Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Usando este protocolo, os pesquisadores podem investigar os mecanismos subjacentes às oscilações da rede hipocampal em preparações agudas de fatias de cérebro de camundongos. Nessa preparação, os registros são realizados em condições submersas em fatias gerando oscilações espontâneas da rede, permitindo a realização de técnicas farmacológicas e optogenéticas e a visualização de registros unicelulares. Para perfusão transcárdica, imediatamente antes de remover o camundongo da câmara de isoflurano, encha a tampa de uma placa de Petri com três a cinco milímetros de solução de sacarose resfriada e encha o fundo da placa de Petri com aproximadamente um centímetro de solução de sacarose resfriada.

Transfira rapidamente o mouse anestesiado para a almofada absorvente esquerda e use três pedaços de fita adesiva para prender os membros anteriores e a cauda. Usando uma pinça de tecido grande e uma tesoura cirúrgica, cubra a pele e faça uma incisão longitudinal da parte inferior do esterno até o topo do tórax. Use a pinça para puxar o esterno e use a tesoura para cortar o diafragma.

Use a tesoura para cortar a caixa torácica de cada lado em um grande movimento em direção ao ponto em que o membro anterior encontra o corpo e use a pinça para posicionar a frente da caixa torácica em direção à cabeça. Use a tesoura para fazer um corte horizontal para remover completamente as costelas e use a pinça para manter o coração no lugar enquanto insere uma agulha de perfusão de calibre 20 no ventrículo esquerdo. Quando a agulha estiver no lugar, use uma pequena tesoura de dissecção para fazer uma incisão no átrio direito e permita que o sangue seja eliminado do sistema circulatório.

Para extrair o cérebro, após a decapitação, use uma pequena tesoura de ligação para fazer dois cortes laterais no crânio em direção à linha média na frente do crânio perto dos olhos e faça dois cortes adicionais em cada lado da base do crânio. Mergulhe a cabeça na placa de Petri de vidro e use a tesoura para cortar ao longo da linha média em todo o comprimento do crânio, enquanto puxa para cima com a tesoura para minimizar os danos ao tecido cerebral subjacente. Use uma pequena pinça de tecido para agarrar firmemente cada lado do crânio e para levantar o osso para cima e para longe do cérebro para abrir o crânio como um livro.

Usando os dedos da mão esquerda para manter as abas do crânio abertas, insira a microespátula sob o cérebro perto dos bulbos olfatórios e vire o cérebro para fora do crânio na sacarose. Use a microespátula para cortar o tronco cerebral e lave o cérebro para remover qualquer resíduo de sangue, pêlo ou tecidos. Use a espátula grande para transferir o cérebro para a tampa da placa de Petri de vidro e use metade de uma lâmina de barbear de dois gumes para fazer um corte coronal na porção mais anterior do cérebro, incluindo os bulbos olfatórios.

Em seguida, faça um corte coronal para remover o cerebelo e aplique o adesivo de cianoacrilato em uma rampa de ágar. Use uma pinça para secar brevemente o cérebro em um pedaço de papel de filtro, antes de colocar o tecido no adesivo na rampa de ágar, com o lado ventral voltado para baixo. Coloque a plataforma de fatiamento na câmara de fatiamento de um micrótomo e cubra completamente a configuração com solução de sacarose resfriada.

Use a espátula grande para mexer um pouco de pasta de sacarose na câmara, derretendo qualquer sacarose congelada e reduzindo rapidamente a temperatura da mistura para um a dois graus Celsius. Corte fatias com uma espessura de 450 mícrons a uma velocidade de fatiamento de 0,07 milímetros por segundo. À medida que cada fatia é liberada, use a pinça de tecido pequeno e um bisturi afiado para separar os dois hemisférios e cortar o tecido até que a fatia consista principalmente nas regiões do hipocampo e do perihipocampo.

Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir as fatias individualmente para uma câmara de recuperação de interface contendo aCSF aquecido. Com as fatias posicionadas na interface do aCSF e do ar, e com apenas um menisco fino de aCSF cobrindo as fatias. Quando todas as fatias tiverem sido adquiridas, feche bem a câmara para permitir que as fatias se recuperem a 32 graus Celsius por 30 minutos.

No final do período de recuperação, coloque a câmara em um agitador ajustado para uma velocidade lenta para promover a circulação do aCSF dentro da câmara. Para registrar os potenciais de campo locais, encha um béquer de 400 mililitros com aCSF borbulhado em carbogênio e coloque uma extremidade do tubo da bomba no béquer. Ligue uma bomba peristáltica a 8 a 10 mililitros por minuto para direcionar o aCSF do copo de 400 mililitros para um reservatório aquecido e do reservatório para a câmara de registro a 32 graus Celsius.

Em seguida, prenda brevemente a tubulação e desligue a bomba para pausar o fluxo. Usando uma pinça fina, transfira uma fatia de tecido cerebral para a câmara de gravação pelo canto do papel da lente em que o tecido está apoiado, corte. Retire o papel da lente, deixando a fatia emergida na câmara de gravação, e use uma harpa para prender a fatia.

Usando um micromanipulador manual, avance lentamente a ponta de uma pipeta de estimulação cheia de cloreto de sódio na superfície da fatia em um ângulo de 30 a 45 graus e, em seguida, use um segundo micromanipulador para avançar lentamente a ponta de uma pipeta de potencial de campo local preenchida com aCSf para a região de interesse em um ângulo de 30 a 45 graus, e registrar o potencial de campo local da amostra de acordo com protocolos padrão. Nesta figura, podem ser observadas gravações representativas de fatias do córtex entorrinal do hipocampo, preparadas de acordo com o protocolo demonstrado. Em fatias saudáveis, a estimulação elétrica deve produzir um potencial pós-sináptico de campo com um pequeno voleio de fibra pré-sináptico e um grande potencial pós-sináptico com uma rápida descida inicial.

Ondulações espontâneas de ondas agudas também devem ser visíveis como deflexões positivas no potencial de campo local no estrato piramidal. Em fatias subótimas, os potenciais pós-sinápticos de campo evocado demonstram uma grande saraivada de fibras e um potencial pós-sináptico relativamente pequeno, e tais fatias não exibem ondulações espontâneas de ondas agudas. Ondulações de ondas agudas in vitro demonstram um potencial de campo positivo na camada piramidal do estrato, com uma oscilação de alta frequência sobreposta emparelhada com um potencial de campo negativo na camada do estrato radiato.

Conforme ilustrado, as ondulações de ondas agudas nas fatias do córtex entorrinal do hipocampo se originam nos circuitos recorrentes CA2 / CA3 e se propagam para CA1. É essencial borbulhar carbogênio nas soluções durante todo o procedimento, para garantir que a solução de sacarose seja resfriada e para executar cada etapa o mais rápido possível. Depois de preparar essas fatias, registros extracelulares ou intracelulares podem ser realizados, juntamente com experimentos optogenéticos ou farmacológicos para determinar como diferentes tipos de células contribuem para a função das redes neurais.