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Isolamento de tecidos de alta pureza do desenvolvimento de sementes de cevada

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DOI:

10.3791/61681

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26 de outubro de 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento manual de alta pureza e controle de qualidade de tecidos maternos de embriões, endospermas e sementes durante todo o desenvolvimento de sementes de cevada.

Resumo

Compreender os mecanismos que regulam o desenvolvimento de sementes de cereais é essencial para o melhoramento de plantas e aumento da produtividade. No entanto, a análise de sementes de cereais é desafiadora devido ao tamanho minúsculo, ao caráter líquido de alguns tecidos e às estreitas conexões entre tecidos. Aqui, demonstramos um protocolo detalhado para dissecação do embrião, endosperma e tecidos maternos da semente nos estágios inicial, intermediário e tardio do desenvolvimento da semente de cevada. O protocolo é baseado em uma dissecção manual do tecido usando ferramentas de ponta fina e um microscópio binocular, seguido de controle de pureza baseado em análise de ploidia. Os tecidos maternos e embriões da semente são diplóides, enquanto o endosperma é tecido triploide. Isso permite o monitoramento da pureza da amostra usando citometria de fluxo. Medições adicionais revelaram a alta qualidade do RNA isolado de tais amostras e sua usabilidade para análise de alta sensibilidade. Em conclusão, este protocolo descreve como dissecar praticamente tecidos puros do desenvolvimento de grãos de cevada cultivada e potencialmente também de outros cereais.

Introdução

As sementes são estruturas complexas compostas por vários tecidos de origem materna e filial1. Os grãos de cereais representam um tipo especial de semente, sendo a maior parte formada por endosperma, um tecido triploide especializado que protege e nutre o embrião. Os cereais fornecem cerca de 60% dos recursos alimentares globais e são a produção mais valiosa da produção vegetal2. O conhecimento dos processos moleculares que controlam o desenvolvimento de sementes de cereais é importante devido à sua proeminência econômica e papel central na reprodução das plantas 1,3.

A cevada cultivada (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5,1 Gbp) é a quarta cultura de cereais mais importante do mundo. É usado para ração animal, alimentos e biotecnologia4. Além disso, é também uma espécie modelo de cultura cerealífera clássica de zona temperada de importância crescente5. Os recursos genômicos da cevada incluem mapas genéticos, coleções de cultivares, variedades locais e mutantes, montagens e anotações de genoma de alta qualidade, bem como dados transcriptômicos dos principais estágios de desenvolvimento 5,6,7. Além disso, os genes da cevada são usados para melhoramentos genéticos de outros cereais. A resistência a estresses abióticos, como seca e salinidade, patógenos específicos e alto teor de compostos benéficos (por exemplo, β-glucano) tornam a cevada uma fonte valiosa de características para o melhoramento de trigo8.

O desenvolvimento das sementes é iniciado pela fertilização no dia da polinização (DOP). A DOP é definida pela avaliação da morfologia do estigma e das anteras de acordo com a escala de Waddington (W10.0)9. As espigas contendo flores não polinizadas foram caracterizadas por estigma compacto (não ramificado) e anteras verdes, enquanto as espigas polinizadas continham espigas estendidas, estigma estendido e amplamente ramificado, óvulo inchado, anteras abertas e pólen livre. As flores no DOP representaram um fenótipo intermediário. As anteras tinham uma cor amarela, se rompiam facilmente e depois liberavam pólen. O estigma tinha ramos sigmáticos amplamente difundidos do pistilo (Figura 1C).

O desenvolvimento de sementes de cevada inclui três estágios parcialmente sobrepostos 1,10. O estágio I (0 – 6 dias após a polinização; DAP) é iniciada por dupla fertilização, caracterizada pela proliferação celular e ausência de síntese de amido; estágio II (7 – 20 DAP) compreende diferenciação e grande ganho de biomassa acompanhados pela produção de moléculas de armazenamento de amido e proteínas; O estádio III (após 21 DAP) corresponde à maturação das sementes, redução de peso por dessecação e início da dormência. Alternativamente, as fases são chamadas de precoce, média e tardia, respectivamente11.

