Aqui apresentamos um protocolo para isolamento manual de alta pureza e controle de qualidade de tecidos maternos de embriões, endospermas e sementes durante todo o desenvolvimento de sementes de cevada.
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Artigo de método
Aqui apresentamos um protocolo para isolamento manual de alta pureza e controle de qualidade de tecidos maternos de embriões, endospermas e sementes durante todo o desenvolvimento de sementes de cevada.
Compreender os mecanismos que regulam o desenvolvimento de sementes de cereais é essencial para o melhoramento de plantas e aumento da produtividade. No entanto, a análise de sementes de cereais é desafiadora devido ao tamanho minúsculo, ao caráter líquido de alguns tecidos e às estreitas conexões entre tecidos. Aqui, demonstramos um protocolo detalhado para dissecação do embrião, endosperma e tecidos maternos da semente nos estágios inicial, intermediário e tardio do desenvolvimento da semente de cevada. O protocolo é baseado em uma dissecção manual do tecido usando ferramentas de ponta fina e um microscópio binocular, seguido de controle de pureza baseado em análise de ploidia. Os tecidos maternos e embriões da semente são diplóides, enquanto o endosperma é tecido triploide. Isso permite o monitoramento da pureza da amostra usando citometria de fluxo. Medições adicionais revelaram a alta qualidade do RNA isolado de tais amostras e sua usabilidade para análise de alta sensibilidade. Em conclusão, este protocolo descreve como dissecar praticamente tecidos puros do desenvolvimento de grãos de cevada cultivada e potencialmente também de outros cereais.
As sementes são estruturas complexas compostas por vários tecidos de origem materna e filial1. Os grãos de cereais representam um tipo especial de semente, sendo a maior parte formada por endosperma, um tecido triploide especializado que protege e nutre o embrião. Os cereais fornecem cerca de 60% dos recursos alimentares globais e são a produção mais valiosa da produção vegetal2. O conhecimento dos processos moleculares que controlam o desenvolvimento de sementes de cereais é importante devido à sua proeminência econômica e papel central na reprodução das plantas 1,3
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1. Plantas em crescimento
NOTA: Considerando que uma única planta de cevada geralmente tem de 5 a 6 perfilhos e apenas as 5 a 6 espiguetas do meio de cada espiga devem ser usadas para dissecação, então um rendimento máximo por planta é de 72 sementes para cultivares de duas fileiras e 216 sementes para cultivares de seis fileiras.
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Para realizar uma análise transcriptômica específica do tecido do desenvolvimento de sementes de cevada, estabelecemos um protocolo para isolamento de tecido de alta pureza. O protocolo é baseado na dissecção manual de tecidos maternos embrionários, endospermas e sementes de grãos descascados (após remoção manual da casca) (Figura 1A). O protocolo foi usado com sucesso para isolar materiais de várias cultivares de cevada de primavera de duas e seis fileiras, e as espigas foram colhidas em um.......
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Aqui, apresentamos um protocolo que permite o isolamento de alta pureza dos tecidos das sementes de cevada. Embora tenha sido desenvolvido e testado para cevada, pode ser facilmente adotado por outros membros da tribo Triticeae , como trigo, aveia, centeio ou triticale27. A parte inicial do protocolo, com foco na dissecação do tecido da semente, não requer nenhum equipamento fora do padrão ou caro e, portanto, deve ser acessível a muitos cientistas. Um in.......
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Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecemos ao Dr. Jan Vrána e ao Dr. Mahmoud Said pela manutenção dos citômetros de fluxo, Eva Jahnová pela preparação dos tampões, Marie Seifertová pela lista de materiais e Zdenka Bursová pelos cuidados com as plantas. Este trabalho foi apoiado principalmente pela concessão 18-12197S da Czech Science Foundation. A A.P. foi ainda apoiada pela J. E. Purkyně Fellowship da Academia Tcheca de Ciências e pelo projeto do FEDER "Plantas como ferramenta para o desenvolvimento global sustentável" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro de 0,22 um | Merck | SLGSV255F | |
| tubo Eppendorf de 1,5 ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 4',6-diamididno-2-fenilindol | Invitrogen | D21490 | |
| 50 um malha de nylon | Silk a Progrers uhelon | 120 T | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Bulb Assembly | Drummond Scientific Company | 1-000-9000 | |
| Grânulos de calibração | Invitrogen | A16502 | |
| de seda de celulose | |||
| Ácido cítrico monohidratado | Penta | 13830-31000 | |
| Câmara climática | Weiss Gallenkamp | ||
| DNase I | Sigma Aldrich | DNASE70 | |
| Filter papel | Fagron | ||
| Pinças de ponta fina | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Citômetro de fluxo | Sysmex-Partec | ||
| Tubo de citometria de fluxo | Sarstedt | 55.484 | |
| Freezer | |||
| de papel glassine | |||
| KCl | Lachner | 30076-AP0 | |
| KH2PO4 | Litolab | 100109 | |
| Linde | nitrogênio líquido | ||
| Fivephoton Biochemicals | MGM 1C-20-30 | ||
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Na2HPO4 | Lachema | ||
| Na2HPO4.12H2O | Lachner | 30061-AP0 | |
| NaCl | Lachner | 30093-AP0 | |
| Potes de turfa | Jiffy | 5x5 cm | |
| de Petri | |||
| Suporte de alfinete | Ferramentas de ciências plásticas | 26016-12 | |
| P-Lab | A199001 | ||
| potes | 12x12 cm | ||
| lâmina de barbear | Gillette | ||
| RNAse zap | Invitrogen | AM9780 | |
| Tesoura de Areia | |||
| Ferramentas de Ciências Finas | 14060-11 | ||
| Espectro do Solo | |||
| Kit de RNA Total de Plantas | Sigma Aldrich | STRN50 | |
| Estereomicroscópio | Olympus | ||
| Tween 20 | Sigma Aldrich | Kit | |
| TRIzol | Invitro | 15596026 | |
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