Artigo de método

Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado

DOI:

10.3791/61689

⸱

27 de julho de 2021

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1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine

* These authors contributed equally

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Resumo

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Enquanto colisões de bifurcação de replicação com adutos de DNA podem induzir quebras de fita dupla, pouco se sabe sobre a interação entre replisomos e lesões de bloqueio. Empregamos o ensaio de ligadura de proximidade para visualizar esses encontros e caracterizar as consequências para a composição do replisome.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Considerável conhecimento está presente na resposta celular a quebras de fita dupla (DSBs), induzidas por nucleases, radiação e outros quebradores de DNA. Em parte, isso reflete a disponibilidade de métodos para a identificação de locais de quebra e caracterização de fatores recrutados para DSBs nessas sequências. No entanto, os DSBs também aparecem como intermediários durante o processamento de adutos de DNA formados por compostos que não causam diretamente quebras e não reagem em locais específicos de sequência. Consequentemente, para a maioria desses agentes, tecnologias que permitem a análise de interações de ligação com fatores de resposta e proteínas de reparo são desconhecidas. Por exemplo, ligações cruzadas de DNA interstrand (ICLs) podem provocar quebras após encontros de bifurcação de replicação. Apesar de formados por fármacos amplamente utilizados como quimioterápicos do câncer, ainda não existe uma metodologia para monitorar suas interações com proteínas de replicação.

Aqui, descrevemos nossa estratégia para acompanhar a resposta celular a colisões de bifurcação com esses adutos desafiadores. Ligamos um antígeno esteroide ao psoraleno, que forma ICLs dependentes de fotoativação em núcleos de células vivas. As LCIs foram visualizadas por imunofluorescência contra o antígeno tag. A tag também pode ser parceira no Ensaio de Ligadura de Proximidade (PLA), que relata a associação próxima de dois antígenos. O PLA foi explorado para distinguir proteínas que estavam intimamente associadas com as ICLs marcadas daquelas que não estavam. Foi possível definir proteínas replisomes que foram retidas após encontros com ICLs e identificar outras que foram perdidas. Esta abordagem é aplicável a qualquer estrutura ou aduto de DNA que possa ser detectado imunologicamente.

Introdução

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A resposta celular a quebras de fitas duplas está bem documentada devido a uma sucessão de métodos cada vez mais poderosos para direcionar quebras para sítios genômicos específicos 1,2,3. A certeza da localização permite a caracterização inequívoca de proteínas e outros fatores que se acumulam no local e participam da Resposta a Danos no DNA (DDR), conduzindo assim as vias de Junção Final Não Homóloga (NHEJ) e Recombinação Homóloga (HR) que reparam quebras. É claro que muitas quebras são introduzidas por agentes como radiação e espécies químicas que não atacam sequências específicas4. Entretanto, para estes existem procedimentos disponíveis que podem converter as extremidades em estruturas passíveis de marcação e localização 5,6. As quebras também são introduzidas por processos biológicos, como o rearranjo de imunoglobulinas, e tecnologia recente permite sua localização, assim como7. A relação entre os fatores de resposta e esses locais pode então ser determinada.

As quebras também aparecem como uma consequência indireta de adutos formados por compostos que não são disjuntores inerentes, mas interrompem transações de DNA, como transcrição e replicação. Eles podem ser formados como uma característica da resposta celular a essas obstruções, talvez durante o reparo ou porque provocam uma estrutura vulnerável ao ataque de nucleases. Tipicamente, a relação física entre o aduto, a quebra e a associação com fatores respondedores é inferencial. Por exemplo, as LCIs são formadas por quimioterápicos como cisplatina e mitomicina C8 e como produto reacional de sítios abásicos9. As ILPs são bem conhecidas como blocos potentes para bifurcações de replicação10, estancando assim garfos que podem ser clivados por nucleases11. A ligação covalente entre as fitas é frequentemente aliviada por vias que têm quebras obrigatórias como intermediários12,13, necessitando de recombinação homóloga para reconstruir a bifurcação de replicação 14. Na maioria dos experimentos, o investigador acompanha a resposta de fatores de interesse às quebras que se formam a jusante da colisão de uma bifurcação de replicação com uma ICL. Entretanto, como não há tecnologia para a localização de uma lesão provocativa, a proximidade do replisome, e de suas partes componentes, com a LCI só pode ser presumida.

Desenvolvemos uma estratégia para permitir a análise de associações de proteínas com adutos covalentes não sequenciais específicos, ilustrada aqui por ILPs. Em nosso sistema, estes são introduzidos pelo psoraleno, um produto natural fotoativo utilizado há milhares de anos como terapêutico para doenças de pele15. Nossa abordagem é baseada em duas características importantes dos psoralens. O primeiro é a alta frequência de formação de ligações cruzadas, que pode ultrapassar 90% dos adutos, em contraste com os menos de 10% formados por compostos populares como a cisplatina ou a mitomicina C 8,16. A segunda é a acessibilidade do composto à conjugação sem perda da capacidade de reticulação. Nós ligamos covalentemente o trimetil psoraleno à digoxigenina (Dig), um imunotag há muito estabelecido. Isso permite a detecção dos adutos psoralenos no DNA genômico por imunomarcação do tag Dig e visualização por imunofluorescênciaconvencional17.

Este reagente foi aplicado, em nosso trabalho anterior, na análise de encontros de bifurcação de replicação com ILCs usando um ensaio baseado em fibras de DNA16. Nesse trabalho, descobrimos que a replicação poderia continuar após uma ICL intacta. Isso foi dependente da quinase ATR, que é ativada pelo estresse de replicação. O reinício da replicação foi inesperado, dada a estrutura da helicase replicativa da CMG. Este consiste no hetero-hexâmero MCM (M) que forma um anel deslocado ao redor da fita molde para a síntese da fita principal que é bloqueada pelas proteínas do complexo GINS (G, consistindo de PSF1, 2, 3 e SLD5) e CDC45 (C)18. A proposta de que a replicação poderia ser reiniciada no lado da LCI distal ao lado da colisão do replisome defendia uma mudança na estrutura do replisome. Para abordar a questão de quais componentes estavam no replisome no momento do encontro com uma ICL, desenvolvemos a abordagem aqui descrita. Exploramos o tag Dig como parceiro em Ensaios de Ligadura de Proximidade (PLA)19 para interrogar a estreita associação da LCI com proteínas do replisome20.

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Protocolo

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1. Preparação celular

  1. Dia 1
    1. Pré-trate pratos de cultura com fundo de vidro de 35 mm com uma solução adesiva celular.
    2. Células em placa nos pratos pré-tratados um dia antes do tratamento. A célula deve estar se dividindo ativamente e 50-70% confluente no dia do experimento.
      OBS: Células HeLa foram utilizadas neste experimento com Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1x penicilina/estreptomicina. Não há restrição para linhagens celulares aderentes. No entanto, células não aderentes devem ser centrifugadas em lâminas e fixadas antes da análise por PLA.
  2. Dia 2
    1. Preparar uma solução-mãe de Digoxigenina Trimetil psoraleno (Dig-TMP) ressuspendendo uma alíquota congelada de Dig-TMP previamente sintetizada em 1:1 EtOH:H 2 O. Determinar aconcentração medindo OD a 250 nm de uma diluição de 100x (em H2O) do Dig-TMP dissolvido. O coeficiente de extinção do Dig-TMP é de 25.000. Verificar a concentração medindo OD a 250 nm antes de cada utilização e calcular a concentração de existência: Abs x 100 x 106/25.000 = Concentração (em μM). Geralmente, a solução estoque é em torno de 3 mM. A solução pode ser armazenada em –20 °C por cerca de um mês.
      NOTA: Dig-TMP deve ser sintetizado quimicamente com antecedência, seguindo o procedimento descrito aqui. Refluxo 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno com 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodi-amina em tolueno sob nitrogênio por 12 h. Remover o solvente e recuperar o produto 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno por cromatografia de sílica gel. Conjugar o produto ao éster NHS de digoxigenina em dimetilformamida e trietilamina a 50 °C durante 18 horas. Remova o solvente e purifice o resíduo por cromatografia preparativa em camada delgada de sílica gel. Eluir a banda do produto clorofórmio: metanol: mistura de hidróxido de amónio a 28% (8:1:0.1). Evaporar os solventes e dissolver o pellet em 50% de EtOH:H2O.
    2. Adicionar o estoque de Dig-TMP em 50% de EtOH:H2O ao meio de cultura celular até uma concentração final de 5 μM. Levar o meio a 37 °C. Aspirar o meio das placas, adicionar o meio contendo Dig-TMP pré-aquecido e colocar as placas em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) por 30 min para permitir que o Dig-TMP se equilibre.
    3. Enquanto as células estão incubando, pré-aqueça a caixa UV (ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
    4. Colocar as placas na caixa UV pré-aquecida e expor as células a uma dose de 3 J/cm2 de luz UVA por 5 min para este experimento. As placas foram colocadas sobre um termobloco mantido a 37 °C, durante a irradiação. Calcule o tempo usando a fórmula:
      figure-protocol-1
    5. Aspirar o meio com uma pipeta, adicionar o meio pré-aquecido fresco e colocar as placas de volta na incubadora a 37 °C, 5% CO2 por 1 h.
    6. Retire o meio e lave a louça uma vez suavemente com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    7. Remover PBS e adicionar 0,1% de formaldeído (FA) em PBS por 5 min à temperatura ambiente (TR). Isso evita o desprendimento celular durante o pré-tratamento do CSK-R (tampão de extração do citoesqueleto contendo RNase, descrito em 1.2.9.) necessário para extrair os elementos citoplasmáticos e reduzir o fundo do PLA.
    8. Aspirar FA e lavar a louça com PBS uma vez.
    9. Adicionar tampão CSK-R e incubar por 5 min em RT para remover o citoplasma [tampão CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM sacarose, 3 mM MgCl2, 0,5%Triton X-100, 300 μg/mL RNase A]. Aspirar o tampão, adicionar CSK-R fresco e incubar por 5 min no TR.
      NOTA: Um estoque de buffer CSK pode ser armazenado a 4 °C, e Triton X e RNaseA adicionados logo antes do uso.
    10. Lave com PBS três vezes.
    11. Fixar as células com formaldeído a 4% em PBS por 10 min em TR.
    12. Lave as células com PBS. Execute esta etapa três vezes.
    13. Adicionar metanol 100% frio e incubar por 20 min a -20 °C.
    14. Lave as células com PBS três vezes. Neste ponto, as células podem ser armazenadas em PBS em uma câmara úmida a 4 °C por até uma semana.
    15. Incubar as células em 80 μL de TritonX-100 5 mM durante 10 min a 4 °C.
    16. Incubar células com 100 μL de EDTA 5 mM em PBS suplementado com 1 μL de 100 mg/mL RNase A por 30 min a 37 °C.
    17. Lave as células com PBS três vezes.
    18. Armazenar células em tampão de bloqueio (5% de BSA e 10% de soro de cabra em PBS) em uma câmara úmida durante a noite a 4 °C.

2. Ensaio de ligadura de proximidade

OBS: Realizar ensaio de ligadura de proximidade no dia 3.

  1. Coloração de anticorpos
    1. Preparar 40 μL da solução de anticorpos primários por placa: Adicionar o volume apropriado de anticorpos primários para alcançar a diluição desejada (antidigoxigenina de camundongo e anticorpo de coelho contra um componente de replisome como MCM5, CDC45, PSF1 ou pMCM2, diluições especificadas na Tabela de Materiais) no tampão de bloqueio (para atingir um volume final de 24 μL). Misture batendo e deixe descansar por 20 minutos no RT. Prepare uma mistura mestre para várias amostras e misture tocando antes de aplicar nos poços.
    2. Adicionar 40 μL de solução de anticorpos primários ao centro do poço e incubar numa câmara húmida durante 1 h a 37 °C. Durante a coloração, deixe as sondas de PLA e o tampão de bloqueio aquecerem até a temperatura ambiente.
    3. Lave as células com PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 em 1X PBS] no RT. Execute esta etapa três vezes.
    4. Durante a lavagem, prepare 40 μL de solução de sonda de PLA por prato (as sondas de PLA consistem em um anticorpo secundário que reconhece IgG de coelho ou camundongo, ligada covalentemente a um oligonucleotídeo PLUS ou MINUS): 8 μL de sonda PLA anti mouse-PLUS + 8 μL de sonda PLA anticorpo anticoelho-MENOS + 24 μL de tampão de bloqueio. Misture e deixe descansar por 20 min no RT. Prepare uma mistura mestre para várias amostras e misture bem antes de aplicar nos poços. Coloque a solução no meio do poço no prato.
    5. Remover a última lavagem, adicionar 40 μL de solução de sonda de PLA ao centro do poço e incubar em uma câmara úmida por 1 h a 37 °C.
    6. Lavar em tampão A três vezes, por 10 min cada, em uma plataforma basculante em RT. Durante a lavagem, leve a mistura de ligadura para RT.
  2. Ligadura e amplificação
    1. Preparar 40 μL de mistura de ligadura por placa: 8 μL (5x) de caldo de ligadura + 31 μL de água destilada + 1 μL de ligase. Prepare a mistura mestra para várias placas e misture bem antes de aplicar nos poços.
    2. Adicionar 40 μL de solução de ligadura a cada placa e incubar numa câmara húmida durante 30 minutos a 37 °C.
    3. Lave as células 3x com tampão A, cada uma por 2 min, em uma plataforma basculante em RT.
    4. Preparar 40 μL de solução de amplificação por prato: 8 μL (5x) de estoque de amplificação + 31,5 μL de água destilada + 0,5 μL de DNA Polimerase. Prepare uma mistura mestra para várias amostras e misture bem antes de aplicar nos poços.
    5. Adicionar 40 μL de solução de amplificação a cada placa e incubar numa câmara húmida a 37 °C durante 100 min.
    6. Aspirar a solução de amplificação e lavar com tampão B. Realizar 6 lavagens cada por 10 min, em uma plataforma basculante em RT.
    7. Lavar uma vez com 0,01x tampão B por 1 min no TR.
    8. Aspirar o tampão B e incubar placas com anticorpos secundários, Alexa Fluor 488 anti-ratinho IgG e Alexa Fluor 568 anti-coelho IgG em solução de bloqueio em diluições apropriadas em tampão de bloqueio, numa câmara húmida, durante 30 minutos a 37 °C ou durante a noite a 4 °C.
    9. Lave as células três vezes com PBS-T, por 10 min cada, em uma plataforma basculante em RT.
    10. Aspirar PBS-T e montar em meio de montagem com DAPI. As placas montadas podem ser fotografadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C no escuro por no máximo 4 dias antes da obtenção de imagens.

3. Imagem e quantificação

  1. Realizar imagens em um microscópio epifluorescente ou confocal (se a imagem 3D for desejável, cubra pelo menos 3 μm em 15 pilhas). Realizar experimentos em triplicata e obter imagens de um número suficiente de campos para fazer pelo menos 100 observações por amostra ou condição. Crie imagens de todos os campos e amostras, incluindo controles, usando as mesmas configurações de exposição.
  2. Quantifique com um software de análise de imagem apropriado (consulte Tabela de Materiais para software de código aberto e comercial capaz de realizar essa análise em imagens de plano único ou múltiplo).
    1. Núcleos celulares segmentados com base na coloração DAPI. Realizar detecção de pontos nucleares do PLA. Atribua pontos PLA ao seu núcleo correspondente. Exporte pontos PLA por resultados de núcleo como um arquivo csv (consulte Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2).
  3. Análise estatística (ver Tabela de Materiais para software comercial e de código aberto sugerido).
    1. Verifique se as amostras seguem uma distribuição normal com um teste de Shapiro-Wilk.
    2. Determine se há uma diferença significativa entre duas amostras usando um teste t de Student (se a suposição de distribuição normal for atendida) ou um teste de Wilcoxon-Rank Sum (se a suposição de distribuição normal for violada para uma amostra).
  4. Visualização de dados: Gere gráficos de pontos combinados com gráficos de caixa para visualizar a distribuição dos dados, mediana (Q2), 25º (Q1) e percentil 75 para as diferentesamostras (Veja Tabela de Materiais para software comercial e de código aberto sugerido).

4.3D exibição de pMCM2: interações ICL

  1. Imagem de placas PLA em microscópio confocal de disco giratório, usando uma objetiva de óleo de abertura numérica Plan Fluor 60x/1.25. Adquira 16 pilhas cobrindo 1,6 mm e gere a reconstrução 3D com o software de análise de imagem apropriado (consulte a Tabela de Materiais).

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Resultados

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PLA de Dig-TMP com proteínas replisome
A estrutura do Dig-TMP é mostrada na Figura 1. Os detalhes da síntese, na qual o trimetilpsoraleno foi conjugado através de um ligante glicol à digoxigenina, foram discutidos anteriormente17,21. A incubação das células com o composto seguida de exposição à luz de 365 nm (UVA) fotoativa o composto e conduz a reação de reticulação. Pouco mais de 90% dos adutos são LCIs

