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Biology

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz

Published: October 6, 2020 doi: 10.3791/61665
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,3
1Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University-University of Adelaide Joint Centre for Agriculture and Health, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 2College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Heifei, China, 3School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

Este trabajo describe el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para eliminar el gen endógeno OsABCG15 seguido de un protocolo de transformación mediado por Agrobacteriummodificado para producir una línea estable de color masculino-estéril en el arroz.

Abstract

La esterilidad masculina es un rasgo agronómico importante para la producción de semillas híbridas que generalmente se caracteriza por defectos funcionales en órganos reproductores/gametos masculinos. Los avances recientes en la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 permiten una alta eficacia de edición y mutaciones eliminatorias de los genes candidatos endógenos en sitios específicos. Además, la transformación genética mediada por Agrobacteriumdel arroz es también un método clave para la modificación de genes, que ha sido ampliamente adoptado por muchos laboratorios públicos y privados. En este estudio, aplicamos las herramientas de edición del genoma CRISPR-Cas9 y generamos con éxito tres líneas mutantes estériles masculinas mediante la edición específica del genoma de OsABCG15 en un cultivar de japonica. Utilizamos un método modificado de transformación de arroz mediado por Agrobacteriumque podría proporcionar excelentes medios de emasculación genética para la producción de semillas híbridas en el arroz. Las plantas transgénicas se pueden obtener en un plazo de 2 a 3 meses y los transformantes homocigotos se examinaron mediante el genotipado mediante amplificación de PCR y secuenciación de Sanger. La caracterización fenotípica básica de la línea homocigota estéril masculina se realizó mediante observación microscópica de los órganos reproductores masculinos de arroz, análisis de viabilidad del polen por yoduro de potasio yodo (I2-KI)tinción semi-delgada sección transversal de los anteras en desarrollo.

Introduction

El arroz es el cultivo alimentario más importante, particularmente en los países en desarrollo, y representa un alimento básico para más de la mitad de la población mundial. En general, la demanda de grano de arroz está creciendo y se prevé que aumente un 50% para 2030 y un 100% para 20501,2. Las futuras mejoras en el rendimiento del arroz tendrán que capitalizar diversos recursos moleculares y genéticos que hacen del arroz un modelo excelente para la investigación monocoqueledonosa de las plantas. Estos incluyen un sistema de transformación eficiente, mapa molecular avanzado y base de datos accesible al público de etiquetas de secuencia expresadas, que se han generado a lo largo de muchos años3,,4. Una estrategia para mejorar el rendimiento de los cultivos es la producción de semillas híbridas5,cuyo elemento central es la capacidad de manipular la fertilidad masculina. Comprender el control molecular de la fertilidad masculina en los cultivos de cereales puede ayudar a traducir los conocimientos clave en técnicas prácticas para mejorar la producción de semillas híbridas y mejorar la productividad de los cultivos6,,7.

La transformación genética es una herramienta clave para la investigación básica y la agricultura comercial, ya que permite la introducción de genes extraños o la manipulación de genes endógenos en las plantas de cultivo, y resulta en la generación de líneas modificadas genéticamente. Un protocolo de transformación adecuado puede ayudar a acelerar los estudios de biología genética y molecular para la comprensión fundamental de la regulación genética8. En las bacterias, la transformación genética tiene lugar de forma natural; sin embargo, en las plantas, se realiza artificialmente utilizando técnicas de biología molecular9,,10. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram-negativa transmitida por el suelo que causa la enfermedad de la agalla de la corona en las plantas mediante la transferencia de ADN-T, una región de su plásmido Ti, a la célula vegetal a través de un sistema de secreción tipo IV11,12. En las plantas, la transformación mediada por A. tumefaciensse considera un método generalizado para la modificación del gen, ya que conduce a la integración estable y bajo del número de copia del ADN-T en el genoma del huésped13. El arroz transgénico se generó por primera vez a través de la transformación genética mediada por Agrobacteriuma mediados de la década de 1990 en el cultivarjaponica 14. Usando este protocolo, se obtuvieron varias líneas transgénicas en un período de 4 meses con una eficiencia de transformación del 10%-30%. El estudio indicó que hay dos pasos críticos para la transformación exitosa: uno es la inducción del callo embrionario a partir de semillas maduras y otro es la adición de acetosyringona, un compuesto fenólico, al cultivo bacteriano durante el cultivo, que permite una mayor eficiencia de transformación en plantas14,,15. Este protocolo ha sido ampliamente utilizado con alteraciones menores en japonica16,17,18,19 así como otros cultivares como indica20,,21,22,23 y tropical japonica24,25. De hecho, más del 80% de los artículos que describen la transformación del arroz utilizan la transformación genética mediada por Agrobacteriumcomo herramienta13. Hasta la fecha, se han desarrollado varios protocolos de transformación genética utilizando semillas de arroz como material de partida para la inducción de callos16,17,18,19. Sin embargo, se sabe muy poco sobre la inflorescencia joven como explantas para la producción de callos. En general, es importante establecer un protocolo rápido, reproducible y eficiente de transformación y regeneración genética para la genómica funcional y estudios sobre la mejora de los cultivos.

En los últimos años, el avance de la tecnología CRISPR-Cas9 ha dado lugar a un mecanismo preciso de edición del genoma para comprender la función génica y ofrecer mejoras agronómicamente importantes para la cría de plantas26,,27. CRISPR también ofrece una considerable promesa para la manipulación del desarrollo reproductivo masculino y la producción híbrida. En este estudio, utilizamos un sistema de eliminación de genes utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 y lo acoplamos a un protocolo eficiente de transformación del gen del arroz utilizando inflorescencias jóvenes como explantas, creando así líneas estériles masculinas estables para el estudio del desarrollo reproductivo.

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Protocol

1. construcción de vectores de expresión vegetal sgRNA-CAS9 y transformación mediada por Agrobacterium

  1. Dirigirse a un gen estéril macho OsABCG15 en arroz según la literatura publicada28.
  2. Diseñe sgRNA para el sitio de destino ubicado entre 106-125 bp en el segundo exón de OsABCG15 (Figura 1).
  3. Utilice T4 polinucleótidos quinasa para sintetizar los oligos de sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' y 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCTTGAGGTGATGCTT').
  4. Utilice endonucleasa BbsI para digerir el vector de estructura básica psgR-Cas929.
  5. Ligar los oligos de sgRNA sintetizados con la columna vertebral linealizada psgR-Cas9 utilizando ligasa T4 siguiendo el protocolo del fabricante.
  6. Usando HindIII/EcoRI, digiere el casete sgRNA del paso 1.5 y el subclón en el sitio HindIII/EcoRI del vector binario pCAMBIA1300 para una transformación estable29.
  7. Confirmar el plásmido construido por digestión enzimática y secuenciación. Más tarde, transformar la construcción binaria en la cepa Agrobacterium tumefaciens EHA105 y cultivarlas en placas de selección Kan/Rif a 28 oC durante 2-3 días.

2. Transformación genética del arroz y cultivo de tejidos vegetales

  1. Inducción y regeneración del callo
    NOTA: Utilice inflorescencias de arroz joven fresco como material de partida para inducir callo (Figura 2).
    1. Recoger las inflorescencias jóvenes del arrozal o casa verde en la etapa de meiosis, determinada por la longitud del florete de 1,6-4,8 mm (Figura 2A)29. Asegúrese de que las inflorescencias de arroz estén cubiertas con vaina de hoja. Limpie cada inflorescencia con un hisopo de alcohol al 70% y déjelo secar antes de cortar.
    2. Lleve la inflorescencia a un banco estéril limpio. Cortarlo en trozos pequeños (cuanto más pequeño mejor) con tijeras esterilizadas y luego transferir esquejes a una placa Petri que contenga el medio NBD2 (Figura 2B, Tabla 1).
    3. Incubar la placa en la oscuridad a 26oC durante unos 10-14 días para inducir callo (Figura 3A).
      NOTA: Utilice el callo recién formado para la infiltración de Agrobacterium (paso 2.2.7) directamente o vuelva a condicionar una vez más en medio NBD2 fresco para obtener más callos. Transfiera el callo al nuevo medio NBD2 cada 8-10 días.
  2. Transformación y co-cultivo
    1. Utilice la bacteria A. tumefaciens que contiene el plásmido binario del paso 1.6 para la transformación. Conservar las cepas de A. tumefaciens en el medio YEB(Tabla 1) con 50% de glicerol a -80 oC para su uso posterior.
    2. Racha A. tumefaciens de una población de glicerol de -80 oC hasta un medio de agar YEB que contiene antibióticos selectivos(Tabla 1) y crece a 25–28 oC durante 48-72 h, para permitir que aparezcan colonias.
    3. Inocular una sola colonia de la placa YEB con antibióticos selectivos a 5 ml de medio líquido YEB que contenga los mismos antibióticos selectivos (Tabla 1), en un tubo de ensayo estéril cónico de 50 ml. Agitar en un agitador orbital a 250 x g,a 25–28 oC hasta que las bacterias crezcan a un OD600 de 0,5.
    4. Añadir 1 ml de suspensión bacteriana a 100 ml de medio YEB(Tabla 1) con los mismos antibióticos selectivos en un matraz cónico de 250 ml y agitar en un agitador orbital a 250 x g,a 28 oC durante 4 h.
    5. Centrifugar a 4.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para recoger bacterias. Deseche el sobrenadante.
    6. Resuspender el pellet bacteriano con medio AAM-AS(Tabla 1) y diluir la suspensión a un OD600 a 0,4.
      NOTA: El OD perfecto de la suspensión bacteriana es fundamental para una transformación eficiente. Ayuda a eliminar el crecimiento bacteriano excesivo en el callo.
    7. Recoger alrededor de 150 calli embriogénicos frágiles de color amarillo claro sano del paso 2.1.3 en un matraz estéril de 150 ml. Añadir 50–75 ml de suspensión de células bacterianas del paso 2.2.6 en el matraz estéril, y luego añadir unos 10–25 ml de medio AAM-AS fresco para sumergir la cali durante 10-20 minutos, temblando ocasionalmente.
    8. Vierta cuidadosamente la suspensión bacteriana del matraz y seque el exceso de suspensión bacteriana del callo utilizando papel de filtro estéril #1 o papel tisú. A continuación, colóquelos en un plato de Petri con medio NBD-AS (Tabla 1) cubierto con un papel de filtro estéril #1. Incubar a 25–28 oC en la oscuridad durante 3 días y comprobar si hay crecimiento excesivo bacteriano.
  3. Selección para callos resistentes
    1. Después de 3 días de co-cultivo, transfiera el callo a un plato estéril de Petri con un papel de filtro estéril.
    2. Secar al aire la calla durante 2 horas en un banco limpio. Asegúrese de que el callo no esté adherido al papel de filtro.
    3. Transfiera las pinzas uniformemente utilizando pinza estéril al medio de selección primario NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de cronotina)(Tabla 1). Calli de la cultura durante 2 semanas a 25-28 oC en la oscuridad.
    4. Después de 2 semanas, transfiera las callos de forma uniforme a una placa nueva que contenga un medio de selección fresco NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de tiempo) (Tabla 1). Cultivar el calli durante otras 2 semanas a 25-28 oC en la oscuridad.
  4. Diferenciación de Callus
    1. Transfiera el callo al medio MS fresco (con 25 mg/L de higromicina y 150 mg/L de tiempo) (Tabla 1). Cultura bajo la luz a 25-28 oC durante alrededor de 2 semanas.
    2. Repita el paso 2.4.1 una vez más.
    3. Transfiera los brotes al nuevo medio de LA MS (con 10 mg/L de higromicina) para proliferar más brotes.
  5. Inducción de raíz
    1. Transfiera los nuevos brotes a un medio MS de 1/2 (Tabla 1). Cultivo bajo la luz a 25oC - 28oC. Las plantas transformadas producen raíces en 2 semanas.
    2. Después de 1 semana, transferir las plantas a macetas limpias que cubren la planta para evitar la deshidratación.

3. Identificación genotipo

  1. Recoger hojas jóvenes de plantas de nueva generación para la extracción total de ADN utilizando el método de bromuro de amonio de cepiltrimetil (CTAB)31.
  2. Utilizando el ADN genómico como plantilla, elija las imprimaciones (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' e Higromicina-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' ubicadas en la región de Higromicina) para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para validar la integración y frecuencias de transgén(Figura 4). Las siguientes condiciones de PCR: 94 oC durante 5 min; 36 ciclos (94oC para 30 s; 56oC para 30 s; 72oC durante 1 min); 72oC durante 7 min. Las reacciones PCR exitosas producen un amplicon de 604 bp.
  3. Realizar otro PCR para amplificar la región genómica que rodea los sitios de destino CRISPR utilizando imprimaciones específicas (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTCTCAACAGTTTCT 3' y OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTAAATTACATTGCTAT 3') para identificar el genotipo de los transformadores. Las condiciones PCR son las mismas que en el paso 3.2.
  4. Utilice fragmentos de PCR del paso 3.3 directamente para la secuenciación de Sanger para identificar mutaciones.

4. Observar el fenotipo básico del mutante

  1. Preparar la solución I2-KI: disolver 2 g de KI (yoduro de potasio) en 10 ml de agua destilada y luego añadir 0,2 g de I2 (yodo resublimed) en él. Después de mezclar, llevar el volumen total a 100 ml con agua destilada.
  2. Preparar la solución FAA (63% etanol anhidro, 5% ácido acético glacial, 5% formaldehído y 27% agua) y mezclar antes de usar.
  3. Preparar la solución de tinción azul toluidina al 0,5%: disolver 0,5 g de azul toluidina en 100 ml de agua destilada.
  4. Realizar la observación fenotípica vegetativa, mediante la toma de imágenes de todas las plantas con una cámara digital.
  5. Realizar la observación del fenotipo reproductivo, eliminar la palea y el lema del florete. Tome fotos de las dedos enteros bajo un estereomicroscopio.
  6. Observe la viabilidad del polen por tinción de yodo.
    1. Escoge espiguillas de arroz maduros antes de la antítesis de la flor, retira la palea y el lema para liberar las anteras.
    2. Tome 6 anras y colóquelas en un portaobjetos de vidrio. Añadir 1 gota de agua destilada, aplastar bien la antera con pinzas para liberar los granos de polen, y luego añadir 2-3 gotas de I2-KI solución. Cubra con el cubreobjetos.
    3. Observar bajo un microscopio de bajo aumento. Los granos de polen teñidos de negro muestran una viabilidad más vigorosa, ningún color o amarillo-marrón teñido se atrofian o degeneran.
  7. Realizar una sección semifina de arroz anther
    1. Fije las flores de arroz de diferentes etapas del desarrollo en una solución de la FAA. Vacíe los materiales a 4oC (generalmente 15 min) para permitir que el fijador penetre en los tejidos hasta que el material se hunda hasta el fondo de la botella de recogida.
    2. Reemplace con una nueva solución FAA al día siguiente. Una vez que el material se hunda hasta el fondo, sustituir con 70% de etanol y almacenar a 4 oC para uso a largo plazo.
    3. Deshidratar los materiales con diferentes gradientes de etanol (70%, 80%, 95% cada vez durante 30 min, 100% etanol para 2 h, 100% etanol que contiene un poco de tinte Safranin durante 2 h).
      NOTA: Agregue un poco de tinte de Safranin en el segundo etanol 100% para colorear las anteras para seccionarlas más fácilmente después.
    4. Realice la incrustación siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). A continuación, hornee en un horno a 60oC durante 48 horas antes de seccionar.
    5. Secise la muestra a un espesor de 2 m utilizando un microtoma. Agregue una gota de agua en el tobogán de vidrio. A continuación, recoger las secciones delgadas que contienen bloques de antera por fórceps y ponerlos en la superficie de la gota de agua en los portaobjetos.
    6. Coloque los portaobjetos en el baño de agua a 50 oC para esparcir completamente las secciones y dejar que se adhiera firmemente al tobogán.
    7. Utilice una solución azul toluidina al 0,5% para manchar los portaobjetos durante 30 min. A continuación, enjuague con agua y séquelo en la campana de humos. Sellar con pegamento de árbol neutro. Coloque suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos y séquelo en la campana de humos.
    8. Observar y fotografiar la muestra bajo un microscopio.

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Representative Results

Aquí se demuestra el uso de la tecnología de edición de genes para crear una línea estéril masculina para futuras investigaciones por Agrobacterium-transformación genética mediada en el arroz. Para crear la línea estéril masculina de osabcg15,se utilizó mutagénesis mediada por CRISPR-CAS9 para la construcción de vectores binarios. El sgRNA fue impulsado por el promotor OsU3, mientras que el casete de expresión de hSpCas9 fue impulsado por el promotor 35S doble, y el vector medio fue ensamblado en un solo vector binario pCAMBIA1300 diseñado para Agrobacterium- transformación estable mediada del arroz. En la Figura 1Ase proporciona una representación gráfica de la construcción que se utilizó para la mutagénesis del arroz mediada por CRISPR/Cas9.

La Figura 2 y la Figura 3 representan todo el procedimiento de producción de transgénes de arroz. Las inflorescencias jóvenes fueron elegidas como explantas (Figura 2) e indujeron el callo embrionario friable (FEC) dentro de los 14 días de la inoculación en el medio NBD2 (Figura 3A). Los calli embriogénicos se utilizaron directamente para la transformación mediada por Agrobacterium(Figura 3C) o subcultura para la proliferación para obtener más calli para la infección posterior (Figura 3B). Después de co-cultivar durante 48 h en nbD2-AS medio en condiciones oscuras (Figura 3D), las calíd como se desplazaron a una segunda ronda de medio de selección. Después de 10-14 días, los calli transformados mostraron algunos pequeños microcalli recién formados en la periferia de la madre calli, mientras que el color de los callos no transformados se convirtió en marrón y murió finalmente(Figura 3E,F). Más tarde, las calis de color sanas y cremosas fueron transferidas al medio de regeneración dos veces. En esta etapa, el calli transformado mostró gradualmente manchas verdes (brotes de brotes) (Figura 3G,H). Estos puntos verdes recién generados se cultivaron en una botella de plástico estéril que contiene un medio de regeneración para permitir el crecimiento del brote(Figura 3I),y luego se desplazaron (como brotes frescos) a un medio de 1/2 MS para inducir raíces. Más tarde, se cosecharon brotes de cultivo sanos y vigorosos con raíces bien desarrolladas (Figura 3J).

En total, se obtuvieron 21 plántulas regeneradas. La amplificación de PCR para la región de higromicina mostró que 18 de 21 pueden amplificar la banda correspondiente, indicando que estas líneas son transgénicas(Figura 4),y la frecuencia de transformación correspondiente es de aproximadamente 85,71%(Tabla 2). Los transformantes fueron genotipados para identificar las mutaciones en el sitio o sitios objetivo de sgRNA utilizando imprimaciones que abarcan la región objetivo por PCR amplicon y secuenciación de Sanger, Entre 18 T0 plantas transgénicas, ocho líneas heterocigotas y tres líneas homocigotas fueron CRISPR-Cas9 positivas, con las correspondientes frecuencias de mutación del 61,11%(Figura 1B, Tabla 2).

