Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Resumo

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Resumo

Obesidade e distúrbios metabólicos, como diabetes, doenças cardíacas e câncer, estão todos associados à dramática remodelação do tecido adiposo. As células progenitoras adiposas residentes em tecido (APCs) desempenham um papel fundamental na homeostase tecidual e podem contribuir para a patologia do tecido. O uso crescente de tecnologias de análise celular única – incluindo sequenciamento de RNA unicelular e proteômica unicelular – está transformando o campo de células-tronco/progenitora, permitindo uma resolução sem precedentes de mudanças individuais de expressão celular no contexto de mudanças populacionais ou teciduais. Neste artigo, fornecemos protocolos detalhados para dissecar tecido adiposo epidímico do camundongo, isolar células derivadas de tecido adiposo único e realizar a triagem celular ativada de fluorescência (FACS) para enriquecer para Sca1⁺/CD31 viável^-/CD45^-/Ter119^- APCs. Esses protocolos permitirão que os pesquisadores preparem APCs de alta qualidade adequados para análises a jusante, como sequenciamento de RNA de célula única.

Introdução

O tecido adiposo desempenha um papel fundamental no metabolismo energético. O excesso de energia é armazenado na forma de lipídios, e o tecido adiposo é capaz de expansão ou retração significativa, dependendo do estado nutricional e da demanda energética. A expansão do tecido adiposo pode resultar de um aumento no tamanho do adipócito (hipertrofia) e/ou de um aumento no número de adipócitos (hiperplasia); este último processo fortemente regulado pela proliferação e diferenciação das células progenitoras^{adiposas 1,2}. Durante a obesidade, o tecido adiposo se expande excessivamente, e a disfunção tecidual – incluindo hipóxia, inflamação e resistência à insulina – muitas vezes desenvolve^3,4. Essas complicações são fatores de risco para muitas doenças crônicas, incluindo hipertensão arterial, diabetes, doenças cardiovasculares, acidente vascular cerebral e câncer⁵. Assim, limitar a expansão descontrolada do tecido adiposo e mitigar as patologias do tecido adiposo são prioridades de pesquisa biomédica. Durante a expansão do tecido adiposo, as células-tronco derivadas do tecido adiposo residente (ASCs) proliferam e diferenciam-se sequencialmente em pré-adipócitos (células progenitoras comprometidas) e, em seguida, em adipócitos maduros⁶. Estudos recentes de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) mostram que essas populações de células progenitoras adiposas (APC) (ASCs e preadipócitos) apresentam heterogeneidade molecular e funcional substancial^{7,8,9,10,11,12}. Por exemplo, as ASCs apresentam uma capacidade de diferenciação adipogênica reduzida, ao mesmo tempo em que apresentam maiores capacidades de proliferação e expansão, em comparação com os pré-apócitos⁷. Outras diferenças moleculares são relatadas nas populações asc e pré-doença, embora a relevância funcional dessas diferenças ainda não esteja clara⁷. Juntos, esses dados destacam a complexidade do pool de células progenitoras adiposas e ressaltam a necessidade de desenvolver e padronizar ferramentas para melhor entender e manipular essas populações celulares críticas.

Este protocolo detalha o isolamento de populações de células progenitoras de alta viabilidade Sca1⁺ adiposas de blocos de gordura epidídica de camundongos que são adequados para análises sensíveis a jusante, incluindo estudos unicelulares (scRNA-sequenciamento) e cultura celular. O isolamento e dissociação de almofadas de gordura epidídica foi realizado como descrito anteriormente^7,13 com pequenas modificações que melhoram a viabilidade de APCs isolados. Em suma, células dissociadas de almofadas de gordura epidídimo são manchadas com anticorpos contra Sca1, um marcador para ambos os ASCs e preadipócitos^6,7, e outros marcadores de linhagem (Lin): Ter119 (células eritróides), CD31 (células endoteliais) e CD45 (leucócitos). As células Viável Sca1⁺/Ter119^-/CD31^-/CD45^-/DAPI^- são então classificadas por fluorescência ativada de classificação celular (FACS). É importante ressaltar que este protocolo foi validado pelo isolamento e análise bem-sucedidos de células progenitoras viáveis Sca1⁺/Lin^- adiposas relatadas em um estudo recente de sequenciamento de RNA de célula única que identificou subpopulações funcionalmente heterogêneas dentro de ASCs e preadipócitos⁷.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados sob aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Clínica Mayo.

1. Preparação da solução

1. Prepare a solução de colagenase 2% (w/v) dissolvendo a colagemnase II 2 g na solução de sal balanceada (HBSS) de 100 mL da Hanks. Alíquota de 200 μL cada para cada uso.
2. Prepare o meio de neutralização misturando 84 mL F-12 médio, 15 mL de serum de cavalo e penicilina/estreptomicina de 1 mL.
3. Prepare o tampão de citometria de fluxo dissolvendo 500 mg de albumina de soro bovino (BSA) e 400 μL de 0,5 M EDTA em 100 mL da linha salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS).

2. Dissecção da almofada de gordura epidídica e dissociação tecidual

1. Eutanize humanamente (luxação isoflurane/cervical) de um rato macho. Neste protocolo, foi usado um rato FVB de quatro meses de idade.
2. Aplique/pulverize 70% de etanol no abdômen e exponha a cavidade abdominal inferior usando tesoura limpa e fórceps.
3. Localizar almofada de gordura epidídica (proximal/ligada a testículos). Segure a junção entre testículos e almofada de gordura epidídica com fórceps contundentes e puxe suavemente para liberar a almofada de gordura epidídica.
4. Remova os testículos cortando usando uma tesoura e incubar a almofada de gordura epidídica em 5 mL de HBSS suplementada com 3% de BSA em um tubo cônico de 50 mL em temperatura ambiente por 15 minutos.
5. Centrifugar a 150 x g por 7 min a 4 °C.
6. Pegue a almofada de gordura epidímica flutuante do tubo cônico de 50 mL e pique finamente o tecido usando uma tesoura limpa.
7. Adicione 200 μL de solução de colagenase 2% em 3,8 mL de HBSS em um tubo de cultura de 13 mL. Adicione o tecido picado e incubar em uma incubadora rotativa a 5 rpm por 1h a 37 °C. Em vez de uma incubadora rotativa, a incubadora de cultura celular a 37 °C pode ser usada alternativamente com agitações ocasionais.
8. Transfira o conteúdo inteiro para um tubo cônico de 50 mL e adicione 10 mL de meio de neutralização. Misture suavemente invertendo o tubo 2-3 vezes.
9. Prepare outro tubo cônico de 50 mL equipado com um coador de células de 70 μm. Filtre o tecido digerido no novo tubo usando o coador celular.
10. Transfira o fluxo para um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 350 x g por 10 min a 4 °C.
11. Remova cuidadosamente as pelotas de células supernascidas e resuspendas com 5 mL de DPBS. Centrifugar a 350 x g por 10 min a 4 °C.
12. Remova cuidadosamente o supernascimento e adicione 50 μL de tampão de citometria de fluxo. Misture bem por pipetar suavemente e mantenha as células no gelo. Devido ao volume das pelotas celulares e à pequena quantidade de supernanato residual, o volume total de células no tampão de citometria de fluxo será superior a 50 μL (aproximadamente 100 μL).

3. Rotulagem de anticorpos e fluorescência ativada de classificação celular (FACS)

1. Depois de misturar bem as células com tubulação suave, transfira 54 μL da suspensão celular para um tubo de microcentrifuge de 1,7 mL. Adicione 6 μL de reagente de bloqueio fcr e misture bem por pipetar suavemente. Incubar a 4 °C por 10 min. Salve as células restantes depois de tomar 54 μL e mantenha-as no gelo para usar como um controle não manchado na etapa 3.5 e passo 3.6.
2. Durante a incubação na etapa 3.1, prepare um coquetel de anticorpos combinando anticorpos de 11 μL cada um de anticorpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC e anticorpos anti-CD45-FITC em um tubo de microcentrifuuge. Misture bem com tubos suaves e mantenha no gelo protegido da luz.
3. Após a incubação com o reagente de bloqueio fcr por 10 minutos, adicione 40 μL do coquetel de anticorpos e misture bem por pipetação suave. Incubar a 4 °C por 10 min.
4. Adicione 500 μL de tampão de citometria de fluxo suplementado com 1 μg/mL de DAPI nas células manchadas. Misture bem por células de tubulação suaves e filtros usando um tubo de ensaio de 5 mL com tampa de encaixe do filtro celular. Mantenha células no gelo.
5. Adicione 500 μL de tampão de citometria de fluxo às células remanescentes na etapa 3.1 e misture bem por tubulação suave. Células filtradoras usando um tubo de ensaio de 5 mL com tampa de encaixe do filtro celular. Mantenha essas células no gelo e use como um controle não manchado na etapa seguinte.
6. Leve as células manchadas e o controle não manchado para análise ou instrumento de classificação FACS.
   1. Identifique e isole a população APC⁺/FITC^-/DAPI^- com estratégias de gating mostradas na Figura 1. Essas células representam células viável sca1⁺/Ter119^-/CD31^-/CD45^. Detritos e agregados de células são esgotados usando parcelas para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). Em seguida, o DAPI^- população é fechada, seguido de gating de APC⁺/FITC^- população. Os controles não manchados devem ser usados para auxiliar na definição de parâmetros de gating.
   2. Colete as células em 500 μL de tampão de citometria de fluxo em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Seguindo em frente, todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis para minimizar uma contaminação. Aproximadamente 50.000 – 100.000 células são coletadas de um rato.
7. Conte células usando um hemócito para avaliar a viabilidade celular. Uma vez que os agregados celulares podem interferir com novas análises a jusante, a presença de agregados celulares também é avaliada para garantir uma presença mínima (<5% do número celular viável) desses agregados.

Resultados

Camundongos FVB machos de quatro meses de idade foram usados neste experimento. Após a exclusão de detritos e dobras utilizando lotes FSC/SSC, células viáveis (DAPI^- população) foram fechadas, seguidas pela seleção de APC⁺/FITC^- população (Figura 1). Os portões DAPI, APC e FITC foram desenhados com base no controle não manchado. As estratégias de gating são mostradas na Figura 1.

Após 1h de triagem, a ...

Discussão

O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) está rapidamente ganhando tração como uma ferramenta poderosa para estudar simultaneamente diversas populações celulares no nível único celular. Devido aos altos custos associados à preparação da amostra e ao sequenciamento de alto rendimento, é imperativo otimizar as entradas celulares (alta viabilidade e pureza) para aumentar a probabilidade de sucesso experimental. Alguns protocolos de preparação celular dependem da remoção de células mortas e detritos usando lavagen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL	VWR	87003-294
Tubo de cultura de 13 mL	Thermo Fisher Scientific	50-809-216
Tubo cônico de 15 mL	Greiner Bio-one	188 271
Tubo de ensaio de 5 mL com tampa de pressão do filtro de células	Thermo Fisher Scientific	08-771-23
Tubo cônico de 50 mL	Greiner Bio-one	227 261
70 µ filtro de células m	Thermo Fisher Scientific	22-363-548
Anti-CD31-FITC anticorpo	Miltenyi Biotec	130-102-519
Anti-CD45-FITC anticorpo	Miltenyi Biotec	130-102-491
Anti-Sca1-APC anticorpo	Miltenyi Biotec	130-102-833
Anti-Ter119-FITC anticorpo	Miltenyi Biotec	130-112-908
BSA	Gold Biotechnology	A-420-500
Colagenase tipo II	Thermo Fisher Scientific	17101-015
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	11765-054
Reagente bloqueador FcR	Miltenyi Biotec	130-092-575
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Soro de cavalo	Thermo Fisher Scientific	16050-122
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Solução de iodeto de propídio	Miltenyi Biotec	130-093-233