Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado

Jing Zhang; Jing Huang; Ishani Majumdar; Ryan C. James; Julia Gichimu; Manikandan Paramasivam; Durga Pokharel; Himabindu Gali; Marina  A. Bellani; Michael  M Seidman

doi:10.3791/61689

Artigo de método

Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado

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DOI:

10.3791/61689

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27 de julho de 2021

Jing Zhang^*¹ , Jing Huang^*² , Ishani Majumdar¹ , Ryan C. James³ , Julia Gichimu¹ , Manikandan Paramasivam⁴ , Durga Pokharel⁵ , Himabindu Gali⁶ , Marina A. Bellani¹ , Michael M Seidman¹

¹Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, ²Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, ³Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, ⁴Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, ⁵Horizon Discovery, ⁶Boston University School of Medicine

^* These authors contributed equally

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Resumo

Enquanto colisões de bifurcação de replicação com adutos de DNA podem induzir quebras de fita dupla, pouco se sabe sobre a interação entre replisomos e lesões de bloqueio. Empregamos o ensaio de ligadura de proximidade para visualizar esses encontros e caracterizar as consequências para a composição do replisome.

Resumo

Considerável conhecimento está presente na resposta celular a quebras de fita dupla (DSBs), induzidas por nucleases, radiação e outros quebradores de DNA. Em parte, isso reflete a disponibilidade de métodos para a identificação de locais de quebra e caracterização de fatores recrutados para DSBs nessas sequências. No entanto, os DSBs também aparecem como intermediários durante o processamento de adutos de DNA formados por compostos que não causam diretamente quebras e não reagem em locais específicos de sequência. Consequentemente, para a maioria desses agentes, tecnologias que permitem a análise de interações de ligação com fatores de resposta e proteínas de reparo são desconhecidas. Por exemplo, ligações cruzadas de DNA interstrand (ICLs) podem provocar quebras após encontros de bifurcação de replicação. Apesar de formados por fármacos amplamente utilizados como quimioterápicos do câncer, ainda não existe uma metodologia para monitorar suas interações com proteínas de replicação.

Aqui, descrevemos nossa estratégia para acompanhar a resposta celular a colisões de bifurcação com esses adutos desafiadores. Ligamos um antígeno esteroide ao psoraleno, que forma ICLs dependentes de fotoativação em núcleos de células vivas. As LCIs foram visualizadas por imunofluorescência contra o antígeno tag. A tag também pode ser parceira no Ensaio de Ligadura de Proximidade (PLA), que relata a associação próxima de dois antígenos. O PLA foi explorado para distinguir proteínas que estavam intimamente associadas com as ICLs marcadas daquelas que não estavam. Foi possível definir proteínas replisomes que foram retidas após encontros com ICLs e identificar outras que foram perdidas. Esta abordagem é aplicável a qualquer estrutura ou aduto de DNA que possa ser detectado imunologicamente.

Introdução

A resposta celular a quebras de fitas duplas está bem documentada devido a uma sucessão de métodos cada vez mais poderosos para direcionar quebras para sítios genômicos específicos ^1,2,3. A certeza da localização permite a caracterização inequívoca de proteínas e outros fatores que se acumulam no local e participam da Resposta a Danos no DNA (DDR), conduzindo assim as vias de Junção Final Não Homóloga (NHEJ) e Recombinação Homóloga (HR) que reparam quebras. É claro que muitas quebras são introduzidas por agentes como radiação e espécies químicas que não atacam sequências espe....