Artigo de método

Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction

DOI:

10.3791/61657

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26 de setembro de 2020

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1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

Neste artigo

Resumo

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Uma técnica de mancha ocidental de ultra-alta velocidade é desenvolvida melhorando a cinética da ligação antígeno-anticorpo através da tecnologia de drenagem e reposição cíclica (CDR) em conjunto com um agente de aumento de imunoreaction.

Resumo

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Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é um método canônico para pesquisa biomédica. É comumente usado para determinar o tamanho relativo e abundância de proteínas específicas, bem como modificações de proteína pós-translacional. Esta técnica tem uma rica história e permanece em uso generalizado devido à sua simplicidade. No entanto, o procedimento de mancha ocidental leva horas, até dias, para ser concluído, com um gargalo crítico sendo os longos tempos de incubação que limitam seu rendimento. Estas etapas de incubação são necessárias devido à lenta difusão de anticorpos da solução a granel para os antígenos imobilizados na membrana: a concentração de anticorpos perto da membrana é muito menor do que a concentração a granel. Aqui, apresentamos uma inovação que reduz drasticamente esses intervalos de incubação, melhorando a ligação de antígeno através da drenagem cíclica e reposição (CDR) da solução de anticorpos. Também utilizamos uma tecnologia de aprimoramento da imunoreação para preservar a sensibilidade do ensaio. Uma combinação do método CDR com um agente de aumento de imunoreaction comercial aumentou o sinal de saída e reduziu substancialmente o tempo de incubação de anticorpos. A mancha ocidental de ultra-alta velocidade resultante pode ser realizada em 20 minutos sem qualquer perda de sensibilidade. Este método pode ser aplicado a manchas ocidentais usando a detecção de chemiluminescente e fluorescente. Este protocolo simples permite que os pesquisadores explorem melhor a análise da expressão proteica em muitas amostras.

Introdução

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Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é uma técnica poderosa e fundamental em uma ampla gama de disciplinas científicas e clínicas. Esta técnica é usada para examinar a presença, abundância relativa, massa molecular relativa e modificações pós-translacionais de proteínas1. Combinado com a análise digital de imagens, este método pode analisar de forma confiável a abundância de proteínas e modificações proteicas2. Embora a mancha ocidental seja realizada rotineiramente, é um método demorado e intensivo em mão-de-obra. São necessárias longas incubações do anticorpo com membranas. Aqui, descrevemos uma modif....

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Protocolo

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1. SDS-PAGE e transferência para uma membrana PVDF

  1. Execute o SDS-PAGE para separar proteínas com base no tamanho relativo.
    NOTA: Qualquer sistema de gel comercial ou caseiro está bem. Por favor, siga o protocolo do fabricante.
  2. Transfira proteínas separadas de um gel para uma membrana PVDF.
    NOTA: Os métodos comuns de transferência (transferência semi-seca ou úmida) são adequados. Por favor, siga o protocolo do fabricante.

2. Bloqueio de membranas PVDF

  1. Incubar as membranas em tampões de bloqueio apropriados por 1h com agitação à temperatura ambiente.
    NOTA: Dependendo do sistema de anticorpos e dete....

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Resultados

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Este exemplo ilustra a eficácia do método CDR juntamente com a tecnologia de imunoenhancing na mancha ocidental. A incubação estática foi realizada em uma película flexível semi-transparente onde as membranas PVDF foram incubadas com a solução de anticorpos, enquanto a incubação da CDR estava em um forno de hibridização por tubos rotativos que continham as membranas e a solução de anticorpos (Movie). A Figura 2 mostrou quantidades de antígeno e anticorpo, respectivamente, necessários para a .......

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Discussão

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A mancha ocidental é uma técnica analítica amplamente utilizada para detectar proteínas específicas que foram desenvolvidas ~40 anos atrás7,8. Desde então, a técnica continuou a evoluir, com inovações subsequentes melhorando a sensibilidade, velocidade e quantitação da técnica2,9,10,11,12,

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Divulgações

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Os autores declararam que não há interesses concorrentes diretamente relevantes para o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa Intramuros, Instituto Nacional de Coração, Pulmão e Sangue, Institutos Nacionais de Saúde. A S.H. foi apoiada pelo Programa de Estudos de Estudantes de Parceria Público-Privada do Japão no Exterior, e H.N. e K.Y. foram pela Valor e V Drug Overseas Training Scholarship.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de ensaio PP de alta clareza de fundo redondo de 14 mL, graduado, com tampa de pressãoFalcon352059
Apollo Filme de transparência para impressoras a laserN / AN / AQualquer tipo de filme de transparência para impressora a laser está bem.
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600Qualquer tipo de sistema de aquisição de imagem é adequado para detecção quimioluminescente e/ou fluorescente.
Pode obter a solução do realçador da imunorreação do sinalTOYOBONKB-101
Cravo Cravo Seco Imediato Sem Gordura CravoN/A
ECL anti-rato IgG, peroxidase de rábano ligada F(ab')2 fragmentos de ovinosGE HealthcareNA9310V
ECL anti-coelho IgG, peroxidase de rábano ligada F(ab')2 fragmentos de burroGE HealthcareNA9340V
HYBAID Micro-4N/AN/AQualquer forno de hibridização é bom, desde que os tubos sejam girados uniformemente na posição horizontal.
Membrana Immobilon-P PVDF, 0.45 µ m tamanho do poroMillipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD Cabra anti-camundongo IgG anticorpo secundárioLICOR926-68070
IRDye 800CW Cabra anti-coelho IgG anticorpo secundárioLICOR926-32211
KPL LumiGLO Reserva Substrato quimioluminescenteseracare5430-0049
Camundongo anti-ß anticorpo de actinaMillipore SigmaA5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)LICOR927-40100Blocking Buffer para detecção fluorescente
OXO Salad SpinnerOXO32480V2BQualquer spinner de salada é bom, desde que as membranas de PVDF sejam enxaguadas vigorosamente sem rasgar.
Filme de Vedação ParafilmBemisParafilm M PM996filme flexível semi-transparente
Tampas de rosca de polietileno Flat-Top para tubos de centrífuga de fundo cônico de 50 mLFalcon352070
Anéis para segurar o tubo de 14 ml no centro do tubo de 50 mlN/AN/APreparado em uma oficina mecânica
Coelho anti-6X Seu anticorpo de etiquetaAbcam abcamab9108
Tween20Millipore SigmaP2287

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. ....

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