Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.
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Artigo de método
Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O corte cerebral de roedores agudos oferece uma abordagem experimental tratável para obter uma visão sobre a organização e função de circuitos neurais com resolução unicelular usando eletrofisiologia, microscopia e farmacologia. No entanto, uma grande consideração no desenho de experimentos in vitro é a extensão em que diferentes preparações de fatias recapitulam padrões naturalistas da atividade neural como observado in vivo. No cérebro intacto, a rede hipocampal gera atividade populacional altamente sincronizada refletindo o estado comportamental do animal, como exemplificado pelos complexos de ondas agudas (SWRs) que ocorrem durante o despertar de estados consumados ou sono não-REM. SWRs e outras formas de atividade de rede podem surgir espontaneamente em fatias hipocampais isoladas em condições apropriadas. Para aplicar o poderoso kit de ferramentas de fatia cerebral à investigação da atividade da rede hipocampal, é necessário utilizar uma abordagem que otimize a saúde do tecido e a preservação da conectividade funcional dentro da rede hipocampal. Os camundongos são transcardialmente perfundidos com fluido cerebrospinal artificial à base de sacarose fria. As fatias horizontais contendo o hipocampo são cortadas a uma espessura de 450 μm para preservar a conectividade sináptica. As fatias se recuperam em uma câmara estilo interface e são transferidas para uma câmara submersa para gravações. A câmara de gravação foi projetada para superfusão de superfície dupla de fluido cerebrospinal artificial a uma alta taxa de fluxo para melhorar a oxigenação da fatia. Este protocolo produz tecido saudável adequado para a investigação de atividades complexas e espontâneas da rede in vitro.
Introdução
A medição eletrofisiológica de fatias hipocampais vivas in vitro é uma abordagem experimental poderosa com inúmeras vantagens. O experimentador pode usar um microscópio, micromanipuladores e um sistema de gravação para visualizar e coletar diretamente medições de neurônios individuais no tecido. As fatias de tecido também são muito acessíveis à fotostimulação ou à entrega de medicamentos para experimentos optogenéticos, quimigênicos ou farmacológicos.
A rede hipocampal gera atividade populacional altamente síncrona in vivo,visível como oscilações no potencial de campo local extracelular1,....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia (AC-AAAU9451).
1. Preparar soluções
- Prepare a solução de corte de sacarose para fatiamento, conforme descrito na Tabela 1.
NOTA: Após preparar 1 L de solução de sacarose, congele uma pequena quantidade (aproximadamente 100-200 mL) em uma bandeja de gelo. Estes cubos de gelo de sacarose congelados serão misturados em um chorume gelado (ver passo 4.3). - Prepare o fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) para gravação conforme descrito na Tabela 2
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Resultados
Apresentados aqui estão gravações representativas de fatias hec preparadas como descrito neste protocolo. Após a recuperação em uma câmara de retenção de interface(Figura 1C),as fatias são transferidas individualmente para uma câmara de gravação submersa(Figura 2B). A câmara de gravação é fornecida com ACSF saturada de carbogênio usando uma bomba peristáltica(Figura 2A). A bomba primeiro atrai ACSF de um béquer de retenção em um res.......
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Discussão
Existem várias etapas neste protocolo de corte projetado para promover a saúde do tecido e favorecer o surgimento da atividade de rede naturalista espontânea: o camundongo é transcardialmente perfumado com solução de corte de sacarose resfriada; as fatias do córtex horizontal-entorhinal (HEC) são cortadas a uma espessura de 450 μm do hipocampo intermediário ou ventral; as fatias se recuperam na interface do ACSF aquecido e do ar umidificado e rico em carbogen; durante as gravações as fatias são superfundidas com ACSF aqu.......
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Divulgações
O autor não tem nada a revelar.
Agradecimentos
O autor gostaria de agradecer a Steve Siegelbaum pelo apoio. O financiamento é fornecido pelo 5R01NS106983-02, bem como 1 F31 NS113466-01.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Impressora 3D | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Suporte de incubação de fatia de cérebro agudo | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Projetado por ChiaMing Lee, disponível em https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosina 5′-trifosfato sal de magnésio | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl pellets moídos | Warner | 64-1309, (E205) | |
| ágar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ácido ascórbico | Alfa Aesar | 36237 | |
| copo (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| copo (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocitina | Sigma Aldrich | B4261 | |
| liquidificador | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Tesoura Bonn, becton pequeno | , Dickinson | 14184-09 | |
| capilares de vidro borossilicato com filamento (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm, comprimento 10 cm) | capilares polidos a fogo | Sutter Instruments | BF150-86-10HP |
| solução de cloreto de cálcio (1 M) | Câmera G-Biosciences | R040 | |
| Gás carbogênio comprimido Olympus OLY-150 (95% oxigênio / 5% dióxido de carbono) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| oxigênio comprimido | Estimulador isolado de | Airgas OX 200 | |
| Lamínulas DS2A-Mk.II | |||
| (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| adesivo de cianoacrilato | Krazy | Glue KG925 | O ideal é utilizar o formulário de pincel para |
| software de aquisição de dados | Axograph | N/A | Qualquer software equivalente (por exemplo, pClamp) funcionaria. |
| Desktop Dell Precision T1500 Tower Workstation | Dell | N/A | O número do catálogo dependerá do computador específico - qualquer computador funcionará, desde que possa executar o software de aquisição de eletrofisiologia. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| temporizador digital | VWR | 62344-641 | 4 canais Rastreador |
| descartável almofadas absorventes VWR | 56616-018 | ||
| tesoura dissector | Ferramentas de Belas Ciências | 14082-09 | |
| lâminas de barbear de dois gumes | Personna | BP9020 | |
| duplo automático controlador de temperatura | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| câmara de gravação otimizada de superfície dupla ou fluxo laminar | N/A | N/A | A A câmara apresentada neste protocolo é feita sob medida. Um equivalente comercial seria o RC-27L da Warner Instruments. |
| rack de equipamento | Automate Scientific | FR-EQ70" | Um rack não é estritamente necessário, mas útil para organizar a eletrofisiologia |
| Etilenoglicol-bis(2-aminoetiéter)- N,N,N',N'-ácido teetraacético (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| papel de filtro | Whatman | 1004 070 | |
| escala fina | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Extrator de micropipeta flamejante/marrom | Sutter Instruments | P-97 | |
| placa de Petri de vidro (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glicose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosina 5′-trifosfato sal de sódio hidrato | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| baldes de gelo | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| vaporizador de isoflurano | Serviços Anestésicos Gerais | Tec 3 | |
| fita de laboratório | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| papel para lente | Fisher Scientific | 11-996 | |
| fonte de luz | Olympus | TH4-100 | |
| solução de cloreto de magnésio (1 M) | Qualidade Biológica 351-033-721EA | ||
| magnética barras de agitação | Fisher Scientific | 14-513-56 | O número de catálogo dependerá do tamanho da barra de agitação. |
| micromanipulador | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulador (manual) | Microscópio Scientifica | LBM-2000-00 | |
| Olympus | BX51WI | ||
| Ferramentas de Belas Ciências | 10089-11 | ||
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Amplificador de Microeletrodo | Molecular Devices MULTICLAMP | 700B | O MultiClamp 700B deve incluir headstages, porta-pipetas e uma célula modelo. |
| N- (2-hidroxietil) piperazina-N′ - (ácido 2-etanossulfônico), (HEPES) | Agulha Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| (calibre 20, 1,5 de comprimento) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| filamento de nylon | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | tamanho 0,004. Este gato. # é de malha de |
| nylon | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| bomba perstáltica | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Fosfocreatina di (tris) sal | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| suportes de pipeta | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| fio de platina | World Precision | PT0203 | |
| filamento de ácido polilático (PLA) | Ultimaker | RAL 9010 | |
| cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| gluconato de potássio | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| hidróxido de potássio | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| lâminas de barbear | VWR | 55411-050 | |
| grampo de rolo | Mundo Precision Instruments | 14041 | |
| escala | Mettler Toledo | PM2000 | |
| cabo de bisturi | Ferramentas de Ciências Finas | 10004-13 | |
| fatia harpa | Warner | SHD-26GH / 2 | |
| bicarbonato de sódio | Fisher Chemical | S233-500 | |
| cloreto de sódio | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| fosfato de sódio monobásico anidro | Fisher Chemical | S369-500 | |
| piruvato de sódio | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| espátula | VWR | 82027-520 | |
| espátula/colher, grande | VWR | 470149-442 | |
| lâminas de bisturi estéreis | Feather | 72044-10 | |
| agitador / placa quente | Corning | 6795-220 | |
| válvulas de torneira, 1 via | World Precision Instruments | 14054 | |
| válvulas de torneira, 3 vias | World Precision Instruments | 14036 | |
| sacarose | Acros Organics | ||
| suporte para grampos giratórios | Tesoura cirúrgica Fisher Scientific | 14-679Q | |
| , afiada/sem corte | Ferramentas de Ciência Fina | Seringa 14001-12 | |
| (1 mL) | de 309659 | Becton, Dickinson | |
| (60 mL com ponta Luer-Lok) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| pinça de três pontas Pinça de | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| , pinça de tecido grande | Fine Science | Tools 11021-15 | |
| , pequena | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| pipetas de transferência | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubulação | Tygon | E-3603 | ID 1/16 polegada, OD 3/16 polegada |
| tubulação | Tygon | R-3603 | ID 1/8 polegada, OD 1/4 polegada |
| graxa a vácuo | Dow Corning | 14-635-5D | |
| micrótomo de lâmina vibratória | Leica | VT 1200S | |
| mesa de amortecimento de vibrações com gaiola de faraday | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| balão volumétrico (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| balão volumétrico (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| banho-maria quente | VWR | 1209 |
Referências
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G.....
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Reimpressões e permissões