O grão de cevada é coberto por cascas, que consistem no lema, palea e glumas12. Na maioria dos genótipos de cevada, as cascas envolvem firmemente as sementes secas. A própria semente é formada pelo embrião, endosperma e tecidos maternos da semente (Figura 1A). O embrião diplóide se origina da fertilização do óvulo por um núcleo de espermatozóide. Na semente totalmente desenvolvida, o embrião consiste no eixo embrionário com a coleoriza circundando a radícula, o coleóptilo envolvendo o meristema da parte aérea e as folhas primárias e o escutelo (cotilédone)1,10,13,14. O endosperma triploide é o resultado da fertilização da célula central diplóide pelo segundo núcleo espermático. A proliferação do endosperma começa com o estágio sincicial (cenócito), onde os núcleos em divisão são empurrados para a periferia pelo vacúolo central. No final da fase sincicial, os microtúbulos formam uma rede radial ao redor dos núcleos e indicam a formação da parede celular anticlinal e o início da celularização do endosperma. A diferenciação do endosperma ocorre simultaneamente com a celularização e resulta em cinco tecidos principais: o endosperma amiláceo, as células de transferência, as camadas de aleurona e subaleurona e a região circundante do embrião. Os tecidos maternos das sementes são uma estrutura diplóide multicamadas de origem materna contendo pericarpo e tegumentosde sementes 10,12. Os tecidos maternos da semente incluem uma projeção nucelar no lado dorsal do grão que tem uma função relacionada ao transporte e fica embutida no endosperma em estágios posteriores do desenvolvimento da semente15.

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Figura 1: Desenvolvimento de sementes de cevada. (A) O desenho esquemático do grão de cereal no plano sagital com os tecidos maternos da semente indicados (SMTs, verde), endosperma (END, amarelo), embrião (EMB, laranja) e cascas (H, cinza). (B) Morfologia da espiga de cevada próxima à antese. Barra de escala = 1 cm. (C) Morfologia do estigma e anteras nos estágios antes, durante e após a polinização. A inserção mostra detalhes do estigma com grãos de pólen (pontas de setas). Barra de escala = 5 mm, barra de inserção = 200 μm. (D) Cortes sagitais e transversais de 4, 8, 16 e 24 sementes de DAP. (NP, projeção nucelar) Barra de escala = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O progresso recente na genômica de alto rendimento fornece as ferramentas para o estudo do desenvolvimento de tecidos de sementes individuais. No entanto, o grande obstáculo desse propósito é a estrutura compacta e a adesão firme dos tecidos das sementes1. Desenvolvemos um protocolo para dissecação de tecidos de sementes de alta pureza desde o desenvolvimento de sementes de cevada com possibilidade de uso subsequente para análises altamente sensíveis, como sequenciamento de RNA. Além disso, o protocolo apresentado pode ser facilmente adaptado a outros cereais.

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Protocolo

1. Plantas em crescimento

NOTA: Considerando que uma única planta de cevada geralmente tem de 5 a 6 perfilhos e apenas as 5 a 6 espiguetas do meio de cada espiga devem ser usadas para dissecação, então um rendimento máximo por planta é de 72 sementes para cultivares de duas fileiras e 216 sementes para cultivares de seis fileiras.

  1. Para germinar sementes de cevada, prepare uma placa de Petri acolchoada com três camadas de papel de seda de celulose coberto com uma camada de papel de filtro. Hidrate-o com água destilada, para que não haja excesso de água, coloque as sementes na superfície e feche a placa de Petri. O papel de filtração evita o crescimento das raízes através do tecido de celulose. Germinar as sementes durante 3 dias a 25 °C no escuro.
    NOTA: Como alternativa, germine as sementes colocando-as diretamente em uma mistura de solo úmido (consulte a etapa 1.2).
  2. Transfira as sementes germinadas com uma radícula visível e um broto de cerca de 5 cm para vasos de turfa de 5 cm x 5 cm com uma mistura de solo e areia (3:1, v/v). Regue regularmente. Após 10 dias, transfira as plantas para vasos de 12 cm x 12 cm cheios da mesma mistura de solo.
  3. Cultive as plantas em uma câmara climática sob o regime controlado de dias longos (16 h dia 20 ° C, 8 h noite 16 ° C; intensidade de luz 200 μmol m-2 s-1; umidade 60%).
    NOTA: A cevada de primavera requer aproximadamente 8 a 10 semanas desde a semeadura até o início da antese, sem necessidade de vernalização. A cevada de inverno precisa de 7 a 8 semanas de vernalização (condições de dias curtos, 8 h dia 4 ° C, 16 h noite 4 ° C; intensidade luminosa 200 μmol m-2 s-1; umidade 85%) para induzir a floração.

2. Determinação da polinização

NOTA: A determinação precisa da polinização é necessária para uma estimativa adequada da progressão do desenvolvimento. A cevada é uma espécie autopolinizadora. Para definir o dia da polinização (DOP), monitoramos o dia da autopolinização. Essa característica é específica da cultivar, mas iniciar a protrusão dos toldos da bainha foliar é um bom indicador de aproximação do DOP (Figura 1B).

  1. Abra a bainha da folha que cobre o espigão. Use uma pinça de ponta fina para verificar as anteras e o ovário dentro das espiguetas na parte central da espiga. Espiguetas com anteras amarelas e estigma "fofo" polinizam em poucas horas16 e são consideradas DOP (Figura 1B).
  2. Corte o espigão perto da ponta da última espigueta e remova a folha da bandeira e a parte superior dos toldos. Em seguida, corte o 1/3 superior das cascas em cada espigueta. Isso seca as anteras e leva à sua abertura e liberação de pólen mais sincronizadas.
  3. Cubra o espigão com um saco de vidro com o ID do espigão, o número da planta e a data DOP definida. Isso também evita a polinização cruzada, que pode comprometer experimentos específicos.
  4. Anote as informações em um editor tabular. Use a fórmula a seguir para calcular o dia após a polinização (DAP) quando o isolamento do tecido deve ocorrer.
    xDAP = DOP + x
    x = DAP esperado
    NOTA: Os valores devem ter o formato 'Dados'.
  5. Para a dissecção dos tecidos das sementes, colete as pontas no DAP de acordo com o calendário tabular preparado.

3. Dissecção dos tecidos da semente

NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas usando um estereomicroscópio. Remova os cascos antes da dissecação com uma pinça. Observe que os cascos tornam-se mais secos e aderentes por volta dos 16 DAP. Para manter as condições fisiológicas e evitar o ressecamento dos materiais vegetais durante a dissecação, umedeça as amostras colocando-as em uma gota de 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH = 7,4). Use uma nova semente para dissecação de cada tecido para evitar a degradação de DNA, RNA ou proteína devido ao tempo prolongado de coleta de amostras. Para isolamento de RNA de material dissecado, use apenas materiais e produtos químicos livres de RNase. Não exceda o tempo total de dissecação de 15 minutos para uma amostra que consiste tipicamente de tecidos dissecados de 5 a 10 sementes para minimizar a degradação do RNA.

