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Artigo de método

Modelo de AVC fototrombótico enriquecido com fibrina e sensível ao tPA

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DOI:

10.3791/61740

⸱

4 de junho de 2021

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, Taipei Veterans General Hospital, National Yang-Ming University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Os modelos tradicionais de AVC fototrombótico (STP) induzem principalmente agregados plaquetários densos de alta resistência ao tratamento lítico com ativador do plasminogênio tecidual (tPA). Aqui um modelo de PTS murino modificado é introduzido pela co-injeção de trombina e corante fotossensível para fotoativação. O modelo de PTS com trombina produz coágulos mistos plaquetas:fibrina e é altamente sensível à trombólise tPA.

Resumo

Um modelo ideal de AVC tromboembólico requer certas propriedades, incluindo procedimentos cirúrgicos relativamente simples com baixa mortalidade, tamanho e localização consistentes do infarto, precipitação de coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina semelhantes aos dos pacientes e sensibilidade adequada ao tratamento fibrinolítico. O modelo de AVC fototrombótico baseado em corante rosa bengala (RB) atende aos dois primeiros requisitos, mas é altamente refratário ao tratamento lítico mediado por tPA, presumivelmente devido à sua composição de coágulo rica em plaquetas, mas pobre em fibrina. Argumentamos que a combinação de corante RB (50 mg/kg) e uma dose subtrombótica de trombina (80 U/kg) para fotoativação visando o ramo proximal da artéria cerebral média (ACM) pode produzir coágulos enriquecidos com fibrina e sensíveis a tPA. De fato, o modelo de fototrombose combinada com trombina e RB (T+RB) desencadeou coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina, como demonstrado por imunomarcação e imunomanchas, e manteve tamanhos e locais de infarto consistentes, além de baixa mortalidade. Além disso, a injeção intravenosa de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dentro de 2 h após a fotoativação diminuiu significativamente o tamanho do infarto na fototrombose T+RB. Assim, o modelo de AVC fototrombótico com trombina pode ser um modelo experimental útil para testar novas terapias trombolíticas.

Introdução

A trombectomia endovascular e a trombólise mediada por tPA são as duas únicas terapias aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA para acidente vascular cerebral isquêmico agudo, que acomete ~700.000 pacientes anualmente nos Estados Unidos1. Como a aplicação da trombectomia é limitada à oclusão de grandes vasos (LVO), enquanto a trombólise tPA pode aliviar as oclusões de pequenos vasos, ambas são terapias valiosas do acidente vascular cerebral isquêmico agudo2. Além disso, a combinação de ambas as terapias (por exemplo, início de trombólise tPA-dentro de 4,5 horas do início do AVC, seguido de trombectomia) melhora a reperfusão e os resultados funcionais3. Assim, otimizar a trombólise continua sendo um objetivo importante para a pesquisa do AVC, mesmo na era da trombectomia.

Os modelos tromboembólicos são uma ferramenta essencial para a pesquisa pré-clínica de AVC com o objetivo de melhorar as terapias trombolíticas. Isso ocorre porque os modelos de oclusão vascular mecânica (por exemplo, oclusão da ACM por sutura intraluminal) não produzem coágulos sanguíneos, e sua rápida recuperação do fluxo sanguíneo cerebral após a remoção da oclusão mecânica é excessivamente idealizada 4,5. Até o momento, os principais modelos tromboembólicos incluem fototrombose6,7,8, aplicação tópica de cloreto férrico (FeCl3)9, microinjeção de trombina no ramo da ACM 10,11, injeção ex vivo de (micro)êmbolos na ACM ou artéria carótida comum (ACC)12,13,14 e hipóxia-isquemia transitória (tHI)15,16, 17,18. Esses modelos de AVC diferem na composição histológica dos coágulos subsequentes e na sensibilidade às terapias líticas mediadas por tPA (Tabela 1). Eles também variam na necessidade cirúrgica de craniotomia (necessária para injeção in situ de trombina e aplicação tópica de FeCl3), na consistência do tamanho e localização do infarto (por exemplo, a infusão de microêmbolos com CCA produz resultados muito variáveis) e nos efeitos globais sobre o sistema cardiovascular (por exemplo, o tHI aumenta a frequência cardíaca e o débito cardíaco para compensar a vasodilatação periférica induzida por hipóxia).

O modelo de AVC fototrombótico (PTS) baseado em corante RB tem muitas características atraentes, incluindo procedimentos cirúrgicos simples sem craniotomia, baixa mortalidade (tipicamente < 5%) e um tamanho e localização previsíveis do infarto (no território fornecedor de MCA), mas tem duas limitações principais. 8 A primeira ressalva é a resposta fraca a nula ao tratamento trombolítico mediado por tPA, o que também é uma desvantagem do modelo FeCl3 7,19,20. A segunda ressalva dos modelos de PTS e FeCl3 stroke é que os trombos subsequentes consistem em agregados plaquetários densamente embalados com uma pequena quantidade de fibrina, o que não apenas leva à sua resiliência à terapia lítica tPA, mas também se desvia do padrão de trombos mistos de plaquetas:fibrina em pacientes com AVC isquêmicoagudo 21,22. Em contraste, o modelo de microinjeção de trombina-microinjeção in situ compreende principalmente fibrina polimerizada e conteúdo incerto de plaquetas10.

Dado o raciocínio acima, levantamos a hipótese de que a mistura de RB e uma dose subtrombótica de trombina para fotoativação direcionada à MCA através do crânio afinado pode aumentar o componente de fibrina nos trombos resultantes e aumentar a sensibilidade ao tratamento lítico mediado por tPA. Confirmamos essa hipótese23 e descrevemos detalhadamente os procedimentos do modelo fototrombótico de AVC modificado (T+RB).

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Protocolo

Este protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia e segue a Diretriz do National Institutes of Health para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1A descreve a sequência de procedimentos cirúrgicos desse protocolo.

1. Configuração da cirurgia

  1. Colocar uma almofada de aquecimento com temperatura regulada a 37 °C no adaptador de pequenos animais pelo menos 15 minutos antes da cirurgia. Prepare um rolo de clipe nasal para adaptador que permita a rotação da cabeça do animal. Preparar os anestésicos Ketamina (60 mg/kg)/ Xilazina (10 mg/kg).
  2. Esterilizar as ferramentas cirúrgicas incluindo tesouras, pinças, porta-microagulhas, hemostáticos, cotonetes e suturas com autoclave (121 °C a 15 psi por 60 min). Prepