Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A superfície ocular já foi considerada imuno-privilegiada e abiótica, mas recentemente parece que há uma pequena, mas persistente presença commensal. A identificação e o monitoramento de espécies bacterianas na mucosa ocular têm sido desafiadores devido à sua baixa abundância e disponibilidade limitada de metodologia adequada para crescimento e identificação commensais. Existem duas abordagens padrão: métodos de sequenciamento de cultura ou sequenciamento de DNA. O primeiro método é problemático devido às bactérias recuperáveis limitadas e a segunda abordagem identifica bactérias vivas e mortas levando a uma representação aberrante do espaço ocular. Desenvolvemos um método robusto e sensível para o isolamento bacteriano, baseando-se em técnicas de cultivo microbiológico padrão. Trata-se de uma técnica baseada em swab, utilizando um cotonete fino "em laboratório" que visa a conjuntiva inferior, seguido por um passo de amplificação para genera aeróbico aeróbico e facultativo. Este protocolo nos permitiu isolar e identificar espécies conjuntivistas como Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. A abordagem é adequada para definir a diversidade commensal em camundongos em diferentes condições de doença.
Introdução
O objetivo deste protocolo é aumentar o isolamento específico de micróbios aeróbicos e anaeróbicos viáveis e facultativos da conjuntiva ocular para caracterizar o microbioma ocular. Estudos extensivos têm perfilado comunidades mucosas commensais nos tratos da pele, intestino, respiratório e genital e mostram que essas comunidades influenciam o desenvolvimento do sistema imunológico e a resposta1,2,3. Comunidades commensais oculares têm sido demonstradas para mudar durante certas patologias da doença, como doença do olho seco4, síndrome de Sjogren
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo camundongos seguem as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Siga as diretrizes de segurança laboratorial (conforme orientado pelo departamento de Saúde e Segurança Ambiental Institucional) ao trabalhar com microrganismos e materiais potencialmente contaminados. Utilize recipientes de resíduos adequados e procedimentos de descontaminação antes do descarte de materiais contaminados potencialmente de risco biológico.
1. Preparação do cotonete de olhos, configuração de campo de trabalho, limpeza de olhos de rato e enriquecimento de amostras
- Prepare cotonetes estéreis....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Os resultados representativos para uma placa de cotonete dos olhos que demonstram diferentes métodos de chapeamento são retratados na Figura 3A mostrando isolados morfologicamente diversos do mouse C57BL/6. Para cada isolado distinto, as colônias foram contadas na faixa e a abundância relativa, unidades de formação de colônias únicas (UFC) por cotonete de olhos, calculadas e plotadas para fins de comparação. Para caracterização microbiológica, as bactérias foram colhidas a partir de placas i.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Devido ao estado paucibacteriano da superfície ocular, muitos laboratórios têm tido dificuldade em isolar as commensals oculares7,20, resultando em baixo número de amostras com crescimento, baixa abundância e baixa diversidade8. Este método melhora significativamente as práticas de cultura padrão4,21 pela adição de uma etapa de enriquecimento, bem como um cotonete ocular redesenhad.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Nenhum conflito de interesses para revelar.
Agradecimentos
O financiamento do P30 DK034854 apoiou a VY, LB e estudos no Massachusetts Host-Microbiome Center e financiamento do NIH/NEI R01 EY022054 apoiado MG.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,1 a 10 µ l ponta de pipeta | USA Scientific | 1110-300 | autoclave antes do uso |
| 0.5 a 10 µ l Eppendorf pipeta | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| seringa de 1 ml | Fisher Scientific | BD309623 | 1 seringa para cada grupo de cotonetes oculares |
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave antes do uso |
| µ ponta de pipeta micro; USA | Scientific | 1111-2021 | autoclave antes do uso |
| 200 a 1000µ l Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| agulha 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 agulha por grupo de cotonete ocular |
| 3% Peróxido de hidrogênio | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubadora | Equipamento | ||
| 70% Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (xilazina 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Equipamento | ||
| Toalhas de papel limpas | Laboratório equipamento | ||
| Rebatidas de algodão / algodão laminado estéril | CVS | ||
| Pipetas descartáveis de 1 ml | Fisher Scientific | 13-711-9AM | para testes de coloração de Gram e catalase |
| E.coli< / em> | ATTC ATCC | 8739 | |
| Lâminas de vidro | Fisher Scientific | 12-550-A3 | para testes de coloração de Gram e catalase |
| Cetamina ( 100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | loja em 4 ° C até a hora de usar |
| Ágar Sal de Manitol | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare as placas de acordo com as instruções do mfr, armazene a 4 ° C por 1 semana |
| Ratos | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | 08-757-12 | para Manitol Placas de ágar sal |
| RPI Meio de Infusão Cérebro Coração | Fisher Scientific | 50-488525 | preparar de acordo com as instruções e autoclave |
| SteriFlip (0.22 µ tamanho do poro m sulfona de poliéster) | EMD / Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | esterilizar anestesia |
| Tubo de centrífuga Corning estéril | Preparação | de | anestesia |
| Gaiola de rato estéril | Equipamento | ||
| Palitos de dente (bambu redondo) | Autoclave Kitchen Essentials antes do | uso e preparação | |
| do cotoneteÁgar Trypticase Soja II com 5% de Placas de Sangue de Ovelha | Fisher Scientific | 4321261 | loja a 4 ° C até a hora de usar |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS Solução de matriz CHCA | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Colírio de uso único Colírio | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb, 28 frascos, 0,02 fl oz. cada |
Referências
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
