É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Preparando fatias cerebrais agudas do pólo dorsal do hipocampo de roedores adultos

3.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/61699

⸱

10 de setembro de 2020

1Simons Initiative for the Developing Brain, Centre for Discovery Brain Sciences, The University of Edinburgh

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever um método para produzir fatias do hipocampo dorsal para exame eletrofisiológico. Este procedimento emprega perfusão com ACSF resfriado antes da preparação do corte com um ângulo de corte quase coronal que permite a preservação dos neurônios principais saudáveis.

Resumo

Registros de patch-clamp de células inteiras de fatias agudas de cérebro de roedores são um dos pilares da pesquisa neurofisiológica moderna, permitindo a medição precisa das propriedades celulares e sinápticas. No entanto, há uma necessidade cada vez maior de realizar análises correlacionadas entre diferentes modos experimentais, além da eletrofisiologia do corte, por exemplo: imuno-histoquímica, biologia molecular, imagem in vivo ou registro eletrofisiológico; para responder a questões cada vez mais complexas da função cerebral. No entanto, tirar conclusões significativas dessas várias abordagens experimentais não é simples, pois mesmo dentro de estruturas cerebrais relativamente bem descritas, existe um alto grau de variação sub-regional da função celular. Em nenhum lugar isso é melhor exemplificado do que no CA1 do hipocampo, que possui propriedades dorso-ventrais bem definidas, com base em propriedades celulares e moleculares. No entanto, muitos estudos publicados examinam padrões de expressão de proteínas ou atividade in vivo comportamentalmente correlacionada na extensão dorsal do hipocampo; e explicar os achados mecanicamente com eletrofisiologia celular da região ventro-medial. Isso é ainda mais confundido pelo fato de que muitos experimentos eletrofisiológicos de corte agudo são realizados em animais juvenis, quando outros modos experimentais são realizados em animais mais maduros. Para resolver esses problemas, este método incorpora perfusão transcárdica de roedores maduros (>60 dias de idade) com líquido cefalorraquidiano artificial, seguido pela preparação de fatias coronais modificadas, incluindo o pólo septal do hipocampo dorsal para registrar a partir de células piramidais CA1. Esse processo leva à geração de fatias agudas saudáveis do hipocampo dorsal, permitindo a interrogação eletrofisiológica celular baseada em fatias combinada com outras medidas.

Introdução

O hipocampo é indiscutivelmente a estrutura mais bem estudada no cérebro de mamíferos, devido ao seu tamanho relativamente grande e estrutura laminar proeminente. O hipocampo tem sido implicado em vários processos comportamentais: navegação espacial, memória contextual e formação de episódios. Isso se deve, em parte, à relativa facilidade de acesso às porções dorsais do hipocampo em roedores para análise in vivo . De fato, as principais células de saída estão tipicamente a menos de 2 mm da superfície pial.

Em roedores, o hipocampo é uma estrutura relativamente grande, formada por uma invaginação do telencéfalo que se estende do septo dorsal ao neocórtex ventral. É composto por 2 regiões principais: o giro dentado e o cornu ammonis (CA); o último dos quais é dividido em 3 sub-regiões bem descritas (CA1-3) que se estendem até o giro dentado do hilo (anteriormente conhecido como CA4), com base na conectividade, anatomia celular e propriedades genéticas1. Essa estrutura é mantida ao longo da extensão dorso-ventral do hipocampo, embora com grandes variações nas propriedades sinápticas 2,3,4, anatomia5, diversidade genética 6,7,8 e função comportamental 9,10. Das regiões CA, o subcampo CA1 é composto em grande parte por células piramidais CA1 glutamatérgicas (CA1 PCs), para as quais 3 subtipos foram definidos11, e interneurônios inibitórios que compõem ~ 10% dos neurônios, mas são altamente diversos com mais de 30 subtipos definidos 12,13,14. Além das diferenças regionais específicas, o envelhecimento normal demonstrou ter efeitos dramáticos na transmissão sináptica15 , 16 , 17 , anatomia18 e perfil genético19 . O método padrão-ouro atual para avaliar os meandros das propriedades celulares e sinápticas de maneira controlada é através do uso de gravações de patch-clamp de células inteiras de fatias cerebrais agudas20.

A compreensão da função hipocampal baseia-se em grande parte na manipulação dorsal devido à facilidade com que é acessada cirurgicamente ou anatomicamente para tarefas comportamentais, implantação de eletrodos ou janelas de imagem ou expressão de plasmídeos virais. Além disso, em muitos estudos, esses procedimentos são realizados com roedores juvenis ou adultos para evitar a variabilidade na estrutura cerebral durante o desenvolvimento. Apesar disso, muitas abordagens para examinar a eletrofisiologia celular e subcelular são realizadas em roedores juvenis precoces a médios, principalmente da porção ventro-medial do hipocampo em seu plano transversal21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Quando toda a extensão dorso-ventral foi avaliada, um cortador de tecidos é usado para manter a extensão transversal 4,26, ou o experimento foi realizado em ratos jovens27 ou camundongos28. Além disso, sabe-se que o resfriamento do tecido antes da dissecção do cérebro preserva a estrutura do hipocampo em ratos29 e os neurônios neocorticais em camundongos30,31. No entanto, há uma escassez de detalhes sobre a produção de fatias de cérebro a partir do eixo transversal dorsal do hipocampo, geradas por fatias coronais modificadas, em ratos maduros.

Este protocolo descreve uma abordagem pela qual os registros de patch-clamp de células inteiras podem ser obtidos de um ou pares de neurônios em fatias coronais modificadas do hipocampo dorsal de ratos idosos, seguidos de identificação morfológica post-hoc. Fatias de cérebro saudáveis são obtidas após a perfusão transcárdica de líquido cefalorraquidiano artificial resfriado (ACSF), facilitando a medição das propriedades eletrofisiológicas de PCs CA1 e interneurônios locais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os animais foram gerados e mantidos de acordo com as diretrizes do Home Office e Institucional (HO# P135148E). Todos os ratos foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h e receberam acesso ad libitum a comida e água.

1. Perfusão transcárdica de ACSF resfriado

  1. Antes de todos os experimentos, coloque ~ 200 mL de sacarose-ACSF (Tabela 1) no freezer a -20 ° C (até semi-congelar, para fatiar) e mais ~ 100-200 mL de sacarose filtrada-ACSF no gelo (para perfusão), borbulhando com carbogênio (95% O2/5% CO2).
  2. Colete um rato adulto de sua gaiola doméstica e coloque-o por ~ 30 minutos em uma gaiola na sala de procedimentos para se aclimatar aos níveis de ruído e luz.
  3. Prepare as ferramentas de dissecção (Figura 1A), a área de perfusão e o anestésico injetável (aprox. 1 mL de pentobarbital sódico 200 mg/mL para uma concentração final de 100 mg/kg).
  4. Prepare uma câmara de anestesia apropriada colocando um pequeno cotonete de papel de seda ou algodão dentro. Introduza 1-2 mL de isoflurano volátil
  5. Coloque o rato em uma câmara de anestesia para sedar. Monitore a respiração até que a taxa de respiração caia para ~ 1 respiração superficial por segundo.
  6. Neste ponto, comece a borbulhar sacarose-ACSF semicongelada com carbogênio no gelo para uso durante o corte.
  7. Pese o rato e observe seu peso.
  8. Anestesiar terminalmente o rato injetando o pentobarbital sódico preparado na cavidade intraperitoneal. A dose de pentobarbital sódico deve ser de 100 mg / kg, calculada a partir do peso previamente tomado e da concentração estoque do medicamento. Coloque o rato em uma câmara de retenção e aguarde de 0,5 a 5 minutos para o início da anestesia terminal.
  9. Confirme a cessação dos reflexos: teste os reflexos de piscar da córnea (tocar a pupila) e pinçar a pata traseira (levantar a perna e beliscar a pata traseira) usando uma sonda romba (ou seja, pinça arredondada). Uma vez que os reflexos tenham cessado, prenda o rato na placa cirúrgica de poliestireno ou cortiça usando agulhas hipodérmicas.
  10. Abra a cavidade torácica e coloque a cânula na base do ventrículo esquerdo do coração. Puncione o átrio direito e inicie imediatamente a perfusão com a sacarose fria (0-1 °C) ACSF (usando uma bomba peristáltica a 50 mL / minuto).
  11. Uma vez que a troca completa de fluidos e resfriamento do corpo tenha ocorrido (<5 minutos), remova a cânula e os pinos e, em seguida, decapite usando uma guilhotina.
  12. Remova o crânio com cuidado e rapidez usando tesouras de osso e ferramentas de osso Rongeur (Figura 1A, 1B).
    1. Comece fazendo 2x cortes bilaterais através do forame magno usando a tesoura de osso e remova o crânio para a sutura lambda com os Rongeurs. Corte cuidadosamente ao longo da sutura da linha média com a tesoura de osso logo atrás dos olhos.
    2. Faça 2x cortes bilaterais no crânio, perpendiculares à linha média. Usando os Rongeurs, abra o crânio ao longo da linha média. Tome cuidado extra para remover a pia-máter usando uma tesoura fina ou uma agulha em forma de gancho.
  13. Retire o cérebro do crânio usando uma espátula romba, cortando os nervos cranianos e ópticos com compressão de lado a lado. Coloque o cérebro em sacarose ACSF carbogenada e semicongelada (0 a 1 ° C) por 1-2 minutos antes de fatiar.

2. Preparação de fatias de cérebro do hipocampo dorsal

  1. Remova o cérebro perfundido da sacarose-ACSF semicongelada (0–1 ° C) e coloque em uma placa de Petri de vidro forrada com papel de filtro. Coloque o cérebro em sua superfície ventral.
  2. Usando um bisturi (lâmina nº 22), remova a porção posterior do cérebro a ~ 10 ° da vertical para criar uma superfície plana para colar o cérebro ao palco (Figura 1C).
  3. Aplique uma pequena quantidade de cola de cianoacrilato no palco do vibratome. Espalhe a cola para fazer uma película fina aproximadamente 50% maior do que a área da seção transversal da superfície de corte do cérebro.
  4. Levante o cérebro do prato de vidro para uma espátula, com o lado cortado para baixo, usando um pincel para guiar o tecido. Seque o cérebro com um pedaço de tecido para remover o excesso de ACSF e deslize o cérebro, corte a superfície para baixo, no centro da cola. Usando uma pipeta Pasteur, adicione 1-2 mL de sacarose gelada-ACSF sobre o cérebro para remover a cola do bloqueio cerebral.
  5. Coloque o cérebro na câmara de fatiamento e inunde com sacarose semicongelada ACSF. Use uma colher ou espátula para manter o excesso de gelo longe do bloqueio cerebral e, em seguida, carbogene (Figura 1D).
  6. Mova a lâmina do vibratomo para a posição: ~ 1 mm da superfície dorsal do cérebro e verticalmente ~ 1 mm anterior ao bregma. Certifique-se de que a lâmina esteja totalmente submersa e remova as bolhas usando um pincel.
  7. Comece a cortar o cérebro. Para aparar até o hipocampo dorsal, use uma velocidade de 0,1-0,2 mm/s, com um movimento horizontal da lâmina de 1-1,5 mm e uma taxa oscilatória recíproca de ~90 Hz. Ao cortar o hipocampo dorsal, reduza a velocidade para 0,05-0,1 mm/s.
  8. Colete fatias de hipocampo dorsal (nominalmente 3-4 fatias inteiras ou 6-8 fatias hemisseccionadas) por cérebro. Se forem necessários cortes longitudinais do hipocampo ventro-medial, continue cortando. Uma vez que o hipocampo dorsal tenha sido cortado, não há necessidade de cortar tecido extra além da posição do3º ventrículo. Pare o vibratome, separe a fatia com uma agulha hipodérmica dobrada e colete na base da câmara de corte.
    NOTA: As fatias podem ter 250-500 μm de espessura, dependendo dos requisitos experimentais. Para gravações do hipocampo dorsal, normalmente use fatias de 400 μm de espessura para preservar o máximo da rede local, permitindo as condições de microscopia adequadas.
  9. Apare as fatias para conter apenas o hipocampo e o córtex sobrejacente sob um microscópio de dissecação. Transferir as fatias para a câmara pré-aquecida a 35 °C com a superfície anterior virada para cima.
  10. Determine a câmara de armazenamento com base no experimento a ser realizado. Para obter gravações de campo extracelulares ou patch-clamp de células inteiras de alta qualidade perto da superfície da fatia em câmaras de gravação submersas, armazene em câmaras submersas. Como alternativa, armazene em uma câmara de interface líquido/gás para registros de atividade de rede oscilatória ou registros de campo extracelular de interface.
  11. Para condições de armazenamento submerso, deixe as fatias recuperarem a 35 ºC durante 30 minutos a partir do momento em que a última fatia entra na câmara de armazenagem. Isso permite a reativação de processos metabólicos e a re-vedação de neuritos cortados. Após 30 minutos, transfira a câmara de armazenamento para a temperatura ambiente.

3. Registrando os neurônios dorsais do hipocampo

  1. Fabrique pipetas de registro de vidro capilar. Este protocolo usa vidro borossilicato de 1,5 mm de diâmetro externo e 0,86 mm de diâmetro interno com filamento, que produz uma resistência de ponta de 3-5 MΩ quando preenchido com solução intracelular (Tabela 1). Mantenha as soluções intracelulares resfriadas em gelo para evitar a degradação dos componentes energéticos e filtradas antes do uso (filtro de seringa, tamanho dos poros: 0,2 μm).
  2. Carbogenar registrar ACSF e pré-aquecer em banho-maria (35-40 ºC). Entregue o ACSF carbogenado e pré-aquecido à câmara de registro por meio de um tubo de perfusão assistido por uma bomba peristáltica. Inicie a perfusão vários minutos antes de transferir uma fatia para a câmara.
  3. Pare a perfusão e transfira uma fatia de cérebro para a câmara de registro com a superfície anterior voltada para cima. Segure a fatia no lugar com um anel de platina com fibras únicas de seda presas para formar uma forma de "harpa". Posicione as fatias de modo que o estrato piramidal de CA1 corra perpendicularmente ao eixo da primeira pipeta de registro.
  4. Reinicie o fluxo de ACSF carbogenado e pré-aquecido (35-40 ºC) registrando ACSF (Tabela 1) a uma taxa ideal de 6-8 mL ∙ min-1.
    NOTA: Altas taxas de fluxo (6-8 mL∙min-1) são ideais para manter a atividade da rede em fatias32. Taxas de fluxo mais baixas (ou seja, 2-3 mL∙min-1) podem ser usadas para manter a estabilidade do corte para experimentos de imagem ou onde a atividade de rede biologicamente relevante não é necessária.
  5. Avalie a qualidade do corte usando óptica de contraste de inferência diferencial infravermelha (IR-DIC) com ampliação objetiva de 40x (visualizada com uma câmera CCD). Suponha uma boa qualidade de corte se um grande número de PCs CA1 ovóides e moderadamente contrastados puderem ser vistos em str. piramidal em profundidades de 20-30 μm abaixo de uma superfície lisa e levemente ondulada ( Figura 2A ). Fatias de baixa qualidade contêm um grande número de células altamente contrastadas, encolhidas ou inchadas, com uma superfície de fatia irregular.
  6. Encha as pipetas de adesivo com uma solução intracelular (por exemplo, com base em um [Cl-] intracelular de 24 mM) para permitir a comparação com outros dados publicados.
  7. Execute gravações de patch-clamp de células inteiras conforme descrito anteriormente22. Exclua as células da análise se o potencial de membrana (VM) na ruptura for mais despolarizado que -50 mV, a resistência em série for >30 MΩ; ou a resistência em série muda em >20% ao longo da gravação. Sob essas condições de gravação, a resistência em série é normalmente na faixa de 8 a 25 MΩ e estável por até 1 hora.
  8. Para examinar a excitabilidade intrínseca de CA1 do hipocampo dorsal, teste as propriedades fisiológicas intrínsecas com registros de células inteiras com os seguintes protocolos na configuração de pinça de corrente:
    1. A partir do potencial de membrana em repouso sem corrente de polarização aplicada, aplique pequenos passos de corrente (-10 pA, 500 ms) repetidos 30 vezes.
    2. A partir de -70 mV com corrente de polarização aplicada, aplique hiper a etapas de corrente despolarizante de 500 ms de duração (-100 a +400 pA, etapas de 25 pA) com 3 repetições de uma família de traços.
    3. Aplique uma onda senoidal de 100 pA amplitude pico a pico, com frequência variável de 0,1 a 20 Hz. Repita 3 vezes.
    4. Aplique um estímulo 5x 2 nA, 2 ms para conduzir potenciais de ação em 20, 40, 60, 80, 100 Hz. 10 varreduras por frequência.
    5. A partir de um grampo de tensão de -70 mV, aplique 5 minutos de correntes pós-sinápticas excitatórias espontâneas (EPSC) para registro.
  9. Para selar novamente as células para análise histológica após o registro bem-sucedido, produza manchas de fora para fora retraindo lentamente a pipeta de remendo. Quando for observado um aumento na resistência em série dos níveis experimentais para >1 GΩ, conforme medido por um pulso de teste de -5 mV, aumente o potencial de retenção para -40 mV e retraia totalmente a pipeta.
  10. Realize gravações adicionais na mesma fatia para satisfazer o poder estatístico necessário do projeto experimental.
  11. Remova fatias de cérebro contendo neurônios gravados da câmara de registro, coloque em uma placa de 24 poços, substitua o ACSF por paraformaldeído a 4% (em tampão fosfato 0,1 M) e deixe durante a noite.
  12. No dia seguinte, substitua o PFA por tampão fosfato 0,1 M e armazene até o processamento histológico. Visualize células com estreptavidina conjugada com fluorescência conforme descrito anteriormente22.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O protocolo descrito acima permite a preparação de fatias viáveis do pólo septal do hipocampo dorsal em ratos maduros. Um fator chave neste protocolo é a perfusão de sacarose resfriada-ACSF, antes da preparação do corte, resultando em PCs CA1 saudáveis proximais à superfície do corte. A qualidade da fatia produzida é avaliada visualmente sob óptica IR-DIC, e as células saudáveis identificadas como tendo grandes corpos celulares ovóides estão localizadas em toda a extensão do estrato piramidal, desde a camada com...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, um protocolo é descrito para produzir fatias cerebrais de alta qualidade a partir da extensão dorsal do CA1 do hipocampo, permitindo gravações de vários neurônios viáveis dentro dessa região. A abordagem combinatória de registro de células inteiras a partir de fatias quase coronais seguidas de visualização de neurônios é fundamental para a confirmação da viabilidade e identidade celular.

Este protocolo produz fatias viáveis de forma confiável por 2 razõe...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

O autor declara que não tem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

O autor deseja agradecer ao Prof. David JA Wyllie, Dra. Emma Perkins, Laura Simões de Oliveira e Prof. Peter C Kind pelos comentários úteis sobre a otimização do manuscrito e do protocolo, e à The Simons Initiative for the Developing Brain por fornecer custos de publicação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Software de aquisiçãoMolecular DevicespClamp 10
Ratos adultosVáriosn/aQualquer cepa de rato adulto (60 dias ou mais)
AmplificadorMolecular DevicesAxopatch 700B
Software de análiseFreewareStimfithttps://github.com/neurodroid/stimfit
Bone ScissorsFST16152-12Estilo Littauer
vidro capilar30-0060Pipetas de vidro borossilicato com filamento de 1,5 mm de diâmetro externo, 0,86 mm de diâmetro interno.
CarbogenBOCVários95% O2/5% CO2
CCD câmeraScientificaSciCamProhttps://www.scientifica.uk.com/products/
Químicos/ReagentesSigma AldrichVáriosTodos os reagentes de laboratório adquiridos da Sigma Aldrich.
Cianoacrilato (ou seja, RS Pro 3)RS Componentes918-6872Evite formulações de cianoacrilato à base de gel
DigitizerMolecular DevicesDigidata 1550B
Pinos / agulhas de dissecçãoVáriosUso Agulhas de calibre 16 (acima)
Sistema de eletrofisiologiaScientificaSliceScopehttps://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
Tesoura de íris finaFST14568-12Com pontas de carboneto de tungstênio
Placa de Petri de vidroFisher Scientific12911408
Agulhas hipodérmicasBD HealthcareVárioscalibres 16, 18 e 22
Isofluorano 100% P/L (i.e.IsoFlo)Zoetis50019100
Tesoura tipo MayoFST14110-17Pontas rombas
MicromanipuladoresScientificaMicrostarhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
PaintbrushArt storen/aUm pincel de cerdas finas, adquirido em uma loja de arte local.
Pipeta PasteurFisher Scientific11546963Uma pipeta Pasteur de vidro, mas cortada de forma que a extremidade romba seja usada para transferir a pipeta.
Bomba peristálticaWatson Marlow12466260Bomba peristáltica monocanal
Extrator de pipetasSutter InstrumentsP-97Outros modelos e métodos de produção de pipetas funcionariam igualmente bem.
Seringas de plástico (1, 2, 5 mL)BD HealthcareVárias
ferramentas ósseas RongeurFST16021-14
Câmara de retenção de fatiasPeso de
Harvard ApparatusSHD-22L/15Alternativas seriam adequadas.
Pentobarbital de sódio (ou seja, Pentoject)Animalcare Ltd10347/4014200 mg/mL; outras formulações de pentobarbital seriam adequadas
EspátulaBochem3213Disponível na Fisher Scientific
Filtros de seringaFisher Scientific10482012Corning marca, 0,22 µ m diâmetro dos poros.
VibtratomeLeica1491200S001VT1200S modelo com
Banho-mariaFisher Scientific15167015banho-maria de 5 litros, por exemplo: Grant Instruments™ JBA5 scientifica-scicam-pro
Aparelho Harvard de Vários fatia/harpa caseiro Vibrocheck

Referências

  1. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  2. Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
  3. Babiec, W. E., Jami, S. A., Guglietta, R., Chen, P. B., O'Dell, T. J. Differential regulation of NMDA receptor-mediated transmission by SK channels underlies dorsal-ventral differences in dynamics of schaffer collateral synaptic function. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1950-1964 (2017).
  4. Papatheodoropoulos, C. Striking differences in synaptic facilitation along the dorsoventral axis of the hippocampus. Neuroscience. 301, 454-470 (2015).
  5. O'Reilly, K. C., et al. Identification of dorsal-ventral hippocampal differentiation in neonatal rats. Brain Structure and Function. 220 (5), 2873-2893 (2015).
  6. Cembrowski, M. S., et al. Spatial gene-expression gradients underlie prominent heterogeneity of CA1 pyramidal neurons. Neuron. 89 (2), 351-368 (2016).
  7. Cembrowski, M. S., Wang, L., Sugino, K., Shields, B. C., Spruston, N. Hipposeq: a comprehensive RNA-seq database of gene expression in hippocampal principal neurons. elife. 5, 14997(2016).
  8. Leonardo, E., Richardson-Jones, J., Sibille, E., Kottman, A., Hen, R. Molecular heterogeneity along the dorsal–ventral axis of the murine hippocampal CA1 field: a microarray analysis of gene expression. Neuroscience. 137 (1), 177-186 (2006).
  9. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorsoventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 77 (5), 955-968 (2013).
  10. Kjelstrup, K. B., et al. Finite scale of spatial representation in the hippocampus. Science. 321 (5885), 140-143 (2008).
  11. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  12. Booker, S. A., Vida, I. Morphological diversity and connectivity of hippocampal interneurons. Cell and Tissue Research. 373 (3), 619-641 (2018).
  13. Freund, T. F., Buzsaki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347(1996).
  14. Pelkey, K. A., et al. Hippocampal GABAergic inhibitory interneurons. Physiological Reviews. 97 (4), 1619(2017).
  15. Barnes, C. A., Rao, G., Foster, T. C., McNaughton, B. L. Region-specific age effects on AMPA sensitivity: Electrophysiological evidence for loss of synaptic contacts in hippocampal field CA1. Hippocampus. 2 (4), 457-468 (1992).
  16. Potier, B., Jouvenceau, A., Epelbaum, J., Dutar, P. Age-related alterations of GABAergic input to CA1 pyramidal neurons and its control by nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampus. Neuroscience. 142 (1), 187-201 (2006).
  17. Ekonomou, A., Pagonopoulou, O., Angelatou, F. Age-dependent changes in adenosine A1 receptor and uptake site binding in the mouse brain: An autoradiographic study. Journal of Neuroscience Research. 60 (2), 257-265 (2000).
  18. Pyapali, G. K., Turner, D. A. Increased dendritic extent in hippocampal CA1 neurons from aged F344 rats. Neurobiology of Aging. 17 (4), 601-611 (1996).
  19. Blalock, E. M., et al. Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3807-3819 (2003).
  20. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  21. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075(2006).
  22. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically-and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706(2014).
  23. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflügers Archive. 443 (3), 491-501 (2002).
  24. Aitken, P., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  25. Siwani, S., et al. OLMα2 cells bidirectionally modulate learning. Neuron. 99 (2), 404-412 (2018).
  26. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The rat hippocampal slice preparation as an in vitro model of ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  27. Dougherty, K. A. Differential developmental refinement of the intrinsic electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons from the rat dorsal and ventral hippocampus. Hippocampus. 30 (3), 233-249 (2020).
  28. Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Reports. 27 (13), 3725-3732 (2019).
  29. Newman, G. C., Qi, H., Hospod, F. E., Grundmann, K. Preservation of hippocampal brain slices with in vivo or in vitro hypothermia. Brain Research. 575 (1), 159-163 (1992).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Springer. 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  32. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
  33. Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79(2017).
  34. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. (10), Cold Spring Harbor Protocols. 4848(2007).
  35. Gee, C. E., Ohmert, I., Wiegert, J. S., Oertner, T. G. Preparation of slice cultures from rodent hippocampus. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), (2017).
  36. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  37. Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-Clamp Analysis. , Springer. 135-193 (2002).
  38. Dougherty, K. A., et al. Differential expression of HCN subunits alters voltage-dependent gating of h-channels in CA1 pyramidal neurons from dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1940-1953 (2013).
  39. Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 48(2013).
  40. Booker, S. A., et al. Presynaptic GABAB receptors functionally uncouple somatostatin interneurons from the active hippocampal network. Elife. 9, 51156(2020).
  41. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  42. Ordemann, G. J., Apgar, C. J., Brager, D. H. D-type potassium channels normalize action potential firing between dorsal and ventral CA1 neurons of the mouse hippocampus. Journal of Neurophysiology. 121 (3), 983-995 (2019).
  43. Arnold, E. C., McMurray, C., Gray, R., Johnston, D. Epilepsy-induced reduction in HCN channel expression contributes to an increased excitability in dorsal, but not ventral, hippocampal CA1 neurons. eNeuro. 6 (2), (2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

CA1 do hipocampohipocampo dorsalpatch-clamp de célula inteiraperfusão transcardíacafatias coronais modificadaseletrofisiologia de roedorespreparação de fatiaseletrofisiologia celularpreparação de fatias cerebrais

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.