Summary
이 원고는 쥐 대퇴골, 마우스 폐 및 초본 식물 뿌리/토양 시스템의 금속 임플란트를 측정하기 위해 HFIR(High Flux Isotope Reactor) CG-1D 빔라인을 사용하여 생물학적 샘플의 중성자 방사선 촬영 및 컴퓨터 단층 촬영을 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
중성자는 역사적으로 소각 중성자 산란, 중성자 스핀 에코, 회절 및 비탄성 산란과 같은 기술을 사용하는 광범위한 생물학적 응용 분야에 사용되었습니다. 역수 공간에서 정보를 얻는 중성자 산란 기술과 달리 감쇠 기반 중성자 이미징은 실제 공간에서 수십 마이크로미터 단위로 분해되는 신호를 측정합니다. 중성자 이미징의 원리는 Beer-Lambert 법칙을 따르며 샘플을 통한 벌크 중성자 감쇠 측정을 기반으로 합니다. 더 큰 감쇠는 생물학적 샘플의 주요 구성 요소인 일부 가벼운 요소(특히 수소)에 의해 나타납니다. 중수소, 가돌리늄 또는 리튬 화합물과 같은 조영제는 광학 영상, 자기 공명 영상, X선 및 양전자 방출 단층 촬영과 같은 기술을 포함하여 의료 영상에서 수행되는 것과 유사한 방식으로 조영제를 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 생물학적 시스템의 경우 중성자 방사선 촬영 및 컴퓨터 단층 촬영이 지하 식물 뿌리 네트워크의 복잡성, 토양과의 상호 작용 및 현장 물 흐름의 역학을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 또한, 연조직 및 뼈와 같은 동물 샘플의 대비 세부 사항을 이해하려는 노력이 탐구되었습니다. 이 원고는 고플럭스 동위원소 원자로 CG-1D 중성자 이미징 빔라인을 사용한 샘플 준비, 계측, 데이터 수집 전략 및 데이터 분석과 같은 중성자 바이오이미징의 발전에 중점을 둡니다. 앞서 언급한 기능은 식물 생리학(초본 식물/뿌리/토양 시스템) 및 생물 의학 응용 프로그램(쥐 대퇴골 및 마우스 폐)에서 엄선된 예를 사용하여 설명됩니다.
Introduction
중성자 방사선 촬영(nR)의 원리는 중성자가 통과하는 물질을 통한 중성자의 감쇠를 기반으로 합니다. 원자의 전자 구름에 의해 산란되는 X선과 달리 중성자는 핵에 의해 흡수되거나 산란될 수 있습니다. 중성자는 수소(H)와 같은 가벼운 원소에 민감하며, 결과적으로 동물(1,2,3,4,5,6,7) 또는 인간 조직(8,9) 및 지하 토양/뿌리 시스템(10,11,12,13,14)과 같은 생물학적 응용을 방사선 촬영하는 데 사용될 수 있다 ,15. 중성자 영상은 무거운 원소16,17,18을 검출 할 수있는 X 선 영상에 대한 보완 기술이다. 감쇠 기반 nR은 투과된 빔이 재료의 양과 재료를 통과하는 경로 길이에 정비례한다는 Beer-Lambert 법칙에 설명된 대로 샘플 내 재료의 선형 감쇠 계수와 샘플의 두께에 의해 제어됩니다. 따라서 투과율 T는 다음과 같이 계산할 수 있습니다.
(1)
여기서 I 0 및 I는 각각 입사 및 투과 빔 강도입니다. μ와 x는 각각 선형 감쇠 계수와 균질 샘플의 두께입니다. 감쇠 계수 μ는 다음과 같이 주어집니다.
(2)
여기서 σ는 샘플의 중성자 감쇠 단면(산란 및 흡수 모두), ρ는 밀도, NA 는 아보가드로 수, M은 몰 질량입니다.
저에너지 중성자(즉, 0.5eV 미만의 에너지)를 사용하는 생물학적 샘플의 방사선 촬영에서 대비는 대부분 H 밀도(고정된 샘플 두께의 경우)의 변화 때문입니다. 이는 중성자와 H 핵의 상호 작용 확률이 생물학적 샘플에 존재하는 다른 핵보다 크고, H 원자의 밀도가 생물학적 샘플에서 가장 풍부한 원자이기 때문에 가장 중요하다는 사실 때문입니다.
초기 단계부터 nR 및 중성자 컴퓨터 단층 촬영(nCT)은 재료 및 엔지니어링 응용 분야에 광범위하게 사용되었습니다(19,20,21,22,23). 생물학적 샘플에서 H에 대한 중성자 감도의 첫 번째 시연 실험은 1950년대 중반에 식물 표본의 측정으로 시작되었습니다24. 이 연구는 1960년대까지 계속되었는데, 예를 들어, 인간의 흉부25 또는 쥐26의 방사선 촬영에서 가돌리늄 산화물(Gd2O3)과 같은 조영제의 사용이 탐구되었습니다. 또한, 인간 종양 조직 대 정상 조직의 대조는 H 함량의 국소 증가에 기인한다는 가설이 세웠다. 이러한 초기 시험 동안 중성자 플럭스와 공간 분해능이 증가하면 nR의 품질이 향상되고 산업 또는 생물 의학 응용 분야를 보완하는 기술로서의 인기가 높아질 것이라고 결론지었습니다. 가장 최근의 연구는 생물의학 및 법의학 응용을 위해 암 조직 표본1과 동물 장기 절편 2,3,27에 대해 수행된 nR 및 nCT 측정으로 구성됩니다.
