira a membrana PVDF neste tubo com os dedos enluvados e certifique-se de que toda a membrana adere à parede do tubo. Quando a membrana PVDF é inserida em um tubo, encare o "lado proteico" da membrana que estava originalmente em contato com o gel para dentro. Feche a tampa com força.
- Insira o tubo de 50 mL em uma garrafa de vidro para o forno de hibridização.
NOTA: Quando forem utilizados tubos de 14 mL para esta incubação, insira um tubo de 14 mL no tubo de 50 mL, utilizando um par de suportes de anel plástico para manter o tubo interno no centro do tubo de 50 mL. - Ligue o forno de hibridização.
- Incubar a membrana com rotação de 6 rpm por pelo menos 5 min.
NOTA: Certifique-se de que a membrana adere à parede o tempo todo e que o tubo (interno) esteja horizontal para cobrir a membrana uniformemente com a solução de anticorpos. Calibrar a diluição do anticorpo e o tempo de incubação antes do experimento real.
4. Lavagem de membrana
- Pare a rotação.
- Remova cuidadosamente a membrana PVDF do tubo com pinças e coloque a membrana em um recipiente com 50 mL de PBS-T.
- Enxágüe a membrana brevemente com PBS-T.
- Enxágüe a membrana no recipiente com água destilada até que não apareçam bolhas. Isto é para remover a maioria do anticorpo.
- Transfira a membrana PVDF do recipiente para o rotador de salada que contém 250 mL de PBS-T.
- Coloque a cesta de coador no rotador. Certifique-se de que a tampa foi colocada com segurança.
- Ative o rotador e execute-o por cerca de 20-30 s.
- Descarte a solução e enxágue brevemente o interior do rotador com água destilada.
- Adicione 250 mL de PBS-T no spinner novamente.
- Repita as etapas 4.6 e 4.7.
5. Incubação com o anticorpo secundário
- Prepare 10% de imunoreaction melhorando a solução agent-2 (IRE-2) com água destilada. Vórtice bem.
- Prepare o anticorpo secundário diluído com 10% de IRE-2. Misture-o suavemente e bem.
- Selecione o volume da solução de anticorpos e do tubo conforme indicado na etapa 3.3.
- Pegue a membrana PVDF com pinças e drene a solução brevemente. Insira a membrana PVDF no tubo conforme indicado na etapa 3.4.
- Insira o tubo de 50 mL em uma garrafa de vidro para o forno de hibridização.
- Ligue o forno de hibridização.
- Incubar a membrana com rotação de 6 rpm por pelo menos 5 min. Certifique-se de que a membrana adere à parede o tempo todo e que o tubo (interno) esteja horizontal para cobrir uniformemente a membrana com a solução de anticorpos.
NOTA: Calibrar o tempo de incubação antes do experimento real. Quando o anticorpo secundário for fluorescentemente conjugado, realize a incubação no escuro.
6. Lavagem de membrana
- Siga os passos 4.1 às 4:10.
7. Aquisição de imagens
- Detecção de chemiluminescente
- Coloque um pedaço de filme flexível semi-transplante (10 cm x 15 cm) em uma superfície plana.
- Misture 2 componentes do substrato chemiluminescente em um tubo de 5 mL.
- Transfira imediatamente 1,5 mL do substrato misto para a filmagem flexível semi-transplante e coloque a membrana PVDF sobre ele. Em seguida, transfira o resto da solução do substrato para a membrana.
- Incubar a membrana PVDF com o substrato misto em uma película flexível semi-transparente por 1 min.
- Pegue a membrana PVDF com pinças e escorra brevemente a solução do substrato.
- Sanduíche a membrana entre um par de filmes de transparência.
- Adquira a imagem sob o modo chemiluminescent.
- Detecção fluorescente
- Pegue a membrana PVDF com pinças e drene a solução brevemente.
- Sanduíche a membrana entre um par de filmes de transparência.
- Adquira a imagem sob o modo fluorescente.
NOTA: As etapas 7.1 e 7.2 devem ser realizadas nas proximidades da máquina de imagem para garantir a máxima sensibilidade. - Quando o sinal de fundo estiver alto, realize um passo de lavagem em um recipiente com 80-100 mL de PBS-T: 10 min enxágue 3 vezes para o anticorpo primário e 5 min enxágue 6 vezes para o anticorpo secundário.
NOTA: Tanto os anticorpos primários quanto secundários diluídos com soluções IRE de 10% podem ser usados até 8-10 vezes sem perda de sensibilidade6. A solução deve ser mantida em 4 °C por até 1 mês.
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Resultados
Este exemplo ilustra a eficácia do método CDR juntamente com a tecnologia de imunoenhancing na mancha ocidental. A incubação estática foi realizada em uma película flexível semi-transparente onde as membranas PVDF foram incubadas com a solução de anticorpos, enquanto a incubação da CDR estava em um forno de hibridização por tubos rotativos que continham as membranas e a solução de anticorpos (Movie). A Figura 2 mostrou quantidades de antígeno e anticorpo, respectivamente, necessários para a ...
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Discussão
A mancha ocidental é uma técnica analítica amplamente utilizada para detectar proteínas específicas que foram desenvolvidas ~40 anos atrás7,8. Desde então, a técnica continuou a evoluir, com inovações subsequentes melhorando a sensibilidade, velocidade e quantitação da técnica2,9,10,11,12,
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Divulgações
Os autores declararam que não há interesses concorrentes diretamente relevantes para o conteúdo deste artigo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa Intramuros, Instituto Nacional de Coração, Pulmão e Sangue, Institutos Nacionais de Saúde. A S.H. foi apoiada pelo Programa de Estudos de Estudantes de Parceria Público-Privada do Japão no Exterior, e H.N. e K.Y. foram pela Valor e V Drug Overseas Training Scholarship.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de ensaio PP de alta clareza de fundo redondo de 14 mL, graduado, com tampa de pressão | Falcon | 352059 | |
| Apollo Filme de transparência para impressoras a laser | N / A | N / A | Qualquer tipo de filme de transparência para impressora a laser está bem. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Qualquer tipo de sistema de aquisição de imagem é adequado para detecção quimioluminescente e/ou fluorescente. |
| Pode obter a solução do realçador da imunorreação do sinal | TOYOBO | NKB-101 | |
| Cravo Cravo Seco Imediato Sem Gordura Cravo | N/A | ||
| ECL anti-rato IgG, peroxidase de rábano ligada F(ab')2 fragmentos de ovinos | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-coelho IgG, peroxidase de rábano ligada F(ab')2 fragmentos de burro | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Qualquer forno de hibridização é bom, desde que os tubos sejam girados uniformemente na posição horizontal. |
| Membrana Immobilon-P PVDF, 0.45 µ m tamanho do poro | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Cabra anti-camundongo IgG anticorpo secundário | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Cabra anti-coelho IgG anticorpo secundário | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserva Substrato quimioluminescente | seracare | 5430-0049 | |
| Camundongo anti-ß anticorpo de actina | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer para detecção fluorescente |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Qualquer spinner de salada é bom, desde que as membranas de PVDF sejam enxaguadas vigorosamente sem rasgar. |
| Filme de Vedação Parafilm | Bemis | Parafilm M PM996 | filme flexível semi-transparente |
| Tampas de rosca de polietileno Flat-Top para tubos de centrífuga de fundo cônico de 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Anéis para segurar o tubo de 14 ml no centro do tubo de 50 ml | N/A | N/A | Preparado em uma oficina mecânica |
| Coelho anti-6X Seu anticorpo de etiqueta | Abcam abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
Referências
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Reimpressões e permissões
