Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/61689
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1, 4, 5, 6, 1, 1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen, 5Horizon Discovery, 6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

בעוד התנגשויות מזלג שכפול עם צינורות DNA יכול לגרום לשברים גדיל כפול, פחות ידוע על האינטראקציה בין replisomes וחסימת נגעים. השתמשנו במבחן קשירת הקרבה כדי להמחיש מפגשים אלה ולאפיין את ההשלכות על קומפוזיציה רפלימית.

Abstract

תובנה משמעותית קיימת לגבי התגובה התאית לשברי גדיל כפול (DSB), הנגרמים על ידי נוקלאזות, קרינה ומפסקי דנ"א אחרים. בין השאר, הדבר משקף את זמינותן של שיטות לזיהוי אתרי הפסקה, ואת אפיון הגורמים שגויסו ל-DSB ברצפים אלה. עם זאת, DSBs מופיעים גם כמתווכים במהלך עיבוד של צינורות DNA שנוצרו על ידי תרכובות שאינן גורמות ישירות להפסקות, ואינן מגיבות באתרי רצף ספציפיים. כתוצאה מכך, עבור רוב סוכנים אלה, טכנולוגיות המאפשרות ניתוח של אינטראקציות קשירה עם גורמי תגובה וחלבוני תיקון אינם ידועים. לדוגמה, קישורים צולבים בין גדילי דנ"א (ICLs) יכולים לעורר שברים בעקבות מפגשי מזלג שכפול. למרות שנוצרו על ידי תרופות בשימוש נרחב כמו כימותרפיה סרטן, לא היתה מתודולוגיה לניטור האינטראקציות שלהם עם חלבונים שכפול.

כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו לעקוב אחר התגובה התאית להתנגשויות מזלג עם adducts מאתגר אלה. קישרנו אנטיגן סטרואידים לפסורלן, היוצר כיל תלוי פוטואקטיבציה בגרעינים של תאים חיים. הכילים הודגמו על ידי אימונופלואורסנציה כנגד תג האנטיגן. התג יכול גם להיות שותף בבדיקת קשירת הקרבה (PLA) המדווחת על קשר הדוק של שני אנטיגנים. ה-PLA נוצל כדי להבדיל בין חלבונים שהיו קשורים קשר הדוק עם כיל מתויגת לבין חלבונים שלא. ניתן היה להגדיר חלבונים רפליזומיים שנשמרו לאחר מפגשים עם כיל ולזהות חלבונים אחרים שאבדו. גישה זו ישימה לכל מבנה או צינור DNA שניתן לזהות באופן אימונולוגי.

Introduction

התגובה התאית לשברים כפולים מתועדת היטב הודות לרצף של שיטות חזקות יותר ויותר להכוונת הפסקות לאתרים גנומיים ספציפיים 1,2,3. ודאות המיקום מאפשרת אפיון חד משמעי של חלבונים וגורמים אחרים המצטברים באתר ומשתתפים בתגובת הנזק לדנ"א (DDR), ובכך מניעים את מסלולי חיבור הקצה הלא הומולוגי (NHEJ) והקומבינציה ההומולוגית (HR) המתקנים שברים. כמובן, הפסקות רבות מוצגות על ידי סוכנים כגון קרינה ומינים כימיים שאינם תוקפים רצפים ספציפיים4. עם זאת, עבור אלה ישנם נהלים זמינים שיכולים להמיר את הקצוות למבנים מקובלים עבור תיוג לוקליזציה 5,6. הפסקות מוצגות גם על ידי תהליכים ביולוגיים, כגון סידור מחדש של אימונוגלובולינים, והטכנולוגיה העדכנית מאפשרת לוקליזציה שלהם, כמו גם7. לאחר מכן ניתן לקבוע את הקשר בין הגורמים המגיבים לבין אתרים אלה.

הפסקות מופיעות גם כתוצאה עקיפה של אדדוקציות הנוצרות על ידי תרכובות שאינן מפסקות אינהרנטיות אלא משבשות עסקאות DNA כגון שעתוק ושכפול. הם עשויים להיווצר כתכונה של התגובה התאית לחסימות אלה, אולי במהלך תיקון או משום שהם מעוררים מבנה פגיע להתקפת נוקלאז. בדרך כלל, הקשר הפיזי בין האדוקט, ההפסקה והקשר עם גורמים מגיבים הוא היסק. לדוגמה, כילים נוצרים על ידי כימותרפיות כגון ציספלטין ומיטומיצין C8 וכתוצר תגובה של אתרים בסיסיים9. מזלגות כיל ידועים כבלוקים חזקים למזלגות שכפול10, ובכך מעכבים מזלגות שניתן לבקע על ידי נוקלאזות11. הקישור הקוולנטי בין הגדילים מוקל לעתים קרובות על ידי מסלולים שיש להם הפסקות מחייבות כביניים 12,13, מה שמחייב רקומבינציה הומולוגית כדי לבנות מחדש את מזלג השכפול14. ברוב הניסויים עוקב החוקר אחר תגובת הגורמים המעניינים להפסקות הנוצרות במורד הזרם של התנגשות מזלג שכפול עם כיל. עם זאת, מכיוון שלא נמצאה טכנולוגיה ללוקליזציה של נגע פרובוקטיבי, ניתן רק להניח את קרבתו של הרפליזום, וחלקיו המרכיבים, לכיל.

פיתחנו אסטרטגיה המאפשרת ניתוח של אסוציאציות חלבוניות עם אדדוקטים קוולנטיים ספציפיים שאינם רצפים, כפי שמודגם כאן על ידי ICLs. במערכת שלנו אלה מוצגים על ידי psoralen, מוצר טבעי פוטואקטיבי המשמש במשך אלפי שנים כטיפול להפרעות עור15. הגישה שלנו מבוססת על שתי תכונות חשובות של פסאורלן. הראשון הוא התדירות הגבוהה שלהם של היווצרות crosslink, אשר יכול לעלות על 90% של adducts, בניגוד פחות מ 10% שנוצרו על ידי תרכובות פופולריות כגון cisplatin או Mitomycin C 8,16. השני הוא נגישות המתחם לצמידות ללא אובדן יכולת הצלבה. קישרנו באופן קוולנטי בין טרימתיל פסאורלן לדיגוקסיגנין (Dig), אימונוטאג ותיק. זה מאפשר זיהוי של adducts psoralen בדנ"א גנומי על ידי immunostaining של תג Dig, והדמיה על ידי immunofluorescence קונבנציונאלי17.

מגיב זה יושם, בעבודתנו הקודמת, לניתוח מפגשי מזלג שכפול עם כיל באמצעות בדיקה מבוססת סיבי DNA16. בעבודה זו מצאנו כי השכפול יכול להימשך מעבר לכיל שלמה. זה היה תלוי בקינאז ATR, אשר מופעל על ידי מתח שכפול. ההפעלה מחדש של השכפול הייתה בלתי צפויה בהתחשב במבנה של מנחת המסוקים המשוכפל CMG. זה מורכב מהטרו-הקסמר MCM (M) היוצר טבעת פעורת היסט סביב גדיל התבנית לסינתזה מובילה של גדיל אשר ננעל על ידי החלבונים של קומפלקס GINS (G, המורכב מ- PSF1, 2, 3 ו- SLD5) ו- CDC45 (C)18. ההצעה כי השכפול יופעל מחדש בצד הדיסטלי של כיל לצד ההתנגשות של הרפליזום טענה לשינוי במבנה הרפליזום. כדי לענות על השאלה אילו רכיבים היו בתשובה בזמן המפגש עם כיל פיתחנו את הגישה המתוארת כאן. ניצלנו את תג Dig כשותף ב-Proximity Ligation Assays (PLA)19 כדי לחקור את הקשר ההדוק של כיל עם חלבונים של replisome20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים

  1. יום 1
    1. טפלו מראש בכלי תרבית בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית בתמיסת הדבקת תאים.
    2. תאי צלחת במנות שטופלו מראש יום לפני הטיפול. התא צריך להתחלק באופן פעיל ו 50-70% במפגש ביום הניסוי.
      הערה: תאי HeLa שימשו בניסוי זה עם Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM, בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1x פניצילין / סטרפטומיצין. אין הגבלה על קווי תאים דבקים. עם זאת, תאים שאינם דבקים חייבים להיות צנטריפוגות על שקופיות ולתקן לפני הניתוח על ידי PLA.
  2. יום 2
    1. הכן תמיסת מלאי של Digoxigenin Trimethyl psoralen (Dig-TMP) על ידי השעיה מחדש של aliquot קפוא של Dig-TMP מסונתז בעבר ב 1:1 EtOH:H 2 O. קבע את הריכוז על ידי מדידת OD ב 250 ננומטר של דילול 100x (ב H2O) של Dig-TMP מומס. מקדם ההכחדה של Dig-TMP הוא 25,000. ודא את הריכוז על ידי מדידת OD ב- 250 ננומטר לפני כל שימוש וחשב ריכוז במלאי: ABS x 100 x 106/25,000 = ריכוז (במיקרומטר). בדרך כלל, פתרון המניות הוא סביב 3 mM. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כחודש.
      הערה: Dig-TMP חייב להיות מסונתז כימית מראש, בהתאם להליך המתואר כאן. ריפלוקס 4'-כלורומתיל-4,5',8-טרימתילפסוראלן עם 4,7,10-טריוקסה-1,13-טרידקנדי-אמין בטולואן תחת חנקן למשך 12 שעות. הסר את הממס ולשחזר את 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen המוצר על ידי כרומטוגרפיה ג'ל סיליקה. הצמידו את המוצר לדיגוקסיגנין NHS אסטר בדימתיל פורממיד וטריאתילאמין ב-50°C למשך 18 שעות. הסר את הממס ולטהר את השאריות על ידי הכנת שכבה דקה סיליקה ג'ל כרומטוגרפיה. יש להדליק את רצועת המוצר כלורופורם: מתנול: 28% תערובת אמוניום הידרוקסיד (8:1:0.1). אידוי הממסים והמסת הגלולה ב-50% EtOH:H2O.
    2. הוסף את מניית Dig-TMP ב-50% EtOH:H2O למדיום תרבית התאים לריכוז סופי של 5 מיקרומטר. הבא את המדיום ל-37°C. שאפו את התווך מהצלחות, הוסיפו את ה-Dig-TMP שחומם מראש והניחו את הצלחות באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-Dig-TMP להתאזן.
    3. בזמן שהתאים דוגרים, חממו מראש את קופסת ה-UV (ראו טבלת חומרים) ל-37°C.
    4. הניחו את הצלחות בקופסת UV מחוממת מראש וחשפו את התאים למינון של 3 J/cm2 של אור UVA למשך 5 דקות עבור ניסוי זה. לוחות הונחו על גבי בלוק תרמי שנשמר ב 37 מעלות צלזיוס, במהלך הקרנה. חשב את הזמן באמצעות הנוסחה:
      Equation 1
    5. שואפים את המדיום באמצעות פיפטה, מוסיפים מדיום טרי שחומם מראש ומניחים את הצלחות בחזרה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך שעה אחת.
    6. יש להסיר את המדיה ולשטוף כלים פעם אחת בעדינות במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
    7. הסר PBS והוסף 0.1% פורמלדהיד (FA) ב- PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). זה מונע ניתוק תאים במהלך CSK-R (cytoskeleton extraction buffer containing RNase, המתואר ב-1.2.9.) טיפול מקדים הנדרש כדי לחלץ את האלמנטים הציטופלזמיים ולהפחית את רקע ה-PLA.
    8. שאפו לצאת מה-FA ולשטוף כלים עם PBS פעם אחת.
    9. הוסף חיץ CSK-R ודגור במשך 5 דקות ב- RT כדי להסיר ציטופלסמה [מאגר CSK-R: 10 mM PIPES, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM סוכרוז, 3 mM MgCl2, 0.5%Triton X-100, 300 מיקרוגרם / מ"ל RNase A]. שאפו את החיץ, הוסיפו CSK-R טרי ודגרו במשך 5 דקות ב-RT.
      הערה: ניתן לאחסן מלאי של מאגר CSK בטמפרטורה של 4°C, ולהוסיף Triton X ו-RNaseA ממש לפני השימוש.
    10. יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים.
    11. תקן תאים עם 4% פורמלדהיד ב- PBS למשך 10 דקות ב- RT.
    12. לשטוף תאים עם PBS. בצע שלב זה שלוש פעמים.
    13. מוסיפים 100% מתנול קר ודגורים במשך 20 דקות בטמפרטורה של -20°C.
    14. לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים. בשלב זה ניתן לאחסן תאים PBS בתא לח ב 4 ° C למשך עד שבוע.
    15. לדגור על תאים ב 80 μL של 5 mM TritonX-100 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    16. לדגור על תאים עם 100 μL של 5 mM EDTA ב PBS בתוספת 1 μL של 100 מ"ג / מ"ל RNase A במשך 30 דקות ב 37 ° C.
    17. לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים.
    18. יש לאחסן תאים במאגר חוסם (5% BSA ו-10% סרום עיזים ב-PBS) בתא לח למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.

