Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Summary

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Abstract

A microscopia de fluorescência baseada em folha de luz oferece soluções eficientes para estudar processos complexos em múltiplas escalas biologicamente relevantes. As configurações baseadas em câmaras de amostra, que são especificamente projetadas para preservar a integridade tridimensional do espécime e geralmente apresentam rotação de amostras, são a melhor escolha em biologia do desenvolvimento. Por exemplo, eles têm sido usados para documentar toda a morfogênese embrionária da mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e do besouro de farinha vermelha Tribolium castaneum. No entanto, muitos protocolos de imagem ao vivo disponíveis fornecem apenas estruturas experimentais para embriões únicos. Especialmente para estudos comparativos, tais abordagens são inconvenientes, uma vez que espécimes sequencialmente imagens são afetados pela variância ambiente. Além disso, limita o número de espécimes que podem ser testados dentro de um determinado tempo. Fornecemos uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas que aumenta o throughput em configurações baseadas em câmaras de amostra e, portanto, garante condições ambientais semelhantes para todos os espécimes. Em primeiro lugar, fornecemos uma diretriz de calibração para microscópios de fluorescência de folha de luz. Em segundo lugar, propomos um método de montagem para múltiplos embriões compatível com a rotação de amostras. Em terceiro lugar, fornecemos conjuntos de dados de imagem ao vivo tridimensionais exemplares de Drosophila, para os quais justapõem três linhas transgênicas com núcleos fluorescentes rotulados, bem como de Tribolium,para os quais comparamos o desempenho de três sublines transgênicas que carregam o mesmo transgênico, mas em diferentes locais genômicos. Nosso protocolo é especificamente projetado para estudos comparativos, pois aborda proativamente a variância ambiente, que está sempre presente em imagens vivas sequenciais. Isso é especialmente importante para análises quantitativas e caracterização de fenótipos aberrationais, que resultam, por exemplo, de experimentos eliminatórios. Além disso, aumenta o throughput global, que é altamente conveniente quando o acesso a microscópios de fluorescência de folha de luz é limitado. Finalmente, o método de montagem proposto pode ser adaptado para outras espécies de insetos e outros organismos modelo, por exemplo, zebrafish, sem basicamente nenhum esforço de otimização.

Introduction

A microscopia de fluorescência é uma das técnicas de imagem mais essenciais nas ciências da vida, especialmente na biologia celular e de desenvolvimento. Nos microscópios de fluorescência confocal¹, que são de última geração para imagens de fluorescência tridimensional desde meados da década de 1990, a mesma lente é usada para excitação fluorófora e detecção de luz de emissões. O raio laser de iluminação excita todos os fluoroforos ao longo do eixo de iluminação/detecção e o respectivo sinal fora de foco é discriminado antes da detecção por um orifício. Assim, para cada imagem bidimensional, todo o espécime é iluminado. Consequentemente, para c....

Protocol

1. Trabalho preparatório

1. Escolha uma combinação de lente/lente de detecção/câmera de iluminação para o LSFM que se adapte à questão científica e configure o microscópio. O tamanho do campo de visão é o quociente do tamanho do chip da câmera e a ampliação da lente de detecção. A lente de iluminação deve ser escolhida para que todo o campo de visão seja coberto por uma folha de luz aproximadamente planar³⁴. Três combinações recomendadas estão listadas na Tabela 1.
2. Para preparar alíquotas e pratos de recuperação, adicione 2 g de baixa derretimento à água da torneira autoclavada de 200 mL e aqueça a mistura em u....

Results

Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo de fluorescência comparativa em LSFMs baseados em câmara de amostra. Por exemplo, a estrutura pode ser usada para justapor (i) embriões (i) de duas ou mais espécies, (ii) embriões de linhas em que um ou mais genes são eliminados mais controles do tipo selvagem, (iii) embriões múltiplos da mesma linha transgênica, (iv) embriões de diferentes linhas transgênicas, ou (v) embriões de sublines que carregam o mesmo transgene , mas em diferentes locais gen.......

Discussion

Uma das áreas de aplicação exclusivas dos LSFMs é a biologia do desenvolvimento. Nesta disciplina, é importante olhar para espécimes vivos, caso contrário, processos morfogenéticos não podem ser descritos de forma dinâmica. Uma estrutura experimental para a imagem ao vivo simultânea em LSFMs baseados em câmara de amostras, como descrito aqui, é conveniente por duas razões principais.

A variância ambiente, que é inevitável em imagens vivas sequenciais, pode ser tratada proativamente. Em imagens.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de 6 poços	Orange Scientific	4430500	Placa
24 poços	Orange Scientific	4430300	Apenas para imagens ao vivo envolvendo Tribolium
35-mm Ø Placa de Petri	Fisher Scientific	153066	Apenas para imagens ao vivo envolvendo Drosophila.
90 mm e Oslash; Placa de Petri	Fisher Scientific	L9004575
100 µ Filtro de células de tamanho de malha m	BD Biosciences	352360
250 µ peneira de malha m	VWR International	200.025.222-038	Apenas para imagens em tempo real envolvendo Tribolium
300 µ peneira de malha m	VWR International	200.025.222-040	Apenas para imagens em tempo real envolvendo Tribolium
710 e micro; peneira de malha m	VWR International	200.025.222-050	Apenas para imagens ao vivo envolvendo Tribolium
800 µ peneira de malha m	VWR International	200.025.222-051	Apenas para imagens em tempo real envolvendo farinha de trigo fina Tribolium
405	Demeter e.V.	SP061006	Apenas para imagens ao vivo envolvendo Tribolium
meio Drosophila disponível comercialmente	Genesee Scientific	66-115	Apenas para imagens ao vivo envolvendo Drosophila / Meio Drosophila personalizado também pode ser usado
microesferas fluorescentes, 1.0 µ m Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
levedura seca inativa	Genesee Scientific	62-108
agarose de baixo ponto de fusão	Carl Roth	6351.2
frascos estreitos	Genesee Scientific	32-109	Apenas para imagens ao vivo envolvendo pincel Drosophila
small VWR	International	149-2121
hipoclorito de sódio (NaOCl), ~ 12% ativo Cl	Carl Roth	9062.3	Cuidado: o hipoclorito de sódio é uma
farinha de trigo integral	Demeter e.V.	SP061036	Apenas para imagens ao vivo envolvendo Tribolium / Reino Unido:
frascos largos de	Genesee Scientific	32-110	Apenas para imagens ao vivo envolvendo Drosophila