테네시 주 오크리지의 오크리지 국립 연구소에 위치한 HFIR(High Flux Isotope Reactor)은 핵분열 반응에 의해 중성자를 생성하는 강력한 중성자 소스입니다. 이 중성자는 2 MeV 정도의 에너지를 가지며 중수와의 운동 반응에 의해 원자로 풀에서 "냉각"되어 100-300 eV 정도의 에너지에 도달합니다. 산란 또는 이미징 여부에 관계없이 중성자 실험의 최적화는 빔 강도, 에너지 분포 및 배경 효과(고속 중성자, 지연 중성자, 감마선)와 같은 중성자 소스 및 빔라인 특성을 이해하는 것에서 시작됩니다. 이미징 빔라인이 위치한 HFIR 콜드 가이드 홀에서 중성자는 액체 H 감속재와의 운동적 상호 작용에 의해 추가로 "냉각"됩니다. 그런 다음 소스의 가시선에서 멀리 떨어진 곡선 가이드 시스템으로 운송되어 빠른 중성자와 감마선 오염을 제거합니다. 도 1에 예시된 바와 같이, CG-1D 중성자-이미징 빔라인(28, 29)은 콜드 가이드 상에 배치되며, 이는 중성자 에너지 범위가 수 meV에서 수십 eV까지 다양하다는 것을 암시한다(이 경우, 대응하는 사용 가능한 중성자 파장 범위는 0.8 내지 10 Å) 107 n/(cm2∙s)를 샘플 위치에서. 전동식 조리개/확산기 시스템은 이미징 기기의 핀홀 형상을 정의합니다. 중성자는 양쪽 끝에 알루미늄(Al) 창이 있는 헬륨(He)으로 채워진 비행 튜브에서 6.59m의 거리를 이동합니다. 비행 튜브는 빔 강도의 손실이 최소화되도록 공기 산란을 제한하면서 중성자를 운반하는 데 사용됩니다. 이 원고에 설명 된 측정을 위해, 확산기는 Al 용기에 싸인 1mm 두께의 50 nm 산화 알루미늄 (Al2O3 ) 나노 분말로 만들어집니다. 디퓨저는 중성자 가이드(이미징 빔라인의 핀홀 형상에 의해 확대됨)에서 나오는 빔 아티팩트를 줄이고, 그렇지 않으면 방사선 사진에서 급격한 수평 및 수직 강도 변동을 볼 수 있으며 데이터의 정규화가 어려워집니다. 여기에 설명된 실험을 위해 중성자는 25μm 두께의 리튬-6 불화물/황화아연 형광체(6LiF/ZnS:Ag)를 사용하여 빛으로 변환됩니다.
시준 최적화는 시료-검출기 위치, 필요한 공간 분해능 및 획득 시간에 따라 달라집니다. 샘플이 섬광체에서 몇 cm 떨어져 있을 때 높은 시준(800 이상의 L/D, 여기서 L은 직경, D 및 검출기의 핀홀 조리개로부터의 거리)은 중성자 플럭스를 희생시키면서 더 나은 공간 분해능을 제공합니다. 낮은 시준(800 미만의 L/D)은 시간 분해능이 공간 분해능보다 우세한 현장 동적 스터디에 선호됩니다. 이 원고에 설명된 측정의 경우 L/D 및 공간 분해능은 각각 약 355 및 75 μm였습니다. 시간 분해능은 신호 대 잡음비(SNR)에 따라 달라졌습니다. 샘플은 흐림과 같은 기하학적 왜곡을 줄이기 위해 가능한 한 섬광체에 가깝게 배치되었습니다. 평행 이동 및 회전 단계를 통해 검체를 검출기에 가깝게 설정하고 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 수행할 수 있습니다. CG-1D는 3 가지 유형의 검출기를 제공합니다 : 2048 픽셀 x 2048 픽셀의 전하 결합 소자 (CCD)와 13.5 μm의 픽셀 피치, 2560 픽셀 x 2160 픽셀의 과학적 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 검출기, 6.5μm의 픽셀 피치,30,31 픽셀 x 512 픽셀의 마이크로 채널 플레이트 (MCP) 검출기, 55μm의 픽셀 크기. 산란된 중성자는 ~5mm 두께의 붕소 고무로 흡수되어 검출기 칩이 중성자를 못하도록 보호합니다. 이 흡수는 붕소 고무와 검출기 사이에 배치된 납(Pb)에 의해 차단될 수 있는 감마선을 생성합니다. 각 검출기는 다양한 시야각(FOV)과 공간 및 시간 분해능에 최적화되어 있습니다. 쥐 대퇴골 및 마우스 폐 측정을 위해 CCD 검출기는 큰 FOV 기능(~ 7cm x 7cm)과 약 75μm의 합리적인 공간 분해능을 위해 활용되었습니다. 식물 뿌리/토양 시스템의 nCT는 FOV(~ 5cm x 4.2cm로 제한됨)의 비용으로 가능한 한 빨리 nCT를 획득하는 것이 목표였기 때문에 sCMOS로 수행되었습니다. 따라서 공간 해상도가 분명히 저하되었습니다. 이 검출기에서 중성자는 검출 목적으로 빛이나 알파 입자로 변환됩니다. 샘플을 수직축을 중심으로 회전하고 연속적인 회전 각도로 방사선 사진을 획득하면 nCT를 획득할 수 있습니다. 조사 중인 샘플의 3차원 체적 렌더링 모델은 사내 iMARS3D python 기반 Jupyter FBP(Filtered-Back-Projection) 노트북, pyMBIR 또는 상용 소프트웨어를 활용하여 얻을 수 있으며, 모두 아래에 설명되어 있습니다.