  1. Remova o resto dos cascos usando uma pinça de ponta fina antes da dissecção do tecido. Hidratar com 1× PBS por 1 minuto ajuda a remover os resíduos secos da espigueta.
  2. Coloque a semente descascada em uma placa de Petri com uma gota de 1× PBS e disseque as partes individuais usando uma pinça de ponta fina, agulha fina e pipeta microcapilar. Uma estratégia ligeiramente diferente é aplicada para a dissecção de tecidos individuais: os tecidos maternos da semente (etapa 3.3), o embrião (etapa 3.4) e o endosperma (etapa 3.5).
  3. Dissecção de tecidos maternos de sementes
    1. Dissecção de sementes até 8 DAP
      1. Coloque uma semente no lado dorsal e corte suavemente a semente ao longo de um eixo longitudinal e retire os tecidos maternos da semente, exceto a última camada que faz fronteira com o endosperma da parte apical à parte basal usando uma pinça.
      2. Colete tecidos maternos de sementes de 5 a 10 sementes em um tubo de 1,5 mL com 50 μL de PBS 1×, descarte o tampão usando uma pipeta, enxágue o tecido duas vezes com 100 μL de PBS, remova o tampão excessivo pipetando e feche o tubo e congele em nitrogênio líquido ou use diretamente para medição de ploidia por citometria de fluxo. A quantidade de material é suficiente para normalmente uma aplicação a jusante (por exemplo, isolamento de RNA ou medição de ploidia por citometria de fluxo).
    2. Dissecção das sementes após 8 DAP
      1. Coloque uma semente no lado dorsal, corte suavemente no meio do lado ventral dos tecidos maternos da semente e retire gradualmente o tecido ao redor da semente inteira, incluindo a projeção nucelar. Para cada aplicação a jusante, colete e lave o tecido de 5 a 10 sementes, conforme descrito na etapa 3.3.1.
  4. Dissecção do embrião
    1. Dissecção de sementes aos 8 DAP e mais jovens
      1. Coloque uma semente no lado dorsal e corte 1/3 basal da semente. Divida cuidadosamente a parte separada ao meio e libere o embrião. Para cada aplicação a jusante, recolher e lavar os embriões de 10 a 20 sementes, conforme descrito no ponto 3.3.1.
    2. Dissecção das sementes após 8 DAP
      1. Coloque uma semente no lado dorsal e remova os tecidos maternos da semente da parte basal do lado ventral. Agite suavemente a fina camada de endosperma ao redor do perímetro do embrião com agulhas finas ou pinças de ponta fina e retire o embrião. Para cada aplicação a jusante, recolher e lavar embriões de um máximo de 5 sementes, conforme descrito no ponto 3.3.1.
  5. Dissecção do endosperma
    1. Dissecção do endosperma sincicial de 4 sementes de DAP.
      1. Coloque uma semente no lado dorsal e remova os tecidos maternos da semente, exceto a última camada de células que fazem fronteira com o endosperma. Perfure suavemente a camada no meio do lado ventral com uma agulha fina e chupe o endosperma sincicial por ação capilar usando uma pipeta microcapilar.
      2. Para cada aplicação a jusante, colete endospermas líquidos de 10 a 15 sementes em um novo tubo de 1,5 mL com tampão adequado para a análise planejada a jusante (ou seja, 1x PBS, tampão de isolamento de RNA, tampão de citometria de fluxo). O volume do buffer deve refletir o protocolo para a aplicação downstream planejada. Congele em nitrogênio líquido.
    2. Dissecção do endosperma celularizante de 5 a 8 sementes de DAP
      1. Coloque uma semente no lado dorsal e remova todos os tecidos maternos e embriões da semente. Para cada aplicação a jusante, colete e lave o endosperma de 10 a 15 sementes em um novo tubo de 1,5 mL com 1x PBS e congele em nitrogênio líquido.
    3. Dissecção do endosperma celularizado da semente após 8 DAP
      1. Coloque uma semente no lado dorsal, remova todos os tecidos maternos da semente e o embrião. Para cada aplicação a jusante, colete e lave o endosperma de uma única semente por tubo, conforme descrito na etapa 3.3.1.
  6. Armazene os tubos com material isolado a – 80 °C até o uso.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Controle da pureza tecidual por citometria de fluxo

NOTA: A pureza da amostra pode ser verificada usando citometria de fluxo antes do isolamento do RNA. A calibração adequada do instrumento é fundamental para a análise de amostras biológicas. A óptica do citômetro de fluxo/analisador de ploidia deve ser ajustada usando esferas de calibração (microesferas de poliestireno coradas com fluorescência altamente uniformes em relação ao seu tamanho e intensidade de fluorescência) até a nitidez máxima máxima, normalmente atingindo o coeficiente de variação (CV) < 2%. Os tecidos de sementes de cereais contêm principalmente populações de G1, G2 e núcleos endorreduplicados; portanto, recomenda-se o uso de uma escala logarítmica. Comece com um tecido foliar que contenha principalmente núcleos G1 e sirva como um controle basal da ploidia.

  1. Utilizar amostras recém-preparadas mantidas no gelo (ver passo 3.3.1) ou tecido congelado conforme descrito17.
    NOTA: Como toda a amostra < 8 DAP é usada para citometria de fluxo, isso representa apenas um controle indireto. Recomendamos que os pesquisadores realizem múltiplos isolamentos e medições até atingir alta proporção de amostras puras (>90%) antes de prosseguir para o isolamento de RNA com < 8 amostras de DAP.
  2. Libere os núcleos das amostras de embriões de 4 e 8 DAP (para outras amostras, consulte a etapa 4.4) homogeneizando os tecidos em 5 a 10 voltas do pilão de plástico em tubo de 1,5 mL contendo 300 μL de tampão Otto I (0,1 M de ácido cítrico monohidratado, 0,5% (v/v) Tween 20, filtrado através de um filtro de 0,22 μm)18.
  3. Filtre a suspensão bruta através de malha de náilon de 50 μm em um tubo de análise de citometria de fluxo e adicione 600 μL de tampão Otto II (0,4 M Na2HPO4 · 12H2O) contendo 2 μg mL-1 DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindo) 18 para corar o DNA.
  4. Coloque todos os outros tecidos (incluindo 16 DAP ou embriões mais velhos) em uma placa de Petri contendo 500 μL de tampão Otto I e homogeneizado cortando com uma lâmina de barbear. Filtre a suspensão como na etapa 4.3 e core com 1 mL de tampão Otto II contendo DAPI.
    NOTA: A manipulação com uma lâmina de barbear afiada de dois gumes requer atenção especial. Para reduzir o risco de ferimentos, existem lâminas de barbear de borda única ou suportes de lâmina especiais disponíveis.
  5. Estimar o teor de ADN nuclear da amostra utilizando um citómetro de fluxo. Pelo menos 2000 partículas por amostra são necessárias para analisar a pureza da amostra.

5. Isolamento de RNA e medição de qualidade

  1. Use tecido congelado para evitar a degradação do RNA por ribonucleases endógenas. A partir de sementes, tecidos maternos e amostras de embriões, isole o RNA usando kits disponíveis comercialmente ou o reagente TRIzol19. Devido ao alto teor de amido nos tecidos do endosperma, isole o RNA total de todas as amostras usando protocolos comerciais de extração de RNA na coluna para tecidos problemáticos (por exemplo, Spectrum Plant Total RNA Kit) com um tratamento DNase I na coluna20.
  2. Meça a concentração e a integridade do RNA usando um protocolo dedicado para eletroforese em gel de RNA ou o Agilent 2100 Bioanalyzer.
    NOTA: O RNA total intacto tem bandas/picos claros de rRNA 18S e 25S de tamanho em torno de 1,9 e 3,7 kb, respectivamente. A banda 25S rRNA deve ser aproximadamente duas vezes mais intensa que a banda 18S rRNA.

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Resultados

Para realizar uma análise transcriptômica específica do tecido do desenvolvimento de sementes de cevada, estabelecemos um protocolo para isolamento de tecido de alta pureza. O protocolo é baseado na dissecção manual de tecidos maternos embrionários, endospermas e sementes de grãos descascados (após remoção manual da casca) (Figura 1A). O protocolo foi usado com sucesso para isolar materiais de várias cultivares de cevada de primavera de duas e seis fileiras, e as espigas foram colhidas em um...

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Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo que permite o isolamento de alta pureza dos tecidos das sementes de cevada. Embora tenha sido desenvolvido e testado para cevada, pode ser facilmente adotado por outros membros da tribo Triticeae , como trigo, aveia, centeio ou triticale27. A parte inicial do protocolo, com foco na dissecação do tecido da semente, não requer nenhum equipamento fora do padrão ou caro e, portanto, deve ser acessível a muitos cientistas. Um in...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Jan Vrána e ao Dr. Mahmoud Said pela manutenção dos citômetros de fluxo, Eva Jahnová pela preparação dos tampões, Marie Seifertová pela lista de materiais e Zdenka Bursová pelos cuidados com as plantas. Este trabalho foi apoiado principalmente pela concessão 18-12197S da Czech Science Foundation. A A.P. foi ainda apoiada pela J. E. Purkyně Fellowship da Academia Tcheca de Ciências e pelo projeto do FEDER "Plantas como ferramenta para o desenvolvimento global sustentável" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de 0,22 umMerckSLGSV255F
tubo Eppendorf de 1,5 mlSarstedt72.690.001
4',6-diamididno-2-fenilindolInvitrogenD21490
50 um malha de nylonSilk a Progrers uhelon120 T
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
Bulb AssemblyDrummond Scientific Company1-000-9000
Grânulos de calibraçãoInvitrogenA16502
de seda de celulose
Ácido cítrico monohidratadoPenta13830-31000
Câmara climáticaWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filter papelFagron
Pinças de ponta finaFine Science Tools11254-20
Citômetro de fluxoSysmex-Partec
Tubo de citometria de fluxoSarstedt55.484
Freezer
de papel glassine
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
Lindenitrogênio líquido
Fivephoton BiochemicalsMGM 1C-20-30
Minutien PinsFine Science Tools26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
Potes de turfaJiffy5x5 cm
de Petri
Suporte de alfineteFerramentas de ciências plásticas26016-12
P-LabA199001
potes12x12 cm
lâmina de barbearGillette
RNAse zapInvitrogenAM9780
Tesoura de Areia
Ferramentas de Ciências Finas14060-11
Espectro do Solo
Kit de RNA Total de PlantasSigma AldrichSTRN50
EstereomicroscópioOlympus
Tween 20Sigma AldrichKit
TRIzolInvitro15596026
Papel Saco Pipeta microcapilar dePlaca Agilent 5067-1513 do pico do RNA 6000 do RNA 6000 do reagente de P2287 gen

Referências

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