2. בדיקת קשירת קרבה

הערה: בצע בדיקת קשירת קרבה ביום השלישי.

  1. הכתמת נוגדנים
    1. הכינו 40 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית לכל צלחת: הוסיפו את הנפח המתאים של נוגדנים ראשוניים כדי להשיג את הדילול הרצוי (עכבר אנטי דיגוקסיגנין ונוגדן ארנב כנגד רכיב רפליזום כגון MCM5, CDC45, PSF1 או pMCM2, דילולים המפורטים בטבלת החומרים) למאגר חוסם (כדי להגיע לנפח סופי של 24 μL). ערבבו על ידי הקשה ותנו לו לעמוד במשך 20 דקות ב- RT. הכינו תערובת אב למספר דוגמאות וערבבו על ידי הקשה לפני החלת על הבארות.
    2. הוסף 40 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית למרכז הבאר ודגר בתא לח במשך 1 שעה ב 37 ° C. במהלך הצביעה, אפשרו לבדיקות ה-PLA ולמאגר החוסם להתחמם לטמפרטורת החדר.
    3. שטוף תאים עם PBS-T [PBS-T: 0.05% Tween-20 in 1X PBS] ב-RT. בצע שלב זה שלוש פעמים.
    4. בזמן השטיפה, הכינו 40 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת PLA לכל צלחת (בדיקות PLA מורכבות מנוגדן משני המזהה IgG של ארנב או עכבר, הקשור באופן קוולנטי לאוליגונוקלאוטיד PLUS או מינוס): 8 μL של נוגדן PLA probe anti mouse-PLUS + 8 μL של נוגדן PLA probe anti rabbit-MINUS + 24 μL של חיץ חוסם. מערבבים ומניחים לו לעמוד במשך 20 דקות ב-RT. הכינו תערובת אב למספר דגימות וערבבו היטב לפני החלת על הבארות. מניחים את התמיסה באמצע הבאר בצלחת.
    5. הסר את השטיפה האחרונה, הוסף 40 μL של תמיסת בדיקה PLA למרכז הבאר, ודגר בתא לח במשך 1 שעה ב 37 ° C.
    6. יש לשטוף במאגר A שלוש פעמים, למשך 10 דקות כל אחת, על משטח הטיה ב-RT. במהלך השטיפה, הביאו את תערובת הקשירה ל-RT.
  2. קשירה והגברה
    1. מכינים 40 μL של תערובת קשירה לצלחת: 8 μL (5x) של ציר קשירה + 31 μL של מים מזוקקים + 1 μL של ליגאז. הכינו תערובת מאסטר למספר צלחות וערבבו היטב לפני החלת על הבארות.
    2. הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת קשירה לכל צלחת ודגרו בתא לח למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
    3. שטפו את התאים 3x עם חיץ A, כל אחד למשך 2 דקות, על משטח הטיה ב-RT.
    4. להכין 40 μL של תמיסת הגברה לכל מנה: 8 μL (5x) של מלאי הגברה + 31.5 μL של מים מזוקקים + 0.5 μL של DNA פולימראז. הכינו תערובת אב למספר דגימות וערבבו היטב לפני החלת הבארות.
    5. הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת הגברה לכל צלחת ודגרו בתא לח בטמפרטורה של 37°C למשך 100 דקות.
    6. יש לשאוף מתמיסת ההגברה ולשטוף עם חיץ B. לבצע 6 שטיפות כל אחת במשך 10 דקות, על משטח הטיה ב-RT.
    7. שטפו פעם אחת עם חיץ B 0.01x למשך דקה אחת ב-RT.
    8. שאפו חיץ B ודגרו על צלחות עם נוגדנים משניים, Alexa Fluor 488 Anti-mouse IgG ו-Alexa Fluor 568 Anti-rabbit IgG בתמיסת חסימה בדילול מתאים בחיץ חוסם, בתא לח, למשך 30 דקות ב-37°C או לילה ב-4°C.
    9. שטפו תאים שלוש פעמים עם PBS-T, למשך 10 דקות כל אחד על משטח הטיה ב-RT.
    10. שאפו PBS-T והרכבו בתווך הרכבה עם DAPI. ניתן לצלם את הלוחות המותקנים באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך לא יותר מ-4 ימים לפני ההדמיה.

3. הדמיה וכימות

  1. בצע הדמיה במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי (אם רצוי הדמיה תלת-ממדית, כסה לפחות 3 מיקרומטר ב-15 ערימות). בצע ניסויים במשולש וצלם מספר מספיק של שדות כדי לבצע לפחות 100 תצפיות לכל דגימה או תנאי. צייר את כל השדות והדגימות, כולל פקדים, באמצעות אותן הגדרות חשיפה.
  2. כימות באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים עבור קוד פתוח ותוכנות מסחריות המסוגלות לבצע ניתוח זה בתמונות מישוריות בודדות או מרובות).
    1. גרעיני תאים מגזריים המבוססים על צביעת DAPI. בצע זיהוי של נקודות PLA גרעיניות. הקצה נקודות PLA לגרעין המתאים להם. ייצוא נקודות PLA לכל גרעין תוצאות כקובץ csv (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2).
  3. ניתוח סטטיסטי (ראה טבלת חומרים לקבלת הצעות לקוד פתוח ולתוכנות מסחריות).
    1. יש לוודא אם הדגימות עוקבות אחר התפלגות תקינה באמצעות בדיקת שפירא-וילק.
    2. קבע אם יש הבדל משמעותי בין שתי דגימות באמצעות מבחן Student-t (אם הנחת ההתפלגות הנורמלית התקיימה) או מבחן Wilcoxon-Rank Sum (אם הנחת ההתפלגות הנורמלית מופרת עבור מדגם).
  4. תצוגה חזותית של נתונים: צור תרשימי נקודות בשילוב עם תרשימי תיבות כדי להציג באופן חזותי את התפלגות הנתונים, החציון (Q2), האחוזון ה-25 (Q1)והאחוזון ה-75 עבור הדגימותהשונות (ראה טבלת חומרים לקבלת קוד פתוח מוצע ותוכנה מסחרית).

4.3D תצוגה של pMCM2: אינטראקציות כיל

  1. תמונה לוחות PLA על מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב, באמצעות מטרת שמן צמצם מספרי Plan Fluor 60x/1.25. רכוש 16 ערימות המכסות 1.6 מ"מ וצור את השחזור התלת-ממדי באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PLA של Dig-TMP עם חלבונים replisome
המבנה של Dig-TMP מוצג באיור 1. פרטי הסינתזה, שבה טרימתיל פסאורלן צומד באמצעות מקשר גליקול לדיגוקסיגנין, נדונו בעבר17,21. דגירה של תאים עם התרכובת ואחריה חשיפה לאור 365 ננומטר (UVA) פוטואקטיבית את התרכובת ומניעה את תגובת הקרוסלינקינג. קצת יותר מ-90% מהחברות הן של כיל16. התג Dig יכול להיות מומחש על-ידי immunofluorescence אשר חושף את נוכחותם של ICL ברחבי הגרעין (איור 2). אימונופלואורסנציה של חלבון רפליזום כגון MCM2 מצביעה גם על התפלגות לאורך הגרעין, התפלגות שאינה מושפעת מהכנסת ICLs. תוצאות אלה הראו כי המראה המוקדי של חלבונים מגיבים, כפי שניתן לראות בתגובת נזק לדנ"א (DDR) ל- DSBs, אינו מאפיין של אינטראקציות רפליזום: ICL.

כדי להמחיש את האינטראקציה של רפליזומים עם כילים בניסוי שמוצג באיור 2 יישמנו את ה-PLA, שמדווח על קרבה של שני אנטיגנים (איור 3a). מדדנו את תדירות השיוך של MCM5 ותג Dig 1 שעות לאחר הצגת ICL (איור 3b). אותות ה-PLA הדגימו את קרבתם של הרפליזומים לכילים.

