Este protocolo descreve um método para o isolamento de vesículas extracelulares urinárias, uEVs, de doadores humanos saudáveis e sua caracterização fenotípica pela expressão de marcadores de tamanho e superfície usando citometria de fluxo.
Artigo de método
Determinação do Tamanho e Análise Fenotípica de Vesículas Extracelulares Urinárias por Citometria de Fluxo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As vesículas extracelulares, EVs, são um complexo heterogêneo de membranas lipídicas, secretadas por qualquer tipo de célula, em qualquer fluido, como a urina. Os EVs podem ser de diferentes tamanhos, variando de 40-100 nm de diâmetro, como em exossomos, a 100-1000 nm em microvesículas. Eles também podem conter diferentes moléculas que podem ser usadas como biomarcadores para o prognóstico e diagnóstico de muitas doenças. Muitas técnicas foram desenvolvidas para caracterizar essas vesículas. Uma delas é a citometria de fluxo. No entanto, não há relatórios existentes para mostrar como quantificar a concentração de EVs e diferenciá-los por tamanho, juntamente com a detecção de biomarcadores. Este trabalho tem como objetivo descrever um procedimento para o isolamento, quantificação e fenotipificação de vesículas extracelulares urinárias, uEVs, utilizando um citômetro convencional para a análise sem qualquer modificação em sua configuração. As limitações do método incluem a coloração de no máximo quatro biomarcadores diferentes por amostra. O método também é limitado pela quantidade de EVs disponíveis na amostra. Apesar dessas limitações, com este protocolo e sua posterior análise, podemos obter mais informações sobre o enriquecimento dos marcadores EVs e a abundância dessas vesículas presentes em amostras de urina, em doenças envolvendo danos renais e cerebrais.
Introdução
Nos mamíferos, o sangue é filtrado passando pelos rins 250 a 300 vezes; Durante esse período, a urina é formada. A produção desse biofluido é o resultado de uma série de processos, incluindo filtração glomerular, reabsorção tubular e secreção. Resíduos metabólicos e eletrólitos são os principais componentes da urina. Além disso, outros subprodutos, como peptídeos, proteínas funcionais e vesículas extracelulares (EVs), são excretados 1,2,3,4,5,6.....
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Protocolo
As amostras de urina humana foram obtidas de voluntários saudáveis que assinaram o consentimento informado do doador. Esses procedimentos também foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.
1. Isolamento de vesículas extracelulares urinárias
NOTA: O protocolo de isolamento de uEVs é modificado a partir da ref.19. A Figura 1 mostra a representação do protocolo para isolar uEVs.
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Resultados
Existem vários pontos de verificação através do protocolo e antes da coloração de uEVs. Portanto, é essencial verificar primeiro a quantidade de proteína presente no extrato de uEVs. Todos os grupos de pesquisa que trabalham com vesículas extracelulares quantificam a proteína, conforme indicado na etapa 2.1. A Figura 2 suplementar mostra uma placa representativa de 96 poços contendo a fração de uEVs nos poços 4E, 5E e 6E. Os poços 1A, 2A e 3A consistem em espaços em branco, mas se não houver uEVs purific.......
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Discussão
Atualmente, o uso de vesículas extracelulares como biomarcadores para diversas doenças tem aumentado, principalmente para aquelas que podem ser isoladas de fontes não invasivas, como a urina5,21,22,23,24. Está comprovado que o isolamento de EVs é um recurso vital para conhecer o estado de um indivíduo saudável e o diagnóstico/.......
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Divulgações
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de qualquer relação financeira ou comercial que pudesse ser interpretada como um potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por doações do CONACyT (A3-S-36875) e do Programa UNAM-DGAPA-PAPIIT (IN213020 e IA202318). NH-I foi apoiado pela bolsa 587790 do CONACyT.
Os autores querem agradecer a Leopoldo Flores-Romo†, Vianney Ortiz-Navarrete, Antony Boucard Jr e Diana Gómez-Martin por seus valiosos conselhos para a realização deste protocolo, e a todos os indivíduos saudáveis por suas amostras de urina.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-humano CD156c (ADAM10) APC | BioLegend | 352706 | Add 5 µ L para o 20 µ L de uEVs no |
| anticorpo PBS APC anti TSPAN33 humano (BAAM) | BioLegend | 395406 | Add 5 µ L para o 20 µ L de uEVs em |
| centrífuga PBS Avanti com rotor de ângulo fixo JA-25.5O | Beckamn Coulter | J-26S XPI | |
| BD Citômetro de fluxo Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| β-mercaptoetanol | SIGMA-Aldrich | M3148 | |
| Centrífuga de bancada com rotor A-4-44 | Eppendorf | 5804 | |
| BLUEstain 2 escada de proteínas | GOLDBIO | Anticorpo | |
| CD9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | |
| CD63 (MX-49.129.5) anticorpo monoclonal de camundongo | Santa Cruz Biotechnology | sc-5275 | |
| Kit de proliferação de células CFSE para citometria de fluxo | Thermo Scientific | C34554 | |
| Chemidoc XRS+ sistema | BIORAD | 5837 | |
| FITC anti anticorpo humano CD9 | BioLegend | 312104 | Add 5 µ L para o 20 µ L de uEVs no |
| anticorpo anti-CD37 humano PBS FITC | BioLegend | 356304 | Add 5 µ L para o 20 µ L de uEVs em PBS |
| Partículas amarelas fluorescentes | Spherotech | FP-0252-2 | |
| Partículas amarelas fluorescentes | Spherotech | FP-0552-2 | |
| Partículas amarelas fluorescentes | Spherotech | FP-1552-2 | |
| Software FlowJo | Becton, Dickinson and Company | ||
| Imunoglobulinas anti-rato de cabra/HRP | Dako | P0447 | |
| Coquetel inibidor de protease | Halt Thermo Scientific | 78429 | |
| Membrana PVDF Immun-Blot 0.22µ m | BIORAD | 1620177 | |
| contas Megamix-Plus FSC | COSMO BIO CO. LTD | 7802 | |
| Tampão de amostra NuPAGE LDS 4X | Thermo Scientific | NP0007 | |
| Ultracentrífuga Optima com rotor 90Ti ângulo fixo 355530 | Beckamn Coulter | XPN100 | |
| Página Solução de coloração de proteína azul | Thermo Scientific | 24620 | |
| PE anticorpo CD53 humano | BioLegend | 325406 | Adicionar 5 µ L para o 20 µ L de uEVs em |
| PBS Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Pierce RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| Tubos de centrífuga de parede espessa de policarbonato | Beckamn Coulter | 355630 | |
| Spherotech 8-Peak validation beads (FL1-FL3) | BD Accuri | 653144 | |
| Spherotech 6-Peak validation beads (FL4) | BD Accuri | 653145 | |
| sacarose | SIGMA-Aldrich | 59378 | |
| trietanolamina | SIGMA-Aldrich | 90279 |
Referências
- Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
- Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11
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