Los mutantes nocautut homocigotos fueron validados por la observación básica de órganos reproductores masculinos(Figura 5). Las anras de osabcg15 eran más pequeñas y más pálidas que las del tipo silvestre(Figura 5A,D),y carecían de granos de polen maduros (Figura 5B,E). Se realizó una microscopía de sección transversal para investigar los defectos morfológicos anther en osabcg15 en comparación con el tipo salvaje. En la etapa 10, las microoras de tipo salvaje se volvieron redondas y vacuoladas con exines de color azul oscuro (Figura 5C). Por el contrario, las microorasporas osabcg15 colapsaron y degradaron, sólo existen escombros de microsporas degeneradas en el lóculo de la antera (Figura 5F).

Figure 1
Figura 1: Construir información para el sistema CRISPR/Cas9 y mutagénesis específica de la OsABCG15. (A) El sgRNA fue impulsado por el promotor OsU3, mientras que la expresión casete de hSpCas9 fue impulsada por el doble promotor 35S; el vector medio se ensambló en un único vector binario diseñado para la transformación estable mediada por Agrobacteriumdel arroz. (B) La secuencia (5'-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3') situada en el segundo exón del gen OsABCG15 fue seleccionada como el sitio objetivo del sgRNA. Se generaron tres tipos de eventos de mutación homocigotos por CRISPR-Cas9 en el fondo japonica cultivar 9522, y se muestran cromatogramas de secuenciación Sanger de sitios de mutación inducida por CRISPR-Cas9. La línea 9522osabcg15-1 tiene una inserción de un solo nucleótido (1-nt) 'A'; la línea 9522osabcg15-2 tiene una inserción de un solo nucleótido (1-nt) 'G'; y la línea 9522osabcg15-3 tiene una eliminación de un solo nucleótido (1-nt) 'G'. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Materiales de partida para inducir callos. (A) Inflorescencias de arroz joven en fase de meiosis. (B) Inflorescencias jóvenes diseccionadas que crecen en el medio NBD2. Barra de 2 cm de in (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Procedimiento para la producción de líneas transgénicas por Agrobacterium-transformación mediada. (A) Arroz calli generado a partir de las jóvenes inflorescencias. (B) Subcultura de calli. (C) Incubación de calli con A. tumefaciens. (D) Cocultivo de calli con A. tumefaciens. (E) Primer ciclo de selección de callos transformados en presencia de higromicina (40 mg/L). (F) Segundo ciclo de selección de callos transformados en presencia de higromicina (40 mg/L). (G) Primera regeneración de callos transformados. (H) La segunda regeneración de callos transformados, observando el punto de tiro verde en la placa de cultivo. (I) Disparar la cultura de inducción. (J) Inducción de raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis de las frecuencias de transformación de las plántulas de arroz regeneradas. Los productos de PCR amplificados que muestran un fragmento de 604 bp (1–8, 10–14, 16–20) después de 1.5% de electroforesis de gel de agarosa indican líneas positivas transgénicas. Las líneas que carecen del fragmento no estántransformadas (9, 15, 21), similares al control de tipo salvaje (WT). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Observación fenotípica básica del tipo salvaje (9522) y mutante 9522osabcg15-1. (A) Flor mutante de tipo salvaje (9522) y (D) 9522osabcg15-1 después de la eliminación del lema y la palea. gl, glume; fi, filamento; lo, lodicule; pi, pistil; st, estambre. (B) I2-KI tinción de granos de polen maduros de tipo silvestre (9522) y (E) 9522osabcg15-1 línea. (C) Análisis del desarrollo de las anteras en el tipo salvaje (9522) y (F) 9522osabcg15-1 mutante por observación transversal de la sección. DMsp, microsporas degeneradas; E, epidermis; En, endotecio; Msp, microesporo; T, tapetum. Barras de 2 mm en (A) y( D), 100 m en (B) y (E), 50 m en (C) y (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composiciones de los medios para la transformación del arroz. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Transformación y eficiencia de edición genética de los mutantes de OsABCG15 generados por CRISPR-Cas9 en la generación T0. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Los mutantes estériles masculinos artificiales son generados tradicionalmente por mutagénesis física, química o biológica aleatoria. Aunque se trata de técnicas poderosas, su naturaleza aleatoria no capitaliza la gran cantidad de conocimiento genómico moderno que tiene el potencial de ofrecer mejoras personalizadas en la cría molecular32. El sistema CRISPR-Cas9 ha sido ampliamente utilizado en plantas debido a sus medios simples y asequibles para manipular y editar ADN29,,33; tiene potencial para ahorrar tiempo en comparación con los métodos tradicionales de mutagénesis.

Aquí, desarrollamos un conveniente sistema de transformación mediado por Agrobacteriumutilizando inflorescencias jóvenes como explantas para la inducción del callo. Hay algunos pasos en el procedimiento de transgene que se pueden omitir para ahorrar tiempo. El uso de inflorescencias jóvenes como material de partida es una buena opción para minimizar la duración total de la inducción del callo en comparación con el uso de semillas como explantas. Además, la diferenciación celular y la capacidad de regeneración son muy fuertes en los callos obtenidos de las inflorescencias jóvenes. En este proceso, se puede evitar la subcultura de los callos de arroz, lo que eventualmente ahorra tiempo y reduce el riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. Por otra parte, timentin se utilizó como un antibiótico en lugar de carenicillina, que es más eficaz en la inhibición de bacterias.

El estudio y el protocolo introducido para la observación fenotípica básica del desarrollo reproductivo masculino en el arroz es útil para estudiantes de pregrado y posgrado que están interesados en la biología reproductiva vegetal. Este protocolo conveniente debe ser rápido de agarrar y reproducible para su uso en estudios de investigación posteriores.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer a Xiaofei Chen por proporcionar las inflorescencias de arroz joven y la asistencia en la elaboración del medio de cultivo del tejido de arroz. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900611).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Naphthaleneacetic acid Sigma-Aldrich N0640
2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid Sigma-Aldrich D7299
6-Benzylaminopurine (6-BA) Sigma-Aldrich B3408
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Agar Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000561
Ammonium sulfate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10002918
Aneurine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218
Bacteriological peptone Sangon Biotech A100636
Beef extract Sangon Biotech A600114
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10004808
Calcium chloride dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20011160
Casein acid hydrolysate Beijing XMJ Scientific Co., Ltd C184
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10007216
Copper(II) sulfate pentahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10008218
D(+)-Glucose anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63005518
D-sorbitol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63011037
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Sigma-Aldrich E5134
EOS Digital SLR and Compact System Cameras Canon EOS 700D
Formaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010018
Fully Automated Rotary Microtome Leica Biosystems Leica RM 2265
Glacial acetic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000208
Glycine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62011516
Hygromycin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd H370
Inositol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63007738
Iodine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011517
Iron(II) sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012116
Kanamycine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd K378
Kinetin Sigma-Aldrich K0753
L-Arginine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004034
L-Aspartic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004736
L-Glutamine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd G229
L-proline Beijing XMJ Scientific Co., Ltd P698
Magnesium sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013018
Manganese sulfate monohydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013418
Microscopes NIKON Eclipse 80i
MS Phytotech M519
Nicotinic acid Sigma-Aldrich N0765
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium chloride Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10016308
Potassium dihydrogen phosphate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017608
Potassium iodide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017160
Potassium nitrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6) Sigma-Aldrich 47862
Rifampicin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd R501
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019718
Sodium molybdate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019816
Stereo microscopes Leica Microsystems Leica M205 A
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10021418
Technovit embedding Kits 7100 Heraeus Teknovi, Germany 14653
Timentin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd T869
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Water bath for paraffin sections Leica Biosystems Leica HI1210
Yeast extract Sangon Biotech A515245
Zinc sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10024018

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References

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Xu, D., Mondol, P. C., Uzair, M., Tucker, M. R., Zhang, D. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice. J. Vis. Exp. (164), e61665, doi:10.3791/61665 (2020).

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