마지막으로, 샘플 또는 검출기와 상호 작용하지 않은 중성자는 배경 소음을 최소화하기 위해 검출기 시스템에서 약 1m 하류의 빔 정지 위치에 수집됩니다. CG-1D 빔 스톱은 폭 0.75m, 높이 0.5m, 두께 35mm이며 에폭시 B4C로 만들어졌습니다. 빔 스톱은 중성자 빔이 부딪히는 내화성 에폭시에 10mm의 95% 농축 탄산리튬(6Li2CO3)으로 강화되며, 캐비티에는 6Li, 납(Pb) 및 강철이 늘어서 있습니다. 빔 스톱은 빔라인의 강철 차폐 벽에 직접 부착됩니다. CG-1D 빔라인의 사진은 그림 2에 나와 있습니다.
3개의 재구성 소프트웨어를 사용하여 각각 3개의 실험 데이터를 3D로 재구성했습니다. 마우스 폐 샘플 재구성은 FBP를 활용하는 상용 재구성 소프트웨어인 Octopus32를 사용하여 수행되었습니다. Octopus 소프트웨어는 서버 PC에 있으며 빔라인에서 수집된 데이터를 재구성하는 데 사용할 수 있습니다. iMARS3D라는 재구성 소프트웨어는 CG-1D에서 사용할 수 있습니다. 오픈 소스 코드 TomoPY33을 기반으로 하며 자동 기울기 보정, 후처리 필터 등과 같은 기능이 추가되었습니다. iMARS3D에는 데이터 전처리(배경 및 노이즈 빼기), 자르기, 중앙값 필터링(감마 스트라이크 및 데드 픽셀 보정), 자동 빔 강도 변동 보정 및 샘플 기울기 보정이 포함됩니다. 시노그램이 생성되면 링 아티팩트 제거 및 평활화와 같은 추가 데이터 처리가 옵션입니다. 재구성의 여러 단계는 분석 서버에 저장되고 나중에 제안서 공유 폴더로 이동되며, 최종 2D 슬라이스는 제안 공유 폴더에 즉시 저장됩니다. 쥐 대퇴골은 iMARS3D를 사용하여 재구성되었습니다. 식물 뿌리/토양 샘플은 TomoPY를 사용하여 데이터를 중앙값 필터링한 다음 Python의 SciPy 라이브러리를 사용하여 기울기 축 보정을 통해 전처리되었습니다. 재구성은 baseline(FBP)에서 고도로 희박하고 잡음이 많은 중성자 데이터 세트로부터 고품질 재구성을 얻을 수 있는 고급 모델 기반 반복 재구성 기술(35)에 이르기까지 단층 촬영 알고리즘 제품군을 구현하는 pyMBIR(ASTRA 툴박스(34)의 커널을 사용하여 구축됨)이라는 자체 개발한 파이썬 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 앞서 언급한 재구성 도구를 기반으로 렌더링된 모든 볼륨은 감쇠 대비로 표시됩니다. 모든 시각화는 상용 시각화, 세그멘테이션 및 데이터 분석 소프트웨어 패키지 AMIRA36을 사용하여 수행되었습니다.
이 원고는 HFIR CG-1D 빔라인에서 중성자 이미징(nR 및 nCT)을 사용하는 절차를 시연하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 또한 생물학적 샘플, 특히 쥐 폐, 쥐 뼈 및 식물 뿌리/토양 시스템에 대한 현재의 최첨단 nR 및 nCT 기능을 보여줍니다. 마우스 폐는 폐 조직을 측정하기 위해 중성자의 상보성을 설명하기 위해 선택되었지만 X선은 대부분 뼈에 민감합니다. 쥐의 대퇴골인 뼈 샘플에는 티타늄(Ti) 임플란트가 있어 뼈와 금속 사이의 대비를 보여주고 뼈/금속 계면을 볼 수 있는 기회를 보여줍니다(금속이 강하게 감쇠하기 때문에 X선으로 측정하기 어렵습니다4). 마지막으로, 식물-뿌리 용수 시스템은 현장에서 뿌리/토양 시스템을 측정하는 nCT의 3차원(3D) 기능을 보여줍니다. 또한 생물학적 샘플에 nR을 사용할 때의 장점/단점을 보여줍니다. 분명히, 이 방법은 식물 뿌리 시스템에서 물 역학을 측정하는 데 안전하게 사용될 수 있지만 방사선 노출과 관련된 위험으로 인해 살아있는 동물 또는 인간 이미징 기술로 간주될 수 없으므로 연구를 (죽은) 마우스 또는 병리학과 유사한 측정으로 제한합니다.
Protocol
1. 기기 설정(그림 3, 섹션 3 참조)
- 빔라인 컴퓨터에서 터미널 창을 열고 css를 입력한 다음 Enter 키를 눌러 사용자 인터페이스를 시작합니다.
- 기본적으로 열려 있지 않은 경우 메뉴 탭에서 사용자 홈 옵션을 선택하여 EPICS(Experimental Physics and Industrial Control System) 이미징 인터페이스를 엽니다.
- 인터페이스의 첫 번째 탭(제안/카메라/SE 장치라고 함)을 사용하여 카메라/감지기 옆에 있는 광학 버튼을 클릭하여 빔라인 광학, 즉 슬릿 버튼을 클릭하여 핀홀 조리개 크기 및 슬릿 시스템 개방을 선택합니다.
- 회전 s를 볼트로 고정tage XY s에 stags가 배치될 s를 s, 검출기(sCMOS 또는 CCD)를 배치합니다.
- CCD 또는 sCMOS 검출기의 경우 기기 팀과 상의하여 원하는 공간 해상도와 초점 거리를 제공하는 배율의 렌즈를 선택합니다. 빛을 먼저 사용하여 감지기를 거울에서 더 가까이 또는 더 멀리 이동하거나 고정된 감지기 위치에서 렌즈를 수동으로 조정하여 카메라의 초점을 맞춥니다. 중성자 섬광체의 위치에 이미지의 초점을 맞춥니다.
- CCD 또는 sCMOS 검출기의 경우, 검출기 섬광체에 대해 배치된 중성자-흡수 분해능 마스크(37)를 사용하여 중성자로 렌즈 초점을 미세 조정한다. 다양한 설정(즉, EPICS에서 검출기 모터를 움직여 자동화된 미러의 다른 검출 기 위치)을 사용하여 연속적인 방사선 사진을 수집합니다.
- ImageJ/Fiji39 또는 유사한 이미지 소프트웨어 도구에서 라인 쌍을 평가하여 방사선 사진을 비교합니다.
- 적절한 경우 샘플을 적절한 용기(Al 용기 및/또는 Al 헤비 듀티 호일)에 담아 s를 회전 스테이지에 배치합니다.tage 검출기에 최대한 가깝습니다. 중성자(붕소 고무) 및 감마(Pb 벽돌) 차폐를 사용하여 감지기와 장비를 차폐합니다.
- 시료와 검출기의 거리를 측정하고 시료를 제거합니다. 해상도 마스크로 교체하여 이 빔라인 구성의 샘플 위치에서 픽셀 크기를 평가합니다. 알려진 특징 차원을 사용하여 특징 전체의 픽셀 수를 평가하여 픽셀 크기를 결정합니다.
- 회전 단계에서 샘플을 재배치합니다.
- EPICS 인터페이스와 Align Sample 탭을 사용하여 샘플이 검출기의 전체 시야에 올 때까지 이동하는 동안 연속적으로 빠른(ms에서 1초) 방사선 사진을 촬영하여 샘플을 중성자 빔과 정렬합니다. 샘플 정렬 파일을 .csv 파일로 저장하면 CT 스캔이 시작되기 전에 재사용됩니다.
- CT 스캔을 시작하기 전에 자동 CT 정렬 확인 옵션( 정렬 탭)을 사용하여 빔과 함께 다른 샘플 방향에서 생성된 방사선 사진을 평가하여 샘플이 다른 각도에서 시야에 남아 있는지 확인합니다.
2. 검체 준비 및 데이터 수집 전략
참고: 동물 샘플 프로토콜은 마우스 폐에 대한 테네시 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 쥐 대퇴골에 대한 Rush University Medical Center 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
- 쥐 대퇴골
- Ti6Al4V 막대(직경 1.5mm, 길이 15mm)를 수컷 Sprague-Dawley 쥐의 대퇴골에 이식하여 원위 대퇴골과를 통해 골수내 공간 내에 배치합니다.
- 12 주 후에 쥐를 희생하고 대퇴골을 수확하십시오. 모든 연조직 (중성자 감쇠에 기여)을 제거하고 식염수에 적신 거즈에 임플란트로 대퇴골을 동결시킵니다. 2인치 정사각형 거즈 스폰지를 인산염 완충 식염수(PBS)에 완전히 담그고 각 샘플을 이 적신 스폰지에 완전히 감쌉니다( 재료 표 참조).
- X선 기반 microCT 스캔(38)을 위해 대퇴골을 실온으로 해동한 후, 동결 상태로 HFIR로 이송한다.
- nCT 전에 샘플을 다시 해동하고 CG-1D 중성자 이미징 빔라인에 가까운 HFIR BSL2(Biohazard Safety Level 2) 실험실에서 실온으로 가져옵니다. 실온에 도착하면 샘플을 견고한 Al 호일로 싸서 Al 실린더에 넣습니다.
- 빔라인의 회전 스테이지에 실린더를 수직으로 배치하고 0.25°의 스테핑 각도로 실온에서 0에서 360°까지 빔라인에서 대퇴골을 스캔합니다. 50초 동안 각 방사선 사진을 수집합니다.
참고: 회전 스테이지 이동 및 CCD에서 데이터 수집 컴퓨터로 각 방사선 사진 전송에 대한 데드 타임을 고려하면 총 스캔 시간은 약 24시간이었습니다.
- nCT가 완료되고 샘플이 빔라인에서 제거되도록 승인되면 샘플을 BSL2 실험실로 다시 가져와 격납물을 제거하고 샘플을 다시 동결하여 추가 실험 측정을 위해 보존합니다.
