Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

Resumo

A Espectroscopia De Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) fornece uma plataforma poderosa para estudos bacterianos, permitindo alcançar a resolução de nanoescala. Ambos, o mapeamento de alterações subcelulares (por exemplo, na divisão celular) quanto estudos comparativos de composição química (por exemplo, decorrentes da resistência a medicamentos) podem ser conduzidos a um único nível celular em bactérias.

Resumo

A Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) é uma nova técnica combinatória, que permite a caracterização simultânea de propriedades físicas e composição química da amostra com resolução nanoescala. Ao combinar AFM com IR, a limitação de resolução espacial do IR convencional é superada, permitindo que uma resolução de 20-100 nm seja alcançada. Isso abre as portas para uma ampla gama de novas aplicações de IR para sondar amostras menores que vários micrômetros, antes inalcançáveis por meio de microscopia de RI convencional. O AFM-IR é eminentemente adequado para pesquisas bacterianas, fornecendo informações espectrais e espaciais no nível único e intracelular. As crescentes preocupações globais com a saúde e a previsão futura desfavorável em relação às infecções bacterianas e, especialmente, ao rápido desenvolvimento da resistência antimicrobiana, criaram uma necessidade urgente de uma ferramenta de pesquisa capaz de sondar fenotípico no nível único celular e subcelular. A AFM-IR oferece o potencial de atender a essa necessidade, permitindo a caracterização detalhada da composição química de uma única bactéria. Aqui, fornecemos um protocolo completo para preparação amostral e aquisição de dados de espectro único e modalidade de mapeamento, para a aplicação do AFM-IR em estudos bacterianos.

Introdução

Bactérias são organismos procarióticos de células únicas, ocorrendo em várias formas e tamanhos, tipicamente na faixa de várias centenas de nanômetros a micrômetros. Eles existem em uma variedade de habitats e são essenciais para a existência da vida. Dentro do corpo humano, a maioria das bactérias presentes no intestino são inofensivas e muitas são de fato benéficas¹. No entanto, várias espécies bacterianas são patogênicas e causam uma série de doenças infecciosas. Infecções bacterianas podem levar ao desenvolvimento de sepse e choque séptico: uma condição de risco de vida, resultante da resposta do corpo a uma infecção². A sepse é uma grande ameaça à saúde global, com alta prevalência mundial e taxas de mortalidade severas. Somente em 2017, foram registrados cerca de 50 milhões de casos de sepse em todo o mundo, com 11 milhões deles resultando em morte (aproximadamente 20%)². Além disso, a diminuição das chances de sobrevivência do paciente, devido à demora terapêutica, mostrou-se ocorrer de forma horária^3,4.

Infecções bacterianas são tratadas com antibióticos. A gravidade das consequências potenciais das infecções bacterianas da corrente sanguínea (ISS), juntamente com um claro significado do início rápido da terapia antimicrobiana, estimula a necessidade de administração imediata de antibióticos. No entanto, como as abordagens diagnósticas atuais utilizadas na prática clínica (por exemplo, cultivo de sangue) requerem um tempo relativamente longo, a administração de antibióticos geralmente ocorre antes do diagnóstico positivo do BSI⁵. Esse fator leva ao uso excessivo de antibióticos, o que, juntamente com o uso excessivo de antibióticos em outros setores, como a agricultura, cria uma severa pressão evolutiva para o desenvolvimento da resistência antimicrobiana (AMR)^6,7. Atualmente, a AMR é um dos mais urgentes problemas globais de saúde^7,8 e, até 2050, está prevista para se tornar a principal causa de morte⁹. O desenvolvimento da resistência, juntamente com a disseminação das cepas de AMR está ocorrendo em um ritmo alarmante^7,8,9 e excede, de longe, a taxa de descoberta de novos antibióticos¹⁰. Novos fenótipos resistentes estão continuamente emergindo em todo o mundo, enquanto
pesquisa dedicada à compreensão das alterações relacionadas à RM é muitas vezes lenta e limitada pelas abordagens disponíveis¹¹. Além disso, os métodos comumente utilizados, como a reação em cadeia de polimerase (PCR) e o sequenciamento genético inteiro (WGS), focam apenas em alterações genotipópicas. Estes não são suficientes para revelar os mecanismos de resistência¹¹, o que provoca uma necessidade urgente de uma ferramenta de pesquisa que permita compreender a composição química das bactérias.

A espectroscopia infravermelha (IR) fornece uma caracterização molecular da amostra e, portanto, é um candidato promissor para sondagem bacteriana fenotípica. Desde suas primeiras aplicações¹², uma grande magnitude de exemplos de seu uso foi demonstrada na literatura^13,14. Estes incluem a identificação à base de bactérias em^{gêneros 15}, espécies¹⁶e cepa^17,18 nível. No entanto, a resolução espacial do IR convencional é restrita a vários mícrons devido ao limite de resolução espacial de difração de difração de comprimento de onda¹⁹. Uma vez que o tamanho da maioria das bactérias está abaixo desse limite (por exemplo, Staphylococcus aureus ≈ 400 nm de diâmetro), o IR convencional não é aplicável para sondagem no nível unicelular ou intracelular.

A limitação da resolução espacial foi recentemente superada pela combinação de espectroscopia de IR com Microscopia da Força Atômica (AFM-IR). Neste caso, a absorção do IR é detectada indiretamente, através da expansão térmica do material^19,20,21,22. Em suma, a absorção da radiação IR resulta em um aumento de temperatura local. Isso pode ser medido diretamente²³ ou através da medição da oscilação da sonda cantilever AFM, resultante do impulso de força criado pela absorção de IR^20,21. A técnica combinatória AFM-IR permite alcançar uma resolução espacial de 20 nm, fornecendo informações simultâneas sobre as propriedades físicas locais de uma amostra (AFM) e sua composição química (AFM-IR). A coleta de ambos, espectro único de pontos selecionados e mapeamento da intensidade dos valores de número de ondas selecionados dentro de uma área escolhida são possíveis.

Considerando a resolução espacial alcançável do AFM-IR, é evidente que a técnica abre a possibilidade de sondagem química/fenotípica de célula única de bactéria e sua composição intracelular²⁴. Até então, vários exemplos da aplicação de AFM-IR para bactérias únicas foram demonstrados na literatura^{19,20,21,22,25,26,27,28}. Estes envolvem análise espectral única^19,21,22 e mapeamento no nível subcelular^{19,22,25,26,27,28}. Por exemplo, a capacidade de detectar vesículas lipídicas intracelulares²⁷ e vírus²⁸ dentro de uma única bactéria foi descrita. Esses resultados demonstram a utilidade do AFM-IR para estudos de nanoescala de bactérias únicas e patógenos clinicamente relevantes¹⁹.

Assim, apresentamos um método de preparação e coleta de amostras para dados AFM-IR de amostras bacterianas multicamadas, monocamadas e células únicas. O protocolo aqui descrito foi aplicado para estudar diferentes espécies de bactérias²² e as alterações em sua composição química. Em particular, o desenvolvimento in vivo da resistência à vancomicina e da suscetibilidade à daptomicina foi investigado em pares clínicos de S. aureus¹⁹. Ambos, a resistência intermitente vancomicina e a não suscetibilidade à daptomicina em S. aureus (VISA e DpR) surgiram relativamente recentemente, após o aumento do uso e introdução desses antibióticos às clínicas, constituindo um problema médico significativo. Além disso, em particular, o mecanismo de não suscetibilidade da daptomicina ainda permanece indescritível, impedindo o desenvolvimento de medicamentos alternativos^19,29. O protocolo apresentado se concentra no fornecimento de espectros afm-IR confiáveis de bactérias únicas, que podem ser analisados ainda utilizando uma variedade de abordagens quimiómétricas, de acordo com os objetivos experimentais. Além disso, inclui a abordagem de mapeamento, que é aplicável para estudos intracelulares.

Protocolo

Todo o trabalho realizado com bactérias patogênicas deve ser realizado com as medidas de segurança adequadas em vigor. Estes incluem trabalhar em um laboratório com nível adequado de biossegurança e em uma cabine de biossegurança (PC2), bem como descontaminação cuidadosa da área de trabalho com uma solução adequada de desinfetante, por exemplo, 80% de etanol. Epi apropriado deve ser usado o tempo todo.

1. Preparação de solventes e materiais

1. Solventes: Use água ultrauso como solvente. Use água purificada, autoclaved antes do experimento para evitar qualquer potencial contaminação cruzada.
2. Substrato: Use qualquer um desses substratos para AFM-IR, por exemplo, ZnSe, CaF₂, BaF₂, etc. Uma vez que o AFM-IR é, em princípio, uma técnica não destrutiva, pode-se aplicar uma variedade de outras ferramentas de pesquisa à mesma amostra pós-análise AFM-IR. Por exemplo, a correlação dos resultados com a espectroscopia de Raman pode ser realizada se forem utilizados slides caf₂ ou BaF₂ de grau Raman.
3. Use frascos de vidro em vez de tubos plásticos, pois o plástico pode contaminar a amostra.

2. Preparação da amostra para AFM-IR

1. Crescimento/incubação da amostra
   1. Cultivar bactérias em mídia líquida ou em placas sólidas. Selecione o tipo de condições médias de crescimento (por exemplo, temperatura, disponibilidade de oxigênio) e tempo de crescimento de acordo com os requisitos específicos das espécies de bactérias sob investigação. Por exemplo, para placas de ágar de infusão cardíaca S. aureus (HI), com crescimento de 16 h em 37 °C em condições aeróbicas.
      NOTA: Para alcançar os melhores resultados, o crescimento/incubação deve produzir bactérias suficientes que permitam a coleta de uma micro-pelota de amostra. O número específico de unidades formadoras de colônias ou células bacterianas depende do tipo e tamanho da bactéria.
2. Depoimento de amostra
   1. Usando um laço estéril, colete cuidadosamente bactérias das colônias na placa de ágar e transfira-as para um tubo de vidro. Coletar bactérias apenas do topo das colônias. Se coletar amostras de uma cultura líquida, usando uma pipeta, transfira aproximadamente 1 mL da suspensão bacteriana para um tubo de vidro. O volume pode ser modificado dependendo da carga bacteriana.
      NOTA: É importante tentar não coletar (ou minimalizar o máximo possível a coleta de) qualquer meio de debaixo da colônia. As etapas subsequentes da preparação da amostra visam remover qualquer resíduo potencial da mídia. A minimização do resíduo médio potencial desde o início permite a aquisição espectral de dados de células bacterianas purificadas. As etapas 2.2.2 e 2.2.3 aplicam-se às amostras preparadas a partir de placas de ágar. Para amostras preparadas a partir de mídia líquida, mova-se para a etapa 2.2.4.
   2. Adicione 1 mL de água ultrapura ao tubo. Vórtice até que a pelota bacteriana coletada não esteja mais visível na parte inferior do tubo (tipicamente 1-2 min).
   3. Estimar a turbidez da solução usando, por exemplo, os padrões da McFarland por comparação visual³⁰ entre a solução preparada e os padrões mcfarland. Se a turbidez da suspensão bacteriana parecer muito baixa, adicione mais bactérias da placa usando um laço estéril e vórtice novamente. Repita até que a turbidez da solução seja comparável às normas McFarland 0.5 e 1. Isso geralmente renderá uma boa quantidade de pelotas bacterianas.
   4. Centrifugar a suspensão bacteriana a 3.000 x g por 5 min para obter uma pelota.
      NOTA: Os parâmetros de centrifugação podem ser modificados para obter pelotas bacterianas. Deve-se ter cuidado se aumentar a força G, para não induzir a quebra de bactérias (especialmente no caso de bactérias Gram-negativas).
   5. Usando uma pipeta, remova suavemente o sobrenatante de cima da pelota. Adicione 1 mL de água ultrauso ao tubo e vórtice para suspender a pelota. Posteriormente, centrifugar a amostra como foi feito na etapa 2.2.4.
   6. Repita o procedimento de lavagem (etapas 2.2.2 e 2.2.4) pelo menos três vezes. Em caso de coleta da amostra inicial a partir de mídia líquida, repita o procedimento pelo menos quatro vezes (remoção da mídia seguida de três lavagens).
   7. Após a lavagem final, remova o supernascente, adicione água ultrapura e vórtice por pelo menos 2 minutos. Posteriormente, deposite 5 μL da amostra no substrato (por exemplo, Grau Raman CaF₂).
   8. Se a espessura desejada da amostra for uma multicamadas de bactérias, deixe a amostra para secar o ar.
   9. Se a espessura desejada for monocamada ou bactérias individuais, imediatamente após o depósito da amostra (etapa 2.2.7) adicione entre 20-100 μL de água ultrapura e misture suavemente com uma ponta de pipeta. Deixe secar ao ar.
      NOTA: O volume exato de água pode variar entre experimentos, pois depende de muitos fatores (por exemplo, tamanho do organismo, densidade da pelota, etc.) e é, portanto, melhor determinado empiricamente. A preparação de uma série de amostras com volumes variados de água ultrauso adicionada permite selecionar uma amostra com a espessura/densidade desejada das bactérias. A espessura/densidade das bactérias pode ser facilmente visualizada via AFM nos estágios subsequentes. Exemplos de imagens AFM de amostras de monocamadas e células únicas são mostrados na Figura 1A-H.
   10. Monte o substrato em um disco de amostra de metal AFM usando fita adesiva de dois lados.

3. Preparação do instrumento

NOTA: Os procedimentos instrumentais aqui descritos são para o instrumento listado na Tabela de Materiais. O procedimento instrumental detalhado pode diferir ligeiramente do descrito aqui se utilizar um modelo mais novo do instrumento AFM-IR.

1. Ligue e inicialize o instrumento pressionando o botão Initialize. Certifique-se de que o obturador a laser está na posição Aberta para o teste a laser.
2. Se um sistema de purga estiver configurado, purgue o instrumento com N₂ ligando o fluxo de N₂. Ajuste o expurgo de nitrogênio para atingir um nível de umidade estável (por exemplo, 20%). Certifique-se de que a umidade não flutua durante as medições e entre a coleta de dados de fundo e amostra. Recomenda-se permitir que aproximadamente 20 minutos para que os níveis de umidade se estabilizem.
3. Carregue a amostra na câmara de amostra pressionando o botão Carregar. O carregamento de amostras é realizado através do assistente de software. Durante a operação do assistente de software, primeiro foque na ponta, usando setas para mover o estágio do microscópio na direção Z e clique em Next. Em segundo lugar, ajuste o ponto de coleta de dados, usando setas que guiam o movimento do plano e alinhe o laser AFM e o detector AFM usando os botões na parte superior da cabeça AFM. Posteriormente, concentre-se na superfície da amostra movendo o estágio do microscópio na direção Z.
   NOTA: Ilustrações detalhadas de cada etapa de carregamento de amostras são fornecidas no manual de software³¹. O foco na amostra deve ser conduzido com cuidado. Ao se aproximar da superfície da amostra na direção Z, use uma velocidade lenta do motor.
4. Aproxime-se da amostra sem se envolver clicando no botão Abordagem.

4. Coleta de dados

1. Fundo
   1. Antes da aquisição de dados, colete o fundo. Para coleta de fundo, certifique-se de que o obturador a laser esteja na posição Aberta. Selecione a faixa e resolução espectral (dependendo do objetivo da análise) e o número de varreduras e número de co-médias de fundo. Estes são geralmente recomendados para ser alto (por exemplo, 1024 scans e 3 co-médias).
      NOTA: Em geral, recomenda-se resolução espectral de 4 cm^-1 ou 8 cm^-1 e faixas espectrais de 3.200 cm^-1–1 -1^e 1.800 cm^-1-900 cm^-1.
   2. Após a aquisição do fundo, salve o arquivo de fundo. O arquivo não é armazenado automaticamente. Altere a posição do obturador a laser para fechar.
2. Amostra – espectro único
   1. Pressione o botão Engajar para engatar na amostra. O sistema começará a se aproximar da superfície da amostra, até que o contato direto seja detectado.
      NOTA: O set point usado neste trabalho variou entre 0,15-2 V e os ganhos de feedback (I Gain e P Gain) normalmente seriam definidos para 3 e 10. As sondas de contato NIR2 são comumente usadas com sistema nanoIR2 (modelo: PR-EX-nIR2-10, frequência de ressonância (kHz): 13 +/−4 kHz, constante de mola (N/m): 0,07-0,4 Nm^-1).
   2. Colete uma imagem AFM para visualizar a superfície. Em primeiro lugar, escaneie uma área maior (por exemplo, 50 x 50 μm) com menor resolução espacial (por exemplo, 200 x 200 pontos)(Figura 1I).
      NOTA: Os dados AFM-IR são sempre coletados no modo de contato, no entanto, os dados AFM podem ser coletados no modo de contato ou toque.
   3. A partir da imagem de altura/deflexão afm, selecione uma área específica de interesse e reimagem-a com maior resolução espacial(Figura 1J-K). Certifique-se de que a velocidade de coleta de dados seja adequada, com movimento de ponta lenta (por exemplo, Taxa de Varredura 0,2-0,4 Hz).
   4. Selecione o ponto de medição (por exemplo, uma única bactéria) e mova a ponta para o local.
   5. Alinhe o laser IR. Para isso, use um número de ondas no qual a amostra absorverá. Para materiais biológicos, isso pode ser, por exemplo, amide I (1655 cm^-1). Certifique-se de que o filtro de passe de banda está desligado e clique em Iniciar IR. O gráfico direito no medidor nanoIR (FFT da deflexão exibida como amplitude versus frequência) deve mostrar pelo menos um pico claro e o gráfico esquerdo (deflexão versus tempo) deve ter uma forma de onda periódica. Se esse não for o caso, proceda para otimizar as manchas de IR.
      NOTA: Mesmo que o Fast Fourier Transform (FFT) e o perfil esperado de deflexão, é recomendável realizar a otimização de pontos de IR para pelo menos vários números de ondas, onde as bandas são esperadas.
   6. Otimize os pontos quentes para a coleta de dados de RI usando os valores de número de ondas selecionados. Pode ser útil usar um espectro de IR convencional das bactérias (por exemplo, espectro ATR de pelotas bacterianas) para identificar as posições das bandas e usá-las para otimizar os pontos quentes. Selecione vários valores de número de ondas (por exemplo, 8-10) de várias regiões espectrais.
      NOTA: Se o espectro convencional de bactérias de interesse não pôde ser coletado antes da coleta de dados AFM-IR, os espectros bacterianos disponíveis na literatura podem ser usados como orientação áspera. O resultado da otimização de um ponto de IR é uma imagem, que apresenta um mapa do sinal de magnitude FFT em cada local x e y. O local com maior sinal é selecionado automaticamente. Exemplos dessas imagens são dados no manual do software³¹.
   7. Depois de otimizar os pontos de IR para valores de número de ondas selecionados, defina os parâmetros da coleta de dados espectrais: região espectral, resolução espectral, número de varreduras e energia aplicada e insumo-os nas janelas apropriadas do software. A resolução espectral deve corresponder à resolução de fundo e a região espectral deve estar dentro da região espectral para a qual foi coletado o fundo.
      NOTA: Um conjunto inicial genérico de parâmetros poderia ser: faixa espectral: 3200 cm^-1-2800 cm^-1 e 1800 cm^-1–900 cm^-1, resolução espectral: 4 cm^-1 ou 8 cm^-1, número de varreduras: 512-2048.
   8. Se necessário, ajuste a potência do laser dependendo do sinal. Em geral, valores entre 8%-10% de potência laser devem ser suficientes para uma boa qualidade de sinal. Valores mais elevados podem ser usados com cautela, pois podem resultar em danos amostrais.
      NOTA: A potência por cento do laser pode variar dependendo do tipo de laser IR. Os valores por cento dados aqui são para laser OPO.
   9. Clique em Adquirir para coletar o espectro AFM-IR.
   10. Recolha os dados AFM da mesma área após a coleta do espectro AFM-IR. Isso é altamente recomendado, pois revelará qualquer potencial deriva e/ou influência destrutiva na amostra.
   11. Se o espectro AFM-IR for satisfatório e nenhuma influência destrutiva na amostra for observada, proceda à coleta de dados. Se necessário, defina uma série de pontos para coleta de dados usando a opção Array e colecione a altura ou a imagem de deflexão da AFM. Esta opção permite coletar espectros consecutivamente de cada ponto com os mesmos parâmetros espectrais definidos para um único espectro.
   12. Se a imagem AFM coletada após a coleta do espectro AFM-IR revelar influência destrutiva na amostra (tipicamente um ponto queimado), reduza a potência; selecione um local diferente e repita as etapas 4.3.8-4.3.11.
   13. Se o sinal no espectro AFM-IR não for satisfatório, verifique a correção da otimização das manchas de RI (etapa 4.3.6). Se estiver correto, aumente ligeiramente a potência do laser e repita as etapas 4.3.7-4.3.11. Isso pode ser repetido até que o sinal satisfatório seja alcançado.
3. Amostra – abordagem de imagem
   NOTA: É altamente recomendável registrar um único espectro AFM-IR da bactéria antes de coletar uma imagem de distribuição de intensidade para um valor de número de ondas selecionado.
   1. Registo uma imagem AFM da área amostral escolhida. Para isso, primeiro colete a imagem AFM de uma área maior com menor resolução espacial (por exemplo, 50 x 50 μm, 200 x 200 pontos), depois selecione uma região de interesse e colete uma imagem AFM com maior resolução espacial (conforme ilustrado na Figura 1I-K).
   2. Selecione os valores de número de ondas para imagens AFM-IR.
   3. Certifique-se de que a mancha de IR do laser seja otimizada para os valores de número de ondas selecionados (etapa 4.3.6). Se o ponto ir não for otimizado para alguns números de ondas (sem máximo claro), otimize-o para eles.
   4. Defina os parâmetros da área imagem: largura e altura, número de pontos de dados na direção X e Y.
      NOTA: Se a seleção consecutiva de pontos das imagens AFM anteriores for aplicada (como demonstrado na Figura 1I-K),os campos de largura e altura serão automaticamente preenchidos, após a marcação da área.
   5. Defina os parâmetros de aquisição de sinal espectral: o comprimento de onda, o número de varreduras e a potência do laser.
      NOTA: O número de exames precisa ser mantido dentro da razão. 64 ou 32 varreduras normalmente permitirão uma quantidade suficiente de sinal.
   6. Defina os parâmetros do movimento da ponta AFM clicando na Taxa de Varredura. Quanto maior o número de varreduras na etapa anterior e o número de pontos de dados na direção X, mais lento será o movimento da ponta. A falta de ajuste entre esses parâmetros resultará em um movimento muito rápido da ponta, impedindo a aquisição real do número definido de varreduras de cada ponto.
      NOTA: Por exemplo, para uma coleta adequada de sinal IR com 64 co-adições e 200 pontos, defina a Taxa de Varredura como 0,07 kHz.
   7. Certifique-se de que a caixa de imagem Enable IR esteja marcada.
   8. Comece a imagem. AFM-IR da intensidade do sinal no número de ondas selecionado será coletado simultaneamente com os dados AFM dessa área.
      NOTA: Quando o laser OPO é usado, é possível coletar simultaneamente a imagem de frequência de pico de ressonância. Isso pode ser usado para obter informações sobre a rigidez relativa da amostra em diferentes locais.
   9. Use a janela Sequência de captura para definir uma coleção consecutiva de dados AFM-IR da mesma área com os mesmos parâmetros, mas para diferentes valores de número de ondas. Para isso, abra a janela Sequência de captura, digite cada número de ondas e defina o poder laser aplicado (para cada número de onda).
   10. Exporte os dados coletados (AFM e AFM-IR, espectro único e imagem) em vários formatos e analise-os utilizando métodos adequados para objetivos específicos de pesquisa.

Resultados

O protocolo descrito permite obter uma gama de tipos de distribuições celulares de bactérias no substrato, dependendo da concentração inicial da amostra e da quantidade de água adicionada. A Figura 1 ilustra os exemplos de imagens AFM (altura e deflexão) registradas a partir de monocamadas e amostras de células únicas preparadas usando o protocolo descrito das bactérias Gram-positive(S. aureus) e Gram-negativas(Escherichia coli).

O protocolo descrito aqui pode ser utilizado para imagens AFM-IR de estruturas intra e extracelulares de bactérias únicas. Um exemplo desta aplicação é mostrado na Figura 2,que demonstra os resultados do monitoramento das alterações químicas espacialmente localizadas ocorridas durante a divisão de uma célula S. aureus. Embora a secagem do ar seja comumente considerada como uma abordagem de fixação para a preparação bacteriana, as bactérias, por natureza, mostram resistência muito alta a fatores externos, como a temperatura e foram relatadas para sobreviver à desidratação³². Os resultados aqui apresentados foram adquiridos a partir de uma amostra seca de ar. A formação de um septo, ocorrida antes da divisão celular foi observada e monitorada via imagem AFM (Figura 2A-D) por coleta de 12 imagens da mesma área consecutivamente (coleta de uma única imagem ≈ 20 min). A Figura 2A-D mostra 4 imagens AFM selecionadas, com tempo entre a coleta de cada imagem de aproximadamente 40 minutos. A estrutura formada (septo) tem 45 nm de altura. O septo formado é claramente visível em imagens de altura e deflexão da AFM(Figura 2E-F). Os espectros AFM-IR registrados a partir da área celular e septo (Figura 2G, pontos de origem marcados na Figura 2F) foram normalizados para a faixa amida I antes da comparação, para minimalizar a influência da espessura amostral variada entre os pontos de coleta de dados. O espectro AFM-IR do septo é caracterizado por maior intensidade relativa das bandas em 1240 e 1090 cm^-1 em comparação com o espectro AFM-IR coletado da área celular. Estes são atribuídos a grupos de carboidratos e fosfodiester de componentes da parede celular (incluindo, por exemplo, peptidoglycan e ácido teicóico)²².

O protocolo descrito também pode ser usado para comparação de um único espectro entre várias amostras diferentes. Um exemplo deste aplicativo juntamente com os resultados é mostrado na Figura 3 e Figura 4. O objetivo do estudo é determinar as alterações químicas ocorridas como resultado do desenvolvimento in vivo da resistência intermitente vancomicina em S. aureus (VISA). Para isso, foram coletados pares clínicos de amostras dos pacientes, com a cepa dos pais isolada após a internação no hospital e antes da terapia antibiótica (vancomicina suscetível S. aureus, VSSA) e a cepa da filha isolada do mesmo paciente após a admissão de antibióticos e insuficiência clínica. As amostras foram ainda cultivadas em ágar médio e preparadas de acordo com o protocolo (Figura 3A-B). Os espectros AFM-IR foram coletados de múltiplas bactérias únicas (e múltiplas amostras) para VSSA e VISA e posteriormente analisados utilizando várias abordagens quimiométricas(Figura 3C).

Não foram observadas diferenças morfológicas entre as células VSSA e VISA(Figura 4A-C). No entanto, os espectros AFM-IR (Figura 4D,F) e seus segundo derivados (Figura 4E,G) demonstraram uma clara diferença na composição química entre cepas resistentes e suscetíveis. A intensidade relativa das bandas associadas aos grupos de carboidratos e fosfodiester a partir de componentes da parede celular (em particular, a banda em 1088 cm^-1) claramente aumentou na cepa resistente, em comparação com a contrapartida suscetível. Nota-se que todos os espectros recodificados (VISA: 81, VSSA: 88) mostram um pequeno desvio padrão. Isso demonstra boa reprodutibilidade de dados registrados a partir de várias amostras preparadas a partir da mesma cepa, uma vez que não foi possível discriminação entre espectros registrados de diferentes amostras da mesma cepa. As diferenças observadas indicaram um aumento da espessura da parede celular em cepas resistentes, em comparação com a contrapartida suscetível, que permanece de acordo com outros relatórios de literatura^33,34.

Figura 1: Imagens representantes da AFM de várias amostras bacterianas para medições AFM-IR. Dependendo da diluição do substrato, o protocolo permite obter multicamadas e monocamadas de bactérias, bem como amostras unicelulares. Imagens de REPRESENTANTE AFM de: (A-D) monocamada e (E-H) amostra de célula única para (A, B,E,F) Gram-positivo(S. aureus) e (C,D,G,H) Gram negativo(E. coli). (A,C,E,G) demonstram imagens de altura e (B,D,F,H) mostram imagens de deflexão correspondentes. Tamanho das áreas imagens: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I–K) seleção consecutiva de uma área para mapeamento AFM-IR. Isso é conseguido usando imagens AFM com resolução espacial crescente no exemplo de uma única célula S. aureus. Cada imagem é coletada por amostragem de 200 x 200 pontos, com aumento da resolução espacial devido à redução do tamanho da área imagem. Tamanho das áreas de imagem: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm e (K) 2,24 x 2,24 μm. O quadrado preto em(I) marca a área imagem em(J). O quadrado preto em (J) marca a área imagem em(K). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Monitorando a divisão celular S. aureus via AFM-IR. (A-D) Imagens AFM da célula S. aureus mostrando a formação de septo anterior à divisão celular. Tamanho da área de imagem: 2 x 2 μm. As imagens foram selecionadas a partir de uma série maior (12 imagens gravadas a cada 20 minutos) e representam dados registrados a cada 40 minutos. (E-F) imagem de altura e deflexão AFM registrada no final da formação de septo celular com pontos marcados de coleta de espectros AFM-IR. Tamanho da área de imagem 1,17 x 1,15 μm. A altura da estrutura recém-formada é de 45 nm. (G) Espectros AFM-IR registrados a partir da área celular (preta) e septo (vermelho) (marcado em (F)), na faixa 1400-900 cm^-1. Ambos os espectros foram normalizados para a banda amide I e demonstram um aumento na intensidade relativa dos componentes da parede celular a partir do septo. Este número foi modificado de K. Kochan et al.²². Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Uma visão geral do projeto experimental para o estudo AFM-IR de resistência antimicrobiana. (A) Origem da amostra e preparação inicial: a cepa parental suscetível foi coletada de um paciente antes da terapia antibiótica e a cepa resistente à filha foi originada do mesmo paciente após a antibióticoterapia e falha clínica (desenvolvimento de resistência in vivo). As bactérias foram isoladas e cultivadas no ágar de Infusão cardíaca (HI) por 16 h em 37 °C. (B) Preparação posterior da amostra para AFM-IR, incluindo coleta da amostra seguida de lavagem de palete bacteriana (3×) e deposição amostral. (C) Coleta e análise de dados AFM-IR: altura AFM e espectro AFM-IR (1800-900 cm^-1). Tamanho da área de imagem AFM: 1,7 x 1,4 μm. O espectro AFM-IR foi coletado do meio da célula. Os dados foram posteriormente analisados utilizando-se abordagens quimiómétricas, incluindo análise hierárquica de cluster. Este número foi modificado de K. Kochan et al.¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados afm e AFM-IR do estudo de alterações químicas na vancomicina intermediária S. aureus (VISA) em comparação com vancomicina suscetível S. aureus (VSSA) em pares clínicos. Imagens AFM de(A-B) AMOSTRAS DE VISA e(C) VSSA de célula única. Tamanho das áreas imagens: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D-E) Espectro médio AFM-IR e seus(F-G) segundo derivados para: (D,F) VISA e(E,G) Células VSSA, na faixa espectral 1800-900 cm^-1. Os espectros apresentados são uma média de 81 (VISA) e 88 (VSSA) espectros individuais e são apresentados juntamente com desvio padrão (SD). A média foi realizada após a normalização de todos os espectros individuais juntos. As principais bandas estão marcadas em (F-G). Este número foi modificado de K. Kochan et al.¹⁹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A imagem deriva sobre o registro consecutivo de mapas AFM-IR em valores de número de ondas selecionados para a célula S. aureus. (Linha superior): as imagens AFM foram registradas simultaneamente com os mapas AFM-IR correspondentes com base na intensidade do sinal IR em valores de número de ondas selecionados. Os valores do número de ondas (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm^-1) estão anotados acima da linha inferior. Cada conjunto (imagem AFM e mapa AFM-IR) foi gravado logo após a imagem anterior (aproximadamente 40 minutos por conjunto). O tamanho da área imagem/mapeada: 1,54 x 1,57 μm. Uma deriva clara é visível entre as imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A utilidade da espectroscopia de RI para caracterização de uma ampla gama de amostras biológicas no contexto de sua composição química é bem estabelecida. Na última década, a espectroscopia de RI surgiu como uma ferramenta promissora para estudos bacterianos^{12,13,14,15,16,17}. Continua a atrair interesse substancial no campo da microbiologia, como uma das poucas técnicas que permitem uma caracterização fenotípica através da composição química. Nesse contexto, a maior desvantagem da microscopia FTIR convencional está na resolução espacial limitada, prevenindo estudos unicelulares e subcelulares de bactérias. Na verdade, o pequeno tamanho das bactérias representa um impedimento não só para o IR, mas para a grande maioria das técnicas. Assim, as ferramentas de pesquisa disponíveis para estudos unicelulares e subcelulares de bactérias são significativamente limitadas. A combinação de AFM com IR permite que a limitação de resolução espacial da espectroscopia de RI seja superada, fornecendo uma nova ferramenta para a pesquisa bacteriana, capaz de sondar nanoescala da composição química.

A técnica não se limita a estudos de células únicas e permite sondar uma variedade de amostras, variando em espessura. Sem dúvida, a preparação de amostras limpas e cuidadosas é fundamental para alcançar imagens de alta qualidade. O protocolo aqui fornece um método para preparar amostras de multicamadas, monocamadas e/ou células únicas de várias bactérias(Figura 1). A amostra preparada depende de vários fatores, incluindo a carga bacteriana inicial, diluição pós-lavagem, bem como diluição adicional no substrato. A quantidade de amostra obtida após a diluição das pelotas lavadas e antes da deposição no substrato normalmente permite a preparação de inúmeras amostras. Portanto, para obter a distribuição desejada da amostra no substrato, muitas vezes é benéfico preparar uma série de amostras, variando em sua diluição. Para estudos que visam a coleta de espectros AFM-IR em vez de imagens subcelulares, modificar a quantidade de amostra (por exemplo, de monocamada para multicamadas) pode ser benéfico para aumentar a intensidade do sinal.

Outro aspecto crítico na preparação da amostra é a remoção adequada de resíduos médios. Dependendo dos métodos de cultivo de amostra selecionados, a amostra é coletada a partir do meio líquido ou de uma placa de ágar. Em ambos os casos, é provável que o residual médio esteja presente na amostra, embora em menor grau após a coleta de placas de ágar. Como as mídias de crescimento bacteriana contêm uma abundância de vários componentes biológicos, é fundamental garantir a remoção adequada do meio. Recomendamos três lavagens com água ultrauso para amostras de ágar e pelo menos quatro lavagens para amostras coletadas de médio porte. O número de lavagens pode ser aumentado, se necessário; no entanto, para comparação entre várias amostras, é importante mantê-la consistente entre as amostras. O protocolo demonstrado utiliza água, em vez de solventes como solução tampão fosfato (PBS) ou soro fisiológico. Tanto a PBS quanto a solução salina levam à formação de cristais na secagem do ar, o que pode danificar as bactérias. Além disso, ambas são fonte de intensas bandas de IR, com PBS, em particular, contendo múltiplas bandas na região das impressões digitais. A falta de capacidade para o uso de soro fisiológico ou PBS, atualmente representa uma limitação importante para a técnica. Normalmente, o uso de água para lavagem não causa qualquer influência destrutiva sobre as bactérias; no entanto, deve-se tomar cuidado e, se possível, o tempo de exposição à água deve ser limitado. Se o protocolo de preparação da amostra precisar ser pausado na fase de lavagem, recomenda-se deixar a amostra em forma pelletizada após a remoção da água. Isso é de particular importância para as bactérias Gram-negativas, contendo uma parede celular mais fina, pois elas são mais propensas à ruptura.

Para garantir dados AFM-IR adequados e de alta qualidade, vários aspectos do protocolo de coleta de dados são de fundamental importância. Em primeiro lugar, a coleta correta de fundo é essencial para a aquisição de dados. Em particular, é necessária a manutenção dos níveis estáveis de umidade em todo o conjunto de dados, bem como entre o fundo e a coleta de amostras. Para garantir isso, recomendamos a purga do instrumento com nitrogênio e a manutenção dos níveis de umidade não superiores a 25%. A falta de purga pode impor uma limitação significativa, particularmente em locais com alta umidade. Em segundo lugar, destaca-se a importância da otimização adequada das manchas de IR. Para obter melhores resultados, o conhecimento a priori sobre a posição da banda maxima pode ser benéfico. Por exemplo, um espectro de IR convencional de pelotas bacterianas pode ser usado para determinar posições de bandas esperadas a partir de uma amostra. Se isso não for possível adquirir, como abordagem alternativa, o usuário pode utilizar espectros de RI disponíveis na literatura ou iniciar a otimização usando uma posição de banda que é razoável esperar na bactéria (por exemplo, amide I e amide II). Em terceiro lugar, para a coleta de dados, é importante destacar a significância da seleção cuidadosa de energia (permitindo alcançar uma boa relação S/N), pois pode ter um efeito destrutivo. O poder aconselhado depende da espessura da amostra, com orientação áspera disponível no manual do instrumento³¹. Recomendamos testar empiricamente o estado da amostra pós-medição por coleta de uma imagem AFM, pois revelará qualquer influência destrutiva. Além disso, a coleta de imagens AFM da mesma área antes e depois da coleta de espectros AFM-IR serve como uma boa confirmação de que não ocorreu nenhuma deriva e o espectro de fato se origina do ponto selecionado na célula. A possibilidade de deriva é particularmente importante na aplicação da modalidade de imagem, por meio de imagens consecutivas de intensidade de IR em valores de número de ondas selecionados. Um exemplo disso é ilustrado na Figura 5. A área imagem foi definida no início do experimento e deve ser consistente para todos os valores do número de ondas. No entanto, uma deriva clara é visível entre cada imagem de altura AFM (e a intensidade de número de onda ir correspondente), com tempo de aquisição de cada mapa de aproximadamente 40 minutos. Devido a isso, para usuários que coletam dados de imagem, recomendamos sempre selecionar uma área ligeiramente maior que a amostra de interesse, para garantir que, mesmo após a existência de deriva, a amostra de interesse permanecerá dentro da área de imagem.

As limitações potenciais do protocolo incluem a falta de capacidade de coleta de dados em estado hidratado em soluções fisiológicas (por exemplo, soro fisiológico ou PBS) descritas acima. Além disso, especialmente em áreas de alta umidade, muitas vezes há necessidade de expurgo de nitrogênio. Além disso, o protocolo permite sondar organismos até 100 nm de tamanho, excluindo a possibilidade de seu uso para estruturas menores. Embora isso possa ser superado usando um laser diferente (por exemplo, laser em cascata quântica permitindo alcançar a resolução espacial de 20 nm), ele também está associado com alcance espectral limitado, bem como dificuldades em obter uma boa relação sinal-ruído. Finalmente, a sondagem de superfícies macias pode apresentar um desafio com a ponta não detectando a superfície corretamente e procedendo além do ponto de contato, até a quebra. Embora isso normalmente não seja um problema com amostras bacterianas, pode ocorrer após medições de amostras mais suaves. Nesses casos, recomenda-se tentar se engajar na superfície limpa do substrato nas proximidades da amostra.

O protocolo descrito pode ser utilizado para inúmeros tipos de pesquisas bacterianas, incluindo estudos comparativos entre várias amostras, bem como exame subcelular. Os dados podem ser analisados utilizando abordagens quimiómétricas para as modalidades de espectro único e imagem^35,dependendo do objetivo da pesquisa. Além disso, o protocolo também pode ser modificado para aplicação a outros materiais biológicos (como fungos, leveduras, células, etc.), através da adição de fixação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Disco de amostra de metal AFM	PST ProSciTech Pty Ltd	GA530-15	Recomendado 15 mm
Anasys AFM-IR nanoIR2	Anaysys Instrumentos		modelo: nanoIR2
Modo de contato NIR2 Sondas para nanoIR 2	Bruker / Anasys	Instruments-Modelo	: Modelo: PR-EX-NIR2
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge	Thermo Scientific	-	-
Matlab	Mathworks	Inc-Software de	análise de dados multivariados
Tubos de micro-centrífuga, 1.5 mL	Heathrow Scientific	HEA4323	Pode ser substituído por qualquer outro tubo de micro-centrífuga
Instrumento NanoIR 2	Bruker / Anasys Instruments	-	-
Caixa de ferramentas PLS	Mathworks	Inc-GUI	para Matlab
Meio bacteriano selecionado (por exemplo, HBA Columbia Plates)	Thermo Fisher	PP2001	O tipo de meio fornecido é um exemplo e pode ser substituído por outros, dependendo do tipo de experimento
Cepa bacteriana selecionada	-		A fonte depende do objetivo da pesquisa (isolados de pacientes, cepas ATCC, etc.)
Substrato (por exemplo, CaF de grau Raman2)	Crystran	CAFP13-2R	Tamanho recomendado: 13 mm Ø x 2,0 mm
Pipeta de ponta 1000 µ l	Pipeta Axygen	T-1000-B-Tip
200 µ l	Pipeta Axygen	T-200-C-Tip
0.5-10 µ l	Água Axygen	T-300-R-Ultrapura
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