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Discussão

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Embora o PLA seja uma técnica muito poderosa, existem preocupações técnicas que devem ser resolvidas para a obtenção de resultados claros e reprodutíveis. Os anticorpos devem ser de alta afinidade e especificidade. Além disso, é importante reduzir ao máximo os sinais de fundo não específicos. Descobrimos que membranas e detritos celulares contribuem para o fundo e os removemos o máximo possível. As lavagens com detergente contendo tampões antes da fixação, e a lavagem com metanol após a fixação ajudam a reduzir a ligação...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada, em parte, pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, National Institute on Aging, Estados Unidos (Z01-AG000746–08). J.H. é apoiado pela National Natural Science Foundations of China (21708007 e 31871365).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 568, anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG (H + L)InvitrogenA-100111 em 1000
placas de 35 mm com lamínula de vidro 1,5 MatTekP35-1.5-14-CPlacas de micropoços com fundo de vidro Placa de Petri de 35 mm Microwell
Alexa Fluor 488, IgG de cabra anti-rato (H + L) Anticorpo secundário de adsorção cruzadaInvitrogenA-100011 em 1000
Soro bovino albumina (BSA)SeraCare1900-0012Solução de bloqueio, os reagentes precisam ser armazenados a 4 &graus; C
CDC45 anticorpo (coelho)Abcamab1267621 em 200
Adesivo celularLife Science354240para solução de célula-TAK
Microscópio confocalNikkonNikon TE2000 microscópio de disco giratórioequipado com software Volocity
Anticorpo Digoxigenina (Dig) (mouse)Abcamab4201 em 200
Dig-TMPsintetizado no Reagentes de amplificação Seidman Lab
Duolink (5 vezes;)DUO82010Sigma-Aldrichprecisam ser armazenados a -20 &graus; C
Reagentes de detecção in situ Duolinkde DUO92007Sigma-Aldrichprecisam ser armazenados a -20 ° C
Duolink sonda PLA de oligonucleotídeo in situ MINUSSigma-AldrichDUO92004anti-mouse MINUS, os reagentes precisam ser armazenados a 4 &graus; C
Duolink sonda PLA de oligonucleotídeo in situ PLUSSigma-AldrichDUO92002anti-coelho PLUS, os reagentes precisam ser armazenados a 4 ° C
Tampão de lavagem in situ Duolink ASigma-AldrichDUO82046Duolink Wash Buffers, os reagentes precisam ser armazenados a 4 & C
Tampão de lavagem in situ Duolink BSigma-AldrichDUO82048Duolink Wash Buffers, os reagentes precisam ser armazenados a 4 °
Microscópio epifluorescenteC Microscópio ZeissAxiovert 200MEquipado com os pacotes de software Axio Vision (Zeiss, Alemanha)
Formaldeído 16%Fisher ScientificPI28906para solução fixa
Soro de cabraThermo31873Solução de bloqueio, os reagentes precisam ser armazenados a 4 ° C
Software de análise de imagemde código abertoO Cell profilerfunciona para análise de imagens de plano único Licença de software de
análise de imagem necessáriaMódulo BitplaneImarisCell Biology necessário. Pode quantificar pontos/núcleos de PLA em pilhas de imagens (3D) e fazer reconstruções 3D
Ligase (1 unidade/μ l)de DUO82029Sigma-Aldrichprecisam ser armazenados a -20 &graus; Reagente
de ligação C (5 vezes;)OsDUO82009 Sigma-Aldrichprecisam ser armazenados a -20 &graus; C
MCM2 anticorpo (coelho)Abcamab44611 em 200
MCM5 anticorpo (coelho monoclonal)AbcamAb759751 em 1000
Metanol Lab ALLEYA2076pré-frio a -20° C antes de usar
anticorpo fosfoMCM2S108 (coelho)Abcamab1092711 em 200
Polimerase (10 unidade/μ l)de DUO82030Sigma-Aldrichprecisam ser armazenados a -20 & C
Prolongue a mídia de montagem de ouro com DAPIThermoFisher ScientificP36935
PSF1 anticorpo (coelho)Abcamab1811121 em 200
RNAse A 100 mg/mlQiagen19101precisam ser armazenados a 4 &graus; C
Software de análise estatística e visualização de dadosde código abertoR studiopacote ggplot2 para geração de gráficos de pontos e gráficos de caixa
Análise estatística e visualização de dados licença de software necessáriaSystat SoftwareSigmaplot V13
TMP (trioxalen)Sigma-AldrichT6137_1G
TritonX-100Sigma-AldrichT8787_250ML
Tween 20Sigma-AldrichP9416_100ML
caixa UVSouthern New England UltravioletDescontinuado. Veja a câmara de teste UV Opsytec como uma possível substituição
câmara de teste UVCâmara de teste UV OpsytecBS-04
VE-821SelleckchemS8007é 1µ O
de cabra Os reagentes Os reagentes Os reagentes reagentes Os reagentes Os reagentes da A concentração final de

Referências

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Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 1/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

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Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

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