- 쥐의 폐
- 이 연구와 관련이 없는 실험에 사용된 죽은 마우스의 폐 조직을 절제합니다. 중성자 실험 전에 샘플을 70% 에탄올 용액에 고정합니다.
- 조직을 튼튼한 Al 호일로 싸서 BSL2 실험실에서 CG-1D 빔라인으로 직접 운반합니다. 이중 봉쇄를 위해 Al 실린더에 샘플을 삽입하고 nCT 스캔 중에 빔에서 샘플 위치를 유지합니다.
- 샘플을 CCD 가까이에 놓고 실온에서 밤새 스캔을 수행합니다.
참고: 각 방사선 사진은 150초이고 회전 스테핑 각도는 0에서 182°까지 0.5°였습니다. 스캔의 총 시간은 약 16시간이었습니다.
- 초본 식물 뿌리/토양 시스템
참고: 다른 생물학적 샘플과 마찬가지로 식물-토양 시스템은 수소, 특히 토양 또는 식물 뿌리의 물의 강한 감쇠로 인해 크기가 제한됩니다. 종자 또는 라멧은 용기에 심어질 수 있거나(Al 또는 석영-둘 다 낮은 중성자 감쇠 단면을 가짐), 또는 더 성숙한 식물을 용기에 이식할 수 있다.- 현장에서 자라는 지역 허브를 조심스럽게 발굴하고 이식합니다 (여기서는 뽕나무 잡초 (Fatoua villosa (Thunb.) Nakai)를 단면 2.38 cm x 2.58 cm, 높이 6.3 cm, 벽 두께 0.055 cm의 Al 용기에 넣고, 순수한 모래(SiO2)를 함유한다.
- 식물 뿌리를 탈 이온수로 헹구고 젖은 모래 슬러리로 용기를 채우면서 Al 용기 안에 조심스럽게 전시하십시오.
알림: 용기에 흙을 채울 때 건조한 흙이 입자 크기에 따라 분리되어 용기12,13에 질감 인공물을 생성하므로 젖은 흙을 사용하는 것이 중요합니다. - 식재 후 플랜트 시스템의 포화 중량을 측정하고 매일 플랜트 시스템의 무게를 측정하여 물 사용률을 평가합니다. 튜브나 주사기를 사용하여 토양의 상단 표면에 물을 바르거나 용기 바닥의 포트나 구멍을 통해 물을 뿌립니다.
참고: 여기에서 플랜트 시스템을 저울에 놓고 무게를 기준으로 일일 물 사용량을 대체하기 위해 매일 상단에 물을 도포했습니다. 토양 수분 함량을 줄이고 뿌리의 대비를 향상시키기 위해 이미징 전에 물을 보류할 수 있습니다. - 온도와 빛이 조절된 현장 성장 챔버에서 플랜트 시스템을 전파합니다12. Al 용기에 식물 뿌리가 순응할 수 있도록 이미징 전 1주일 동안 식물 시스템을 유지합니다.
알림: 이미징이 시작되면 식물에 물을 주지 마십시오. - 각각 ~1.75시간 내에 nCT 스캔을 수행하고 2.5일 동안 지속적으로 스캔하여 토양 및 식물 수분 함량의 동적 3D 변화를 매핑합니다. 이러한 측정의 경우 시간 분해능(즉, 각 투영에 대한 더 빠른 획득 시간)을 위해 공간 분해능을 수백 μm로 줄입니다.
참고: 각 CT 스캔은 0.93°의 회전 각도와 투영당 10초의 획득 시간으로 수행되었습니다. 이 원고의 목적을 위해 첫 번째 CT 스캔만 제시됩니다.
3. 데이터 수집
참고: CG-1D의 데이터 수집 시스템은 EPICS 소프트웨어(40)를 이용한다. EPICS는 실험 프로토콜을 안내하고 인적 오류를 최소화하기 위해 개발되었습니다. 이 인터페이스는 그림 3과 같이 샘플을 측정하기 전에 필요한 여러 단계를 논리적으로 단계별로 진행합니다. EPICS 데이터 수집 프로토콜은 다음과 같습니다(그림 3). 왼쪽 섹션은 모터 위치 및 실험 세부 정보(샘플 정보, 제안 번호 및 팀 구성원)와 함께 진행 중인 실험의 상태를 제공합니다. 각 실험은 제안 번호 및 하나 또는 여러 개의 샘플과 연결됩니다. 팀 구성원 및 선택한 샘플 이름과 같은 제안 정보도 오른쪽에서 사용할 수 있습니다(첫 번째 탭인 "제안서/카메라/샘플 환경 장치"). 중앙 섹션은 측면에 다이내믹 레인지 스케일 바가 있는 현재 방사선 사진과 이미지 아래의 상태 및 로그 정보로 구성되었습니다.
- Proposal/Camera/SE Device라는 제목의 첫 번째 EPICS 탭을 선택합니다. Switch Proposal or Sample(제안 또는 샘플 전환) 버튼을 클릭합니다. 이전 탭을 대체한 List of Proposals(왼쪽)와 Sample(오른쪽)에서 측정할 프로젝트 번호와 Sample ID#를 선택합니다.
- 뒤로 화살표를 사용하여 기본 EPICS 인터페이스로 돌아갑니다. 카메라/감지기 옵션 목록에서 사용 가능한 4개의 감지기(Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD 또는 MCP) 중 하나를 선택하여 사용할 감지기(sCMOS 또는 CCD)를 선택합니다.
참고: SBIG CCD는 기기에서 테스트하는 데 사용되며 현재 원고에서는 무시할 수 있습니다. - 샘플 환경 장치 섹션에서 사용할 회전 단계를 선택합니다.
- 먼저 Sample Environment Device 목록에서 Rotation Stage (CT Scan)를 클릭합니다. 그런 다음 회전 단계 중 하나를 선택합니다(스캔할 샘플에 해당).
- 마지막으로 탭 하단에서 데이터 수집 모드를 선택합니다. 이 경우 첫 번째 옵션인 White Beam을 선택합니다.
참고: 획득 모드는 백색 빔(중성자 파장의 전체 범위를 취함) 또는 CG-1D 빔라인에서 단색입니다. - 샘플 정렬(Align Sample)이라는 제목의 두 번째 EPICS 탭을 선택합니다. 샘플 파일 이름을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 하위 폴더 이름에 대해 이 과정을 반복합니다.
참고 : EPICS 인터페이스는 사내 재구성 소프트웨어가 조사중인 3D 물체의 2 차원 (2D) 슬라이스를 생성하는 데 사용하는 적절한 실험 디렉토리에 데이터를 자동으로 저장하도록 프로그래밍되어 있습니다. 두 번째 탭인 샘플 정렬(Align Sample)에서는 이러한 방사선 사진이 나중에 데이터 처리 및 분석에 사용되지 않으므로 몇 초 단위의 방사선 사진을 사용하여 샘플을 정렬할 수 있습니다. 모든 모터가 올바르게 배치되면 해당 위치를 .csv 파일 형식으로 저장할 수 있습니다. 따라서 각 샘플 정렬에는 나중에 CT 스캔을 위해 샘플을 배치하기 위해 다시 호출할 수 있는 해당 .csv 파일이 있습니다. - 세 모터의 정렬을 건너뜁니다. 즉, 샘플이 정렬되고 CT를 받을 준비가 되었다고 가정합니다. 원하는 획득 시간을 선택하고 빠른 이미지 촬영 버튼을 클릭합니다. SNR을 평가하기 위해 획득 시간이 다른 일련의 방사선 사진을 수집합니다.
- ImageJ/Fiji를 엽니다. 다른 방사선 사진을 끌어다 놓습니다. 샘플에서 열린 영역으로 이동하는 프로파일을 플로팅합니다. SNR을 평가합니다.
- XY 스테이지에 여러 샘플이 설정된 경우(여러 회전 스테이지, 각각 하나의 샘플에 대해) 정렬 후 각 샘플 위치를 기록하고 파일에 저장 버튼을 클릭하여 데이터를 .cvs 파일로 저장합니다.
- 데이터 수집이라는 제목의 세 번째 EPICS 탭을 선택하여 CT 스캔 매개변수를 설정합니다. 쓰기 가능한 첫 번째 줄에 파일 이름을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 하위 폴더 이름에 대해 반복합니다.
참고: 데이터 수집 탭의 레이아웃은 첫 번째 탭에서 일련의 시간 경과 방사선 사진(SE 없음) 또는 CT 스캔(회전 단계 선택)의 선택에 따라 달라집니다. - 저장된 파일을 사용하여 샘플 정렬 섹션에서 이전에 샘플 모터 위치를 기록한 파일을 선택합니다(1.8단계). 최근에 저장한 파일을 사용하여 최근에 저장된 샘플 정렬 파일을 탐색할 수 있습니다. Align Using File(파일을 사용하여 정렬 )을 클릭하여 샘플이 중성자 빔의 제자리로 돌아가도록 합니다.
- Nyquist의 샘플링 정리를 기반으로 CT에 필요한 투영 수를 계산합니다. 표본 수평 차원의 픽셀 수를 계산하고 1.5를 곱하여 Nyquist의 표본 추출을 수행하는 데 필요한 투영 수를 구합니다.
- 회전 시작 각도(일반적으로 0°), 회전 종료 각도 (일반적으로 180°), 회전 단계 크기, 단계당 이미지 수 (일반적으로 1로 설정) 및 각 이미지의 노출 시간을 입력합니다. 데이터 수집 버튼을 클릭하여 CT 스캔을 시작합니다.
4. 볼륨 재구성 및 데이터 처리/분석
참고: 데이터 정규화, 재구성 및 분석을 위한 모든 CG-1D 소프트웨어 도구는 ORNL 시설의 Python 저장소와 시설의 분석 서버에서 사용할 수 있습니다. 2D 측정의 경우 Jupyter Python Notebook41을 사용하여 전처리를 수행할 수 있습니다. 전자 필기장의 그림은 그림 4에서 볼 수 있습니다. 빔 변동을 1(또는 100%) 투과로 정규화하는 데 사용되는 샘플 외부의 관심 영역을 선택하기 전에 데이터를 로드하고 미리 볼 수 있습니다. 이 노트북은 각 측정에 맞게 조정할 수 있으므로 전처리가 간단합니다. 또한 시간에 따른 샘플의 동역학적 변화(즉, 샘플의 수분 흡수)를 추적하는 것과 같은 동일한 노트북에서 2D 분석을 수행할 수 있습니다.
- 사용자 이름 및 암호를 사용하여 Linux 분석 서버에 로그온합니다. 웹 브라우저를 열고 jupyter.sns.gov 를 입력합니다.
- iMARS3D라는 python Jupyter Notebook을 엽니다. 코드의 처음 몇 줄(iMARS3D를 실행하는 데 필요한 도구를 로드함)을 실행합니다. 데이터, 플랫 및 암시야를 로드합니다. 세 가지 데이터 세트가 모두 제대로 로드되었는지 확인합니다.
- 데이터 자르기, 필터링(필요한 경우), 정규화(자동 샘플 기울기 보정 사용) 및 체적 재구성(긴 프로세스)을 진행합니다. Shared라는 프로젝트 번호 폴더에 데이터를 저장합니다. 설비 분석 서버에서도 사용할 수 있는 AMIRA36을 켠 후 소프트웨어에서 재구성된 슬라이스를 로드하고 시각화, 추가 필터링 및 분석을 진행합니다.
Representative Results
도 5A는 측정된 것과 유사한 크기의 대표적인 쥐 대퇴골의 사진이다; 그림 5B,C는 Ti 임플란트가 있는 쥐의 대퇴골의 nCT를 나타냅니다. 그림 5B는 대퇴골의 잘못된 색상 감쇠 기반 nCT를 나타내는 반면, 그림 5C는 그림 5B에서와 동일한 방향으로 뼈를 대각선으로 절단하여 X선 의료 CT와 유사한 Ti 임플란트(그레이 스케일)를 나타냅니다. 이 임플란트는 뼈 재료만큼 중성자와 상호 작용하지 않습니다. 따라서 감쇠가 최소화되고 주변 뼈보다 더 어둡게 보입니다(즉, 덜 감쇠). 대퇴골의 수질 공간 내에 존재하는 섬유주골은 샘플의 근위 끝에서 명확하게 볼 수 있습니다(그림 5B의 빨간색 화살표).
그림 6A, B는 중성자가 연조직 표본을 검출하는 능력을 입증하기 위해 nCT에 사용된 두 가지 다른 위치에서 에탄올로 고정된 마우스 폐의 대표적인 사진을 보여줍니다. nCT에서 얻은 마우스 폐의 재구성된 부피는 그림 6C, D에 나와 있으며 그림 6A, B와 유사한 방식으로 배치되어 있습니다. 폐의 우엽을 관통하는 절개가 그림 6E에 나와 있습니다. 샘플의 상대적으로 작은 크기에도 불구하고 중성자 감도는 ~75μm 공간 분해능에서 폐 구조를 감지함으로써 명확하게 입증됩니다. 예상대로, 감쇠 범위는 상당히 넓으며, 폐는 공기를 포함하는 스폰지와 같은 구조를 가지고 있기 때문에 많은 부분이 중성자 감쇠에 해당합니다.
그림 7A는 식물 샘플의 사진을 보여주는 반면, 그림 7B는 직사각형 Al 용기에서 식물 뿌리 / 토양 시스템의 잘못된 색상 체적 렌더링을 나타냅니다 (Al은 대부분 중성자에 투명하기 때문에 보이지 않음). 이전 데이터 세트와 비교할 때 SNR은 2.5일 동안 3D로 뿌리에서 물 흡수의 동적 움직임을 추적하기 위해 데이터를 더 빨리 수집했기 때문에 예상대로 더 나쁩니다. 따라서 각 CT 스캔은 ~1.75시간 이내에 측정되도록 최적화되었습니다. 열악한 SNR에도 불구하고 토양의 뿌리 시스템은 그림 7C, D에 표시된 샘플의 수직 절단에서 가색으로 명확하게 볼 수 있습니다.
그림 1: HFIR CG-1D 중성자 이미징 빔라인의 개략도. 이미징 빔은 원뿔 빔 형상을 정의하는 조리개 시스템에 의해 정의됩니다. 빔은 원치 않는 표류 중성자를 제거하기 위해 빔 스크레이퍼가 있는 He 충전 비행 튜브를 통해 운반됩니다. 비행 튜브 내부의 붕소 고무 라이너는 인접한 빔 라인의 배경을 줄입니다. 약어: HFIR = 고플럭스 동위원소 반응기; He = 헬륨; L = 직경, D 및 검출기의 핀홀 조리개로부터의 거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: High Flux Isotope Reactor의 CG-1D 중성자 이미징 시설. 사진은 앞 오른쪽에서 왼쪽으로 비행 튜브, 샘플 영역 및 빔 스톱을 보여줍니다. 중성자 빔은 사진의 오른쪽에서 나옵니다. 비행 튜브는 장비를 사용하는 과학 및 산업 연구 커뮤니티의 서명을 받았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: EPICS 인터페이스. CG-1D EPICS 인터페이스는 상태 섹션(왼쪽), 디스플레이 영역(이 예에서는 황동 해상 해시계의 원시 방사선 사진), 2D 및 3D 이미징을 위한 매개변수 입력의 세 부분으로 나뉩니다. 약어: EPICS = Experimental Physics and Industrial Control System; 2D = 2차원; 3D = 3차원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Jupyter 노트북의 스크린샷 이 노트북은 방사선 사진을 정규화하기 전에 방사선 사진 세트를 미리 보는 데 사용됩니다. 이 예에서는 그림 3 에 표시된 것과 동일한 황동 해상 해시계가 시각화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 티타늄 임플란트가 있는 쥐 대퇴골. (A) 대표적인 쥐 대퇴골 사진. (B) nCT로부터 얻은 쥐 대퇴골의 3D 렌더링 부피. (C) 대퇴골 내부의 티타늄 막대를 보여주는 대각선 슬라이스. 빨간색 화살표는 섬유주골을 나타냅니다. 축척 막대는 각각 x축과 y축으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 마우스 폐 nCT. (A) 및 (B) 마우스 폐의 대표 사진. (C) 및 (D) (A) 및 (B)와 동일한 위치를 사용하여 마우스의 감쇠 기반 3D 렌더링 볼륨. (E) 마우스 폐의 우엽을 관통하는 대표적인 슬라이스 (D)는 중성자 감쇠의 상이한 구배(대부분 낮은 감쇠)를 갖는 폐의 구조를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 중성자 컴퓨터 단층 촬영 및 식물 뿌리/토양 시스템을 통한 슬라이스 . (A) 식물 샘플 사진. (B) 식물의 중성자 컴퓨터 단층 촬영에서 3D 렌더링 된 볼륨은 땅 위의 줄기와 물이있는 토양 시스템 (빨간색)을 보여줍니다. (C)와 (D)는 토양의 줄기와 뿌리를 보여주기 위해 각진 샘플을 절단한 것입니다(빨간색 화살표). 토양의 짙은 파란색 영역은 물의 존재를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
생물학적 샘플의 중성자 방사선 촬영 및 CT는 X선 영상 또는 자기 공명 영상을 보완하는 유망한 영상 기술입니다. 생물학적 샘플의 중성자 이미징 실험을 수행하는 데 있어 중요한 단계는 빔라인에서의 준비 및 봉쇄와 관련이 있습니다. 실험의 최적화는 답해야 할 과학적 질문에 의해 주도됩니다. 과학 문제가 현상을 관찰하기 위해 높은 공간 해상도가 필요한 경우 긴 획득 시간이 필요하며 nCT(cm 크기 시야각)의 단점은 스캔을 수행하는 데 몇 시간이 걸린다는 것입니다. 이는 주로 싱크로트론 소스와 비교하여 원자로에서 사용할 수 있는 전체 중성자 플럭스의 차이 때문이며, 여기서 X선 CT 스캔은 몇 mm2 시야에서 몇 초에서 몇 분이 걸릴 수 있습니다. 이 방법은 동물에서 추출한 생체 외 조직 샘플에 적용할 수 있지만 방사선 노출 위험(예: 중성자에 의해 생성된 감마선 및 샘플의 원자와 중성자 상호 작용)으로 인해 살아있는 동물이나 인간에게 생체 내에서 확장할 수 없습니다. 그러나 물 흡수 역학과 같은 식물 뿌리/토양 상호 작용(그림 7)의 이미징에 매우 적합합니다.
식물 역학에 빠른 nCT를 사용하는 이점은 X선 CT와 달리 물에서 H에 민감하고 식물에 방사선 손상이 없다는 것입니다. 또한, 쥐 대퇴골과 같은 뼈/금속 샘플에서 중성자를 사용하면 금속이 주변 조직에 비해 상대적으로 투명하여(그림 5) X선 CT39에 의해 유도된 금속 인공물을 잠재적으로 피할 수 있는 독특한 대조를 관찰할 수 있습니다. 마우스 폐(그림 6)와 같은 동물 조직은 중성자가 H에 민감하기 때문에 연조직 구조의 인상적인 검출을 보여주지만 공간 분해능은 이러한 측정에서 다소 제한 요소입니다. 대조는 생물학적 샘플19,39에 존재하는 H 원자에 의해 제공된다.
중성자 격자 간섭계와 같은 새로운 기술의 발전과 공간 분해능의 개선(최근 몇 미크론이 보고됨42,43)으로 중성자 이미징은 공간 분해능이 개선된 생물학적 조직에 대한 새로운 대비 메커니즘을 제공할 수 있습니다. 고에너지 중성자의 탐사(두꺼운 샘플을 측정할 수 있음)는 또한 온전한 마우스와 같은 동물 조직의 더 큰 부분을 측정할 수 있는 능력을 약속하여 생물 의학 연구에 새로운 가능성을 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구의 일부는 UT-Battelle, LLC와 DE-AC05-00OR22725 계약에 따라 ORNL이 운영하고 미국 에너지부, 과학실, 사용자 시설이 후원하는 고플럭스 동위원소 원자로의 자원을 활용했습니다. 이 연구의 일부는 Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship 프로그램을 통해 ORNL의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research의 후원을 받았습니다. 쥐 대퇴골 샘플은 NIH(R01AR066562)와 정형외과 연구 및 교육 재단-Smith and Nephew 상으로부터 얻은 자금으로 Rush University Medical Center의 Dr. Rick Sumner와 공동으로 수행한 실험에서 얻었습니다. 팀은 중성자 산란 빔라인을 사용할 수 있도록 하는 HFIR 지원 팀에 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum containers | custom | Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample | |
| Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | Mouse lung sample containment |
| Deionized water or deuterium oxide | Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample | ||
| Ethanol | Fisher | 04-355-223 | Mouse lung sample |
| Gauze sponges | CardinalHealth | Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample | |
| Growth chamber | Conviron | A1000 | Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample |
| Laboratory balance | Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample | ||
| Pure silica sand | US Silica Co. | Flint#13 | Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample |
| Sprague-Dawley Rats | Harlan | Order Code: 002-US | Rat femur sample |
| Titanium Rod | Goodfellow | TI007905 | Rat femur sample |
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