Artigo de método

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

DOI:

10.3791/61666

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14 de janeiro de 2021

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1Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine, 3Division of Germ Cell Biology, National Institute for Basic Biology, National Institutes of Natural Sciences, 4Department of Basic Biology, School of Life Science, Graduate University for Advanced Studies (Sokendai), 5Department of Animal Science and Biotechnology, School of Veterinary Medicine, Azabu University, 6Faculty of Science and Technology, Department of Applied Biological Science, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Resumo

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O isolamento dos espermatocitotas meioticos é essencial para investigar mecanismos moleculares subjacentes à meiose e espermatogênese. Embora existam protocolos de isolamento celular estabelecidos usando manchas hoechst 33342 em combinação com a classificação celular ativada pela fluorescência, ela requer classificadores celulares equipados com um laser ultravioleta. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular usando a mancha DyeCycle Violet (DCV), um corante de ligação de DNA de baixa citotoxicidade estruturalmente semelhante ao Hoechst 33342. O DCV pode ser animado por lasers ultravioleta e violeta, o que melhora a flexibilidade da escolha do equipamento, incluindo um classificador de células não equipado com um laser ultravioleta. Usando este protocolo, pode-se isolar três subpopulações de células vivas em prophase I meiotic, incluindo leptoteno/zygotene, paquitene e espermatocitotes diploteno, bem como espermatoides redondos pós-meioticos. Também descrevemos um protocolo para preparar suspensão de célula única de testículos de mouse. No geral, o procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (4-5 horas, dependendo do número de células necessárias), o que facilita muitas aplicações a jusante.

Introdução

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A espermatogênese é um processo complexo em que uma pequena população de células-tronco espermatogonial sustenta a produção contínua de um grande número de espermatozoides ao longo da vida adulta1,2. Durante a espermatogênese, a remodelação dinâmica da cromatina ocorre quando as células espermatogênicas sofrem meiose para produzir espermatóides haploides3,4,5. O isolamento dos espermatocitos meioticos é essencial para a investigação molecular, e várias abordagens diferentes para isolados espermatotocitos meioticos foram estabelecidas, incluindo separação baseada em sedimentação6,7 e triagem celular ativada por fluorescência (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, esses métodos têm limitações técnicas. Enquanto a separação baseada em sedimentação produz um grande número de células5,6,7, é trabalhosa. O método estabelecido baseado em FACS usa hoechst 33342 (Ho342) para separar espermatocitotas meioticos com base no conteúdo de DNA e propriedades de dispersão de luz e requer classificadores de células FACS equipados com um laser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Métodos alternativos baseados em FACS requerem linhas de camundongos transgênicos que expressam proteínas florescentes, sincronização da espermatogênese12, ou fixação celular e rotulagem de anticorpos que não são compatíveis com o isolamento das células vivas13. Embora exista outro método alternativo usando um corante de ligação de DNA permeável celular, DyeCycle Mancha verde14,15,16,17, este método é recomendado para o isolamento de células espermatogênicas de testis juvenis. Portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver um método de isolamento simples e robusto para espermatos meioticos vivos que podem ser aplicados a qualquer cepa de camundongos de qualquer idade e que pode ser realizado usando qualquer classificador de células FACS.

Aqui descrevemos um protocolo de isolamento celular tão procurado usando a mancha DyeCycle Violet (DCV). DCV é uma baixa citotoxicidade, corante de dna permeável celular estruturalmente semelhante ao Ho342, mas com um espectro de excitação deslocado para a faixa violeta18. Além disso, o DCV tem um espectro de emissões mais amplo em comparação com o DCG. Assim, ele pode ser animado por lasers UV e violeta, o que melhora a flexibilidade do equipamento, permitindo o uso de um classificador de células FACS não equipado com um laser UV. O protocolo DCV apresentado aqui usa separação bidimensional com azul DCV e vermelho DCV, imitando a vantagem do protocolo Ho342. Com essa vantagem, nosso protocolo DCV nos permite isolar células germinativas altamente enriquecidas dos testíis adultos. Fornecemos um protocolo de gating detalhado para isolar células espermatogênicas vivas de testículos de camundongos adultos de um rato (de dois testículos). Também descrevemos um protocolo eficiente e rápido para preparar a suspensão unicelular a partir de testículos de mouse que podem ser usados para este isolamento celular. O procedimento requer um curto período de tempo para ser concluído (preparação de suspensão de célula única - 1 hora, coloração de corante - 30 min, e classificação celular - 2-3 horas: total - 4-5 horas, dependendo do número de células necessárias; Figura 1). Após o isolamento celular, uma ampla gama de aplicações a jusante, incluindo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e cultura celular podem ser concluídas.

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Protocolo

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Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (protocolo nº. IACUC2018-0040) no Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati.

1. Instalação de equipamentos e reagentes para a preparação da suspensão das células testiculares

  1. Prepare cada estoque de enzimas na Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e armazene a -20 °C.(Tabela1).
    NOTA: Prepare-se a qualquer momento antes do experimento.
  2. Um dia antes do experimento: Reveste tubos coletores (tubos de 1,5 mL) com soro bovino fetal (FBS) a 4 °C durante a noite.
  3. No dia do experimento: Coloque o banho de água para 37 °C.
  4. Pré-aqueça o DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco a 37 °C e prepare 2 mL de tampão de dissociação de 1x para cada amostra antes do uso(Tabela 1) no tubo de centrífugas de 15 mL.
    NOTA: O tampão de dissociação de 2 mL está preparado para dois testículos. Para a receita de tampão de dissociação, consulte a Tabela 1.

2. Dissecção animal e preparação de suspensão de células testiculares

  1. Sacrifique um rato macho de 8 semanas saindo em uma câmara de dióxido de carbono por pelo menos 10 minutos.
  2. Remova ambos os testículos e coloque em uma placa de Petri de 60 mm contendo 2 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato gelado (PBS).
  3. Remova a tunica albuginea dos testículos. Disperse ligeiramente os túbulos seminiferos separando-se suavemente com fórceps.
  4. Transfira os túbulos seminiferos para uma placa de Petri de 100 mm com uma nova gota de PBS gelado e untangle túbulos seminiferos suavemente com fórceps. Repita esta lavagem 3 vezes para remover as células intersticiais o máximo possível.
  5. Incubar túbulos seminiferos desemaranhados em um tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão de dissociação a 37 °C por 20 min.
  6. Pipeta suavemente os túbulos 20 vezes usando uma micropipette de 1000 μL.
  7. Incubar por 6 minutos. Repita a pipetação suave 20 vezes.
  8. Incubar por 3 min. Repita a pipetação suave 10 vezes até que não permaneçam pedaços visíveis.
  9. Adicione 10 mL de tampão FACS à suspensão. Centrifugar a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente e descartar o supernatante.
  10. Repita o passo 2.9 duas vezes para remover o espermatozoides e o máximo de detritos possível.

3. Coloração celular

  1. Resuspenda a pelota celular com 3 mL de tampão FACS(Tabela 1) e filtrar a suspensão da célula através de um coador de célula de nylon de 70 μm em um tubo de 50 mL.
    NOTA: O rendimento esperado das células é de aproximadamente 100 milhões de células por dois testículos (de um rato b6 de 8 semanas).
  2. Conte o número da célula e divida 10% das células em um novo tubo como o controle negativo não manchado e deixe no gelo.
  3. Adicione 6 μL de mancha DE DCV (a concentração original é de 5 mM) à suspensão restante da célula e misture bem. A concentração final é de 10 μM, e a capacidade é de aproximadamente 100 milhões de células.
  4. Incubar a 37 °C por 30 min no escuro. Agite suavemente a suspensão da célula a cada 10 minutos.
  5. Após a incubação, sem um passo de lavagem, adicione diretamente 5 μL de DNase I (a concentração de estoque é de 10 mg/mL) à suspensão celular e filtre as células em um tubo FACS de 5 mL através da tampa de malha de nylon de 35 μm. Mantenha as amostras no gelo até a triagem.

4. Citometria de fluxo e portões experimentais

  1. Prepare o classificador de células FACS. Certifique-se de que o classificador de células FACS esteja equipado com óptica de excitação: laser Violet (405-nm); Óptica de detecção: combinação de filtro de 450/50 bandpass [mesmo conjunto de filtro de 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) para detecção azul DCV] e 665/30 bandpass [mesmo conjunto de filtro de Allophycocyanin (APC) para detecção dcv-vermelho]. Aqui usamos o classificador de células Sony SH800S como exemplo.
  2. Crie um novo experimento e configure os seguintes gráficos de trabalho exibindo parâmetros a serem otimizados: Clique em "Nova Densidade" na barra de menu "Worksheet Tools" para criar uma inclinação de dispersão para a frente - área (FSC-A) vs. dispersão traseira – área (BSC-A) gráfico de densidade em escala linear. Clique em "New Histogram" para criar um gráfico de histograma azul DCV em escala logarítmica.
  3. Brevemente vórtice do controle negativo não manchado (a partir da etapa 3.2) e carregar a amostra.
  4. Clique em "Iniciar" e "Gravar" para começar a processar a amostra não manchada. Enquanto a amostra estiver em execução, clique em "Detector & Threshold Settings" para otimizar as tensões FSC e BSC ajustando ambas as tensões do tubo fotomultiplier (PMT) para cima ou para baixo para colocar as células não manchadas na escala do gráfico FSC/BSC.
  5. Ajuste a tensão PMT para cima e para baixo em "FL1: DAPI" enquanto a amostra está correndo para localizar a posição da população DCV-negativa na primeira década do gráfico logarítmico de histograma azul DCV(Figura 2A). Após concluir o ajuste de tensão pmt, clique em "Stop" para descarregar a amostra não manchada.
  6. Brevemente vórtice da amostra (a partir da etapa 3.5) e carregar a amostra.
  7. Clique em "Next Tube" para criar uma nova planilha para a amostra manchada de DCV; e clique em "Start" e "Record" para adquirir a amostra manchada de DCV, gravar ≥ 1 x 106 eventos. Adicione as seguintes parcelas de trabalho: Clique em "Nova Densidade" na barra de menu " Ferramentasde Planilha" para criar um gráfico de densidade FSC-H (altura) vs. FSC-W (largura) em uma escala linear; Clique em "New Density" para criar um gráfico de densidade dcv-azul vs. DCV-vermelho em uma escala linear. Depois de gravar ≥ 1 x 106 eventos, clique em "Stop" e descarregue a amostra.
  8. No gráfico de densidade FSC-A vs. BSC-A, clique em "Polygon" na barra de menu "Plot Tools" para desenhar um grande portão "Cells" para incluir a maioria das células e excluir pequenos detritos(Figura 2B). Aplique o portão "Cells" ao gráfico de densidade FSC-H vs. FSC-W. Clique em "Retângulo" para desenhar um portão "Células Únicas" para excluir células não-únicas(Figura 2C).
  9. Aplique o portão "Células Únicas" ao gráfico de densidade dcv-azul vs. DCV-vermelho e ajuste a escala para capturar um perfil estendido, conforme mostrado na Figura 2D. Clique em "Polygon" na barra de menu "Plot Tools" para desenhar um portão "DCV" para excluir as células e população lateral não manchadas(Figura 2D).
  10. Aplique o portão "DCV" ao gráfico histograma azul DCV em uma escala linear. Os três principais picos referem-se a diferentes conteúdos de DNA: 1C, 2C e 4C(Figura 2E).
  11. Clique em "New Density" para criar um gráfico de densidade DCV-azul vs. DCV-vermelho em escala linear e aplique o portão "DCV" para executar a volta da Figura 2E para localizar as populações 1C e 4C(Figura 2F). Clique em "Elipse" para desenhar um portão sobre a população 1C, que está dentro de uma área condensada (portão 1C). Clique em "Polygon" para desenhar um portão na população 4C que é uma curva contínua (portão 4C).
  12. Clique em "New Density" para criar um gráfico de densidade dcv-azul vs. DCV-vermelho em escala linear e aplicar o portão "4C"; ajustar a escala para ampliar e clicar em "Polygon" para desenhar um portão "4C_1" para uma seleção mais precisa(Figura 2G).
  13. Clique em "Nova Densidade" para criar um novo gráfico de densidade FSC-A vs. BSC-A em escala linear e aplique o portão "4C_1"; haverá três populações enriquecidas separadas por tamanho correspondente aos espermatotozóides leptoteno (L) /zygotene (Z), pachytene (P) e diploteno (D). Clique em "Polygon" ou "Elipse" para desenhar 3 portões: "L/Z", "P" e "D" com base no tamanho crescente(Figura 2H).
  14. Clique em "New Dot Plot" para criar um gráfico de pontos dcv-azul vs. DCV-vermelho em escala linear para aplicar o portão e garantir que as três populações estejam em uma ordem contínua dentro do portão "4C_1"(Figura 2I).
  15. Da mesma forma, para a população 1C, clique em "Nova Densidade" para criar um novo gráfico de densidade FSC-A vs. BSC-A em escala linear e aplicar o portão "1C", selecione o tamanho unificado das células como população espermicida redonda pura, e clique em "Ellipse" para desenhar um portão "RS"(Figura 2J).

5. Classificar subpopulações de células germinativas masculinas

  1. Prepare tubos de 1,5 mL contendo 500 μL 50% FBS para coleta celular e carregue o tubo de coleta no coletor e clique em "Coleta de Carga".
  2. Clique em "Next Tube", "Start", "Record" e "Sort Start". Para o uso de um sistema bidirecano que permite que duas populações de interesse sejam classificadas ao mesmo tempo no dispositivo de coleta, siga combinações pareiras: leptoteno (L) /zygotene (Z) e espermatos de paquitene (P) à base de portões traseiros L/Z e P; Espermatozoides redondos (RS) e diploteno (D) com base nos back-gates RS e D.
  3. Enquanto a amostra estiver em execução, ajuste a taxa de fluxo para ~3000 eventos/s para obter a classificação mais eficiente.

6. Análise de pureza de células classificadas

  1. Coletar ≥ 10.000 células/cada população. Realizar imunostenção celular para confirmar o subestás.
  2. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C e descartar cuidadosamente o supernasal, mantendo cerca de 110 μL do líquido na parte inferior do tubo.
  3. Faça uma queda de 10 μL de suspensão celular para observar sob microscópio e avaliar a morfologia e o número da célula de visão geral.
  4. Aplique 100 μL de suspensão celular em cada um dos slides da câmara de amostra (ver Tabela de Materiais), e carregue as câmaras para o Citospin.
  5. Gire as amostras a 30 x g por 5 min a temperatura ambiente. Desenhe um círculo ao redor da célula com uma caneta hidrofóbica. Lâminas secas no banco do laboratório por alguns minutos em temperatura ambiente.
  6. Solte 50 μL de PBS no círculo do slide e toque.
  7. Adicione solução de anticorpos primários (Diluir anticorpos primários com soro de burro de 5% em PBS com 0,02% Polisorba 20) no círculo do slide e incubar a 4 °C durante a noite.
    NOTA: Para julgar a subsuseção de espermatos meioticos, foi detectado SYCP3, que é um marcador de eixos cromossomos médios, e γH2AX, que é um marcador de resposta a danos de DNA. (Para a concentração de trabalho de anticorpos, consulte a Tabela de Materiais).
  8. Toque na solução de anticorpos primária dos slides.
  9. Solte 50 μL de PBS no círculo do slide e toque. Repita uma vez.
  10. Adicione solução de anticorpos secundários (diluir anticorpos secundários em PBS com 0,02% Polisorba 20) no círculo do slide e incubar à temperatura ambiente por 1h no escuro.
  11. Solte 50 μL de PBS no círculo do slide e toque. Repita uma vez.
  12. Adicione 50 μL de dapi (concentração de estoque é de 0,1 μg/mL) por 5 min e bata fora.
  13. Adicione 1-2 gotas de mídia de montagem nos slides. Cubra cuidadosamente a mídia de montagem com um copo de cobertura e pressione suavemente o vidro de cobertura para remover mídia extra de montagem e bolha de ar. Os slides estão prontos para avaliação de microscopia.

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Resultados

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Um resultado representativo deste protocolo de classificação é mostrado na Figura 3. O tempo total de triagem de dois testículos (um rato) é geralmente em torno de 3 horas, o que depende da concentração da suspensão celular e da velocidade de classificação. Após a triagem, a pureza dos espermatocitodos é confirmada pela imunossuagem de SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). As frações representativas de L/Z, P, D espermatocyte estão em torno de 80,4%, 90,6% e 87,6%, respect...

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Discussão

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Aqui apresentamos um protocolo prático e simples para isolar subpopulações de espermatotozóides e espermatóides de um único rato adulto. Para garantir a reprodutibilidade deste protocolo, existem algumas etapas críticas que precisam de atenção. Antes da digestão enzimápica, a etapa de lavagem visa remover células intersticiais; após a digestão, esta etapa ajuda a remover espermatozoides e detritos. Lavar/centrifugar 3 vezes é importante. Em nossa receita tampão de dissociação, a combinação de várias enzimas diferentes fa...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos aos membros dos laboratórios Namekawa, Yoshida e Maezawa pela ajuda; Katie Gerhardt para a edição do manuscrito; Mary Ann Handel por compartilhar o anticorpo H1T, o Núcleo de Citometria de Fluxo de Fluxo do Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC) para compartilhar os equipamentos FACS suportados pelo NIH S10OD023410; Subvenção em Auxílio para Pesquisa Científica (KAKENHI; 17K07424) para T.N.; Bolsa de Pós-Doutorado da Fundação Lalor para a A.S.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) para S.Y.; o Projeto de Pesquisa Grant pela Divisão de Serviços de Pesquisa da Universidade de Azabu, Programa de Branding de Pesquisa da Universidade Privada (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) e a Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) para S.M.; Instituto Nacional de Saúde R01 GM122776 para S.H.N.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 1,5 mlWatson131-7155C
100 mm Placa de PetriCorning, Falcon351029
Tubo de centrífuga de 15 mLWatson1332-015S
Tubo de poliestireno de 5 ml com tampa de pressão do filtro de células (35 µ m malha de nylon)Corning, Falcon352235
Tubo de centrífuga de 50 mLWatson1342-050S
60 mm placa de PetriCorning, Falcon351007
70 µ m malha de nylonCorning, Falcon352350
Classificador de célulasSonySH800S
Centrífuga
Colgenase, recombinante, sem origem animalFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-23141
Colgenase, Tipo 1WorthingtonLS004196
Vidro de coberturaFisher12-544-G
Cytospin 3Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)FisherD1306: 0,1 μ g/mL
Dnase ISigmaD5025-150KU
Soro de burroSigmaS30-M
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS)Gibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885076
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000044
Histone H1t anticorpopresente de Mary Ann Handel1/2000 diluído
Hank' s solução salina balanceada (HBSS)Gibco14175095
Hialuronidase de testículos bovinosSigmaH3506-1G
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)SigmaP5493-4L
Pipetadores
ProLong Gold Antifade MountantFisherP36930
anticorpo rH2AXMillipore05-635concentração de trabalho: 2 μ g/mL
Proteína de Fertilização de Esperma 56 (Sp56) anticorpoQED Bioscience55101concentração de trabalho: 0,5 μ g/mL
Esterilizado fórceps
Superfrost /Plus Lâminas de MicroscópioFisher12-550-15
Anticorpo SYCP3Abcamab205846concentração de trabalho: 5 μ g / mL
TWEEN 20 (Polissorbato 20)SigmaP9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)InvitrogenV35003
Banho-maria
Concentração de trabalho e tesoura

Referências

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