לחץ שכפול, כולל זה שהוצג על ידי ICLs, מפעיל את ATR קינאז22. בין הסובסטרטים הרבים של ATR ישנם חלבוני MCM, כולל MCM2 בסרין 10823. מפגש עם כיל צפוי לגרום לזרחון של MCM2, בין מצעים רבים אחרים. בהתאם לציפייה זו, ה-PLA בין pMCM2Ser108 לתג Dig היה חיובי (איור 3c). בניסויים אחרים מצאנו שתדר הרמה הגיע לשעה20. פירשנו את התוצאות הללו כמצביעות על כך שרפליזומים הממוקמים באופן שונה ברחבי הגנום, ורחוקים באופן משתנה מכיל , נתקלים בסופו של דבר בחסימה, מה שגורם להפעלת ATR ולזרחון MCM2.

תוצאות ה-PLA בנתונים הקודמים מוצגות כסיכום דחוס של מספר מישורים אופטיים. עם זאת, התוצאות מגרעינים בודדים יכולות להיות מוצגות גם בשחזור תלת ממדי, כפי שמוצג עבור pMCM2: Dig-TMP PLA בסרטון 1. ניתוח זה הצביע על כך שניתן היה לצפות במפגשים עם כיל בכל הגרעין.

המחקר שלנו על מזלג שכפול הראה כי מפגשים עם כיל חשפו תופעת שכפול בלתי צפויה16. בהתחשב במבנה הטבעתי הנעול של רפליזום פונקציונלי, היה מעניין מאוד לשאול אם הרכב מנגנון השכפול השתנה בעת התנגשות עם כיל. מכיוון שפחות מ-10% ממזלגות השכפול יוצרים מגע עם כיל, עצם הקביעה של הרכב החלבונים של כל הרפליזומים לא הייתה מועילה. עם זאת, ה-PLA בין Dig לבין מרכיבים שונים איפשר לנו להתייחס לשאלה זו. בניגוד לתוצאות החיוביות עם pMCM2, מצאנו שהחלבונים של קומפלקס GINS לא הצליחו לתת אות PLA עם ICLs. מצד שני, הבדיקה עם CDC45 הייתה חיובית, מה שמצביע על כך שחלבון הנעילה השני נשמר (איור 4a,b). כאשר תאים הודגרו עם מעכב ATR, ההפעלה מחדש דוכאה לחלוטין וה-GINS: Dig PLA היה חיובי מאוד (איור 4c). הפרשנות שלנו לתוצאות אלה הייתה שבהיעדר פעילות ATR חלבוני ה-GINS נשמרו, מנחת המסוקים CMG נשאר בתצורה נעולה, ולא היה שכפול מחדש מעברל-ICL 20.

Figure 1
איור 1: מבנה של trimethyl psoralen המקושר לתג האנטיגן digoxigenin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אימונופלואורסנציה של חלבון רפליזום MCM5 ו-DIG TMP אינה מראה מוקדים בדידים. התאים טופלו ב-Dig-TMP וב-UVA ולאחר שעה הוכתם חיסון עבור MCM5 ו-Dig. הפס הלבן מייצג 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: PLA בין Dig-TMP ו-MCM5. (א) סכמה של בדיקת קשירת הקרבה החלה על האינטראקציה בין החלבון המשחזר MCM5 לבין התג Dig בכיל. התוכנית היא פשוטה יותר. בפועל, נוגדנים ראשוניים נקשרו על ידי נוגדנים משניים שהוצמדו באופן קוולנטי לאוליגונוקלאוטידים. (ב) PLA בין MCM5 ל-Dig-TMP. שים לב לאותות הבדידים המציינים אתרי אינטראקציה. תרשימי נקודות ותיבות המציגים את התפלגות האותות (תרשים נקודה) וכן את החציון (סרגל אדום של התוויית תיבה), את האחוזוניםה- 25 וה- 75 (קצוות תיבה) ואת הערכים הגבוהים והנמוכים ביותר למעט חריגים (קווים קיצוניים). בדיקת Wilcoxon-Rank Sum אישרה כי קיים הבדל משמעותי בין שני התנאים (עמ<0.001). הפסים הלבנים מייצגים 5 מיקרומטר. (c) PLA בין pMCM2 ו-Dig-TMP. אותות אלה מייצגים את המפגש של המשיב עם כיל, המפעיל זרחן תלוי ATR של MCM2. ה-PLA מדווח על השונות של תדירות המפגש בתאים שונים. הפס הלבן מייצג 5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: PLA בין Dig-TMP לבין חלבוני הנעילה הרפליזומיים. (א) CDC45: Dig-TMP. הפס הלבן מייצג 5 מיקרומטר. (ב) PSF1: Dig-TMP. תדר האות המינימלי גדל מאוד על ידי טיפול במעכב ATR, אשר חוסם את מסלול המעבר ואת שחרורו של קומפלקס GINS הכולל PSF1. הפסים הלבנים מייצגים 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: שחזור תלת מימדי של pMCM2: אותות Dig PLA מדגים את ההתפלגות ברחבי הגרעין. PCNA מוכתם בירוק, PLA באדום, DAPI בכחול. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

