Descelularização sem detergente do pâncreas humano para produção de matriz extracelular (MEC) solúvel

Riccardo Tamburrini; Deborah Chaimov; Amish Asthana; Carlo Gazia; Kevin Enck; Sean  M. Muir; Justine  Mariam Aziz; Sandrine Lablanche; Emily Tubbs; Alice  A. Tomei; Mark Van Dyke; Shay Soker; Emmanuel  C. Opara; Giuseppe Orlando

doi:10.3791/61663

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Artigo de método

Descelularização sem detergente do pâncreas humano para produção de matriz extracelular (MEC) solúvel

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DOI:

10.3791/61663

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4 de setembro de 2020

Riccardo Tamburrini¹^,²^,³ , Deborah Chaimov¹^,³ , Amish Asthana¹^,³ , Carlo Gazia³^,⁴ , Kevin Enck³ , Sean M. Muir⁵ , Justine Mariam Aziz⁶ , Sandrine Lablanche⁷ , Emily Tubbs⁷ , Alice A. Tomei⁸^,⁹ , Mark Van Dyke¹⁰ , Shay Soker³ , Emmanuel C. Opara³ , Giuseppe Orlando¹^,³

¹Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, ²Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, ³Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, ⁴Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome, ⁵Wake Forest University College of Arts and Science, ⁶Wake Forest University School of Medicine, ⁷Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, ⁸Department of Biomedical Engineering, University of Miami, ⁹Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, ¹⁰Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

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Resumo

O protocolo descrito neste manuscrito explica as etapas para a fabricação de uma matriz extracelular solúvel (MEC) a partir do pâncreas humano. O pó de ECM solubilizado obtido através deste protocolo pode ser usado para a recapitulação do microambiente das ilhotas pancreáticas in vitro e, potencialmente, in vivo.

Resumo

O transplante de ilhotas (ITx) tem o potencial de se tornar o padrão de tratamento na medicina de reposição de células beta, mas seus resultados permanecem inferiores aos obtidos com o transplante de pâncreas inteiro. Os protocolos atualmente utilizados para o isolamento das ilhotas humanas estão sob escrutínio porque se baseiam na digestão enzimática do órgão, por meio da qual o pâncreas é demolido, suas conexões com o corpo são perdidas e as ilhotas são irreversivelmente danificadas. O dano das ilhotas é caracterizado por fatores críticos, como a destruição da matriz extracelular (MEC), que representa a estrutura 3D do nicho das ilhotas e cuja perda é incompatível com a eufisiologia das ilhotas. Os pesquisadores estão propondo o uso de andaimes baseados em ECM derivados do pâncreas de mamíferos para resolver esse problema e, finalmente, melhorar a viabilidade, função e vida útil das ilhotas. Os métodos atualmente disponíveis para obter esses andaimes são agressivos porque são em grande parte à base de detergente. Assim, propomos um novo método sem detergente que cria menos danos à ECM e pode preservar componentes críticos da ECM pancreática. Os resultados mostram que o protocolo de descelularização recém-desenvolvido permitiu a obtenção da depuração completa do DNA enquanto os componentes da ECM foram retidos. A MEC obtida foi testada quanto à citotoxicidade e encapsulada com ilhotas pancreáticas humanas que apresentaram comportamento celular positivo com secreção de insulina quando estimuladas com desafio de glicose. Coletivamente, propomos um novo método para a descelularização do pâncreas humano sem o uso de detergentes químicos iônicos e não iônicos convencionais. Este protocolo e o ECM obtido com ele podem ser úteis para aplicações in vitro e in vivo.

Introdução

O isolamento das ilhotas pancreáticas é um processo meticuloso realizado através da digestão enzimática das conexões entre as ilhotas e sua estrutura de suporte extracelular circundante. Essa destruição da matriz extracelular (MEC) é um dos fatores críticos na caracterização dos danos das ilhotas que ocorrem durante os processos de isolamento 1,2,3,4. A MEC peri-ilhota é um componente acelular essencial do pâncreas endócrino. É composto por proteínas e polissacarídeos, que interagem e se reticulam para forma....