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Artigo de método

Modelo de AVC fototrombótico enriquecido com fibrina e sensível ao tPA

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DOI:

10.3791/61740

4 de junho de 2021

Neste artigo

Resumo

Os modelos tradicionais de AVC fototrombótico (STP) induzem principalmente agregados plaquetários densos de alta resistência ao tratamento lítico com ativador do plasminogênio tecidual (tPA). Aqui um modelo de PTS murino modificado é introduzido pela co-injeção de trombina e corante fotossensível para fotoativação. O modelo de PTS com trombina produz coágulos mistos plaquetas:fibrina e é altamente sensível à trombólise tPA.

Resumo

Um modelo ideal de AVC tromboembólico requer certas propriedades, incluindo procedimentos cirúrgicos relativamente simples com baixa mortalidade, tamanho e localização consistentes do infarto, precipitação de coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina semelhantes aos dos pacientes e sensibilidade adequada ao tratamento fibrinolítico. O modelo de AVC fototrombótico baseado em corante rosa bengala (RB) atende aos dois primeiros requisitos, mas é altamente refratário ao tratamento lítico mediado por tPA, presumivelmente devido à sua composição de coágulo rica em plaquetas, mas pobre em fibrina. Argumentamos que a combinação de corante RB (50 mg/kg) e uma dose subtrombótica de trombina (80 U/kg) para fotoativação visando o ramo proximal da artéria cerebral média (ACM) pode produzir coágulos enriquecidos com fibrina e sensíveis a tPA. De fato, o modelo de fototrombose combinada com trombina e RB (T+RB) desencadeou coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina, como demonstrado por imunomarcação e imunomanchas, e manteve tamanhos e locais de infarto consistentes, além de baixa mortalidade. Além disso, a injeção intravenosa de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dentro de 2 h após a fotoativação diminuiu significativamente o tamanho do infarto na fototrombose T+RB. Assim, o modelo de AVC fototrombótico com trombina pode ser um modelo experimental útil para testar novas terapias trombolíticas.

Introdução

A trombectomia endovascular e a trombólise mediada por tPA são as duas únicas terapias aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA para acidente vascular cerebral isquêmico agudo, que acomete ~700.000 pacientes anualmente nos Estados Unidos1. Como a aplicação da trombectomia é limitada à oclusão de grandes vasos (LVO), enquanto a trombólise tPA pode aliviar as oclusões de pequenos vasos, ambas são terapias valiosas do acidente vascular cerebral isquêmico agudo2. Além disso, a combinação de ambas as terapias (por exemplo, início de trombólise tPA-dentro de 4,5 horas do início do AVC, seguido de trombectomia)....

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Protocolo

Este protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia e segue a Diretriz do National Institutes of Health para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1A descreve a sequência de procedimentos cirúrgicos desse protocolo.

1. Configuração da cirurgia

  1. Colocar uma almofada de aquecimento com temperatura regulada a 37 °C no adaptador de pequenos animais pelo menos 15 minutos antes da cirurgia. Prepare um rolo de clipe nasal para adaptador que permita a rotação da cabeça do animal. Preparar os anestésicos Ketamina (60 mg/kg)/ Xilazina ....

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Resultados

Primeiro, comparamos o conteúdo de fibrina em coágulos sanguíneos induzidos por fototrombose RB versus T+RB. Camundongos foram sacrificados por perfusão transcárdica de fixadores 2 h após a fotoativação, e cérebros foram removidos para coloração por imunofluorescência do ramo da ACM nos planos longitudinal e transversal. Na fototrombose RB, o ramo da ACM estava densamente preenchido com plaquetas CD41+ e pouca fibrina (Figura 2A,C). Em contraste, o ramo da ACM na .......

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Discussão

O tradicional acidente vascular cerebral fototrombótico RB, introduzido em 1985, é um modelo atraente de isquemia cerebral focal para procedimentos cirúrgicos simples, baixa mortalidade e alta reprodutibilidade do infarto cerebral. 5 Nesse modelo, o corante fotodinâmico RB ativa rapidamente as plaquetas à excitação luminosa, levando a agregados densos que ocluem o vaso sanguíneo 5,8,23. No entanto, a pequ.......

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 para C.Y. K.; e NS106592 para Y.Y.S.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)SigmaT8877infarto
4-0 Sutura de monofilamento de nylonLOOK766Bsuprimentos cirúrgicos
5-0 sutura de sedaHarvard Apparatus624143suprimentos cirúrgicos
feixe de laser de 543nmMelles Griot25-LGP-193-249fototrombose
camundongos machos adultosCharles RiverC57BL/610~14 semanas de idade (22~30 g)
Barra de anestesia para oficina mecânica adaptadora de camundongosconfiguração cirúrgicaUVA
Avertin (2, 2, 2-Tribromoetanol)SigmaT48402eutanásia
Broca odontológicaDentamericaRotex 782configuração cirúrgica
Microscópio digitalDino-LiteAM2111imagem cerebral
Dissecação microscópioOlympusSZ40configuração cirúrgica
Fórceps curva fina (serrilhada)FST11370-31instrumento cirúrgico
Fórceps curva fina (lisa)FST11373-12instrumento cirúrgico
cabra anti-coelho Alexa Fluro 488InvitrogenA11008Imuno-histoquímica
Halsted-Mosquito hemostáticosFST13008-12instrumento cirúrgico
Bomba de calor com almofada de aquecimentoGaymarTP700bomba de infusão de configuração cirúrgica
KD Scientific200tratamento trombolítico
Seringa de insulina com agulha 31GBD328291fototrombose
CetaminaCCM, anestesia UVA
Protetor a laser google 532nmThorlabsLG3fototrombose
CetoprofenoCCM, UVAAINE analgesia
micro agulha titularesFST12060-01instrumento cirúrgico
micro tesouraFST15000-03instrumento cirúrgico
MoorFLPI-2 gerador de imagens de fluxo sanguíneoMoor780-nm fonte de laserLaser Speckle Contrast
Imaging Adaptador de mouseRWD68014configuração cirúrgica
Pomada Puralube VetFisherNC0138063prevenção de secura ocular
Dicas afastadorasKent ScientificSurgi-5014-2configuração cirúrgica
Rose BengalSigma198250fototrombose
TrombinaSigmaT7513fototrombose
Cola tecidualAbbott LaboratoriesNC9855218suprimentos cirúrgicos
tPAGenetechCathflo activase 2mgtratamento trombolítico
VibratomeStoelting51425TTC infacrt
XylazineCCM, anestesia UVA
,

Referências

  1. Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
  2. Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
  3. Campbell, B. C., et al.

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Trombina Rose BengalCoágulo Enriquecido com FibrinaModelo Sensível ao tPAArtéria Cerebral MédiaContraste de Speckle LaserMarcação por ImunofluorescênciaMonitoramento do Fluxo Sanguíneo CerebralInjeção Retro-orbitalRamo Proximal da ACM