קובץ משלים 1: Cellprofiler pipeline לכימות PLA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: פרמטרי אצווה של מודול תא IMARIS לכימות PLA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שה- PLA היא טכניקה חזקה מאוד, ישנם חששות טכניים שיש לפתור על מנת להשיג תוצאות ברורות וניתנות לשחזור. הנוגדנים חייבים להיות בעלי זיקה גבוהה וספציפיות. יתר על כן, חשוב להפחית את אותות הרקע הלא ספציפיים ככל האפשר. גילינו שקרומים ופסולת תאית תורמים לרקע, והסרנו אותם ככל האפשר. השטיפות עם חומר ניקוי המכיל חוצצים לפני הקיבוע, והשטיפה עם מתנול לאחר התיקון עוזרות להפחית את הקשירה הלא ספציפית. האזהרה היא שטיפול בחומרי ניקוי לפני הקיבוע עלול לגרום לניתוק תאים. אנו מוצאים כי טיפול בצלחות עם דבק תאים וקידומת עם 0.1% FA לפני הטיפול ב- CSK מקל על בעיה זו.

כדאי גם לזהות תאים שאינם בשלב S בעת ניטור אירועים ספציפיים בשלב S. זה יכול להיעשות על ידי צביעת PLA פוסט עם סמני מחזור התא כגון PCNA או NPAT24,25. לא רק שסמנים אלה מאשרים תופעות שלב S, אלא הם גם מספקים בקרה ביולוגית פנימית לאינטראקציות לא ספציפיות. אותות חיוביים בתאי פאזת G1, בבדיקות המודדות אירועים שאמורים להיות בלעדיים לשלב S, הם אינדיקציה לכך שנדרש מאמץ נוסף להפחתת אינטראקציות לא ספציפיות.

לאסטרטגיות הדמיה של תא בודד יש יתרונות שאינם זמינים בגישות אחרות לניטור אינטראקציות מולקולריות. טכניקות הומוגניזציה, כגון אלה המשמשות בניסויי משקעים חיסוניים, מבטלות כל קשר לאירועים בתאים בודדים. כתוצאה מכך, תובנה לגבי ההשפעה של מצב מחזור התא, או השונות על פני אוכלוסיית תאים אובדת. עם זאת, מכיוון שה- PLA מדווח על תדירות אירועים בתאים בודדים, ניתן לשחזר תובנות אלה.

מגבלה תכופה של ה- PLA היא היעדר ריאגנטים לזיהוי חיסוני עבור מטרות מעניינות. זהו חשש כאשר מתייחסים לשאלות בנוגע לתגובה התאית להפרעות DNA המוחדרות על ידי סוכנים שאינם מפסקים ישירים. התגברנו על מגבלה זו על ידי שימוש בריאגנט תגובתי DNA מתויג חיסון. למרות שמיקדנו את המחקרים שלנו בקישורים בין-גדיליים, ישנן תרכובות גנוטוקסיות רבות, כולל תרופות כימותרפיות, שיתאימו לגישה זו. בנוסף, אינטראקציות בין חלבונים ומבני דנ"א, כגון מרובעי G, יכולות להיבחן גם הן באמצעות אסטרטגיה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך, בחלקו, על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, המכון הלאומי להזדקנות, ארצות הברית (Z01-AG000746-08). J.H. נתמך על ידי הקרנות הלאומיות למדעי הטבע של סין (21708007 ו -31871365).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10011 1 in 1000
35 mm plates with glass 1.5 coverslip MatTek P35-1.5-14-C Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell
Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody Invitrogen A-10001 1 in 1000
Bovine serum albumin (BSA) SeraCare 1900-0012 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
CDC45 antibody (rabbit) Abcam ab126762 1 in 200
Cell adhesive Life Science 354240 for cell-TAK solution
Confocal microscope Nikkon Nikon TE2000 spinning disk microscope equiped with Volocity software
Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) Abcam ab420 1 in 200
Dig-TMP synthesized in the Seidman Lab
Duolink Amplification reagents (5×) Sigma-Aldrich DUO82010 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ detection reagents Sigma-Aldrich DUO92007 reagents need to be stored at -20 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS Sigma-Aldrich DUO92004 anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS Sigma-Aldrich DUO92002 anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer A Sigma-Aldrich DUO82046 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
Duolink in situ wash buffer B Sigma-Aldrich DUO82048 Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C
epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 200M microscope Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany)
Formaldehyde 16% Fisher Scientific PI28906 for fix solution
Goat serum Thermo 31873 Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C
Image analysis software open source Cell profiler works for analysis of single plane images
Image analysis software-license required Bitplane Imaris Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions
Ligase (1 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82029 reagents need to be stored at -20 °C
Ligation reagent (5×) Sigma-Aldrich DUO82009 reagents need to be stored at -20 °C
MCM2 antibody (rabbit) Abcam ab4461 1 in 200
MCM5 antibody (rabbit monoclonal) Abcam Ab75975 1 in 1000
Methanol Lab ALLEY A2076 pre-cold at -20°C before use
phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) Abcam ab109271 1 in 200
Polymerase (10 unit/μl) Sigma-Aldrich DUO82030 reagents need to be stored at -20 °C
Prolong gold mounting media with DAPI ThermoFisher Scientific P36935
PSF1 antibody (rabbit) Abcam ab181112 1 in 200
RNAse A 100 mg/ml Qiagen 19101 reagents need to be stored at 4 °C
Statistical analysis and data visualization software open source R studio ggplot2 package for generation of dot plot and box plots
Statistical analysis and data visualization software-license required Systat Software Sigmaplot V13
TMP (trioxalen) Sigma-Aldrich T6137_1G
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787_250ML
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416_100ML
UV box Southern New England Ultraviolet Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement
UV test Chamber Opsytec UV TEST CHAMBER BS-04
VE-821 Selleckchem S8007 final concentrtion is 1µM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
  2. Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
  3. Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
  4. Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
  5. Galbiati, A., Beausejour, C., d'Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
  6. Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
  7. Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
  8. Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
  9. Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
  10. Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
  11. Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
  12. Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
  13. Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
  14. Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
  15. Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
  16. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  17. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  18. O'Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
  19. Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
  20. Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
  21. Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
  22. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
  23. Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
  24. Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, Pt 2 617-624 (2009).
  25. Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).

Tags

ביולוגיה גיליון 173 רפליזום נגע חוסם PLA בדיקת קשירת קרבה קישורים בין-גדיליים של DNA קישורים מוצלבים מתויגים באנטיגן

Erratum

Formal Correction: Erratum: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion
Posted by JoVE Editors on 01/09/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion.

The Authors section was updated from:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

to:

Jing Zhang*1
Jing Huang*2
Ishani Majumdar1
Ryan C. James3
Julia Gichimu1
Manikandan Paramasivam4
Durga Pokharel5
Himabindu Gali6
Marina A. Bellani1
Michael M Seidman1
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health
2Institute of Chemical Biology and Nanomedicine, State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biology, Hunan University
3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University
4Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Copenhagen
5Horizon Discovery
6Boston University School of Medicine
* These authors contributed equally

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I.,… More

Zhang, J., Huang, J., Majumdar, I., James, R. C., Gichimu, J., Paramasivam, M., Pokharel, D., Gali, H., Bellani, M. A., Seidman, M. M. Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion. J. Vis. Exp. (173), e61689, doi:10.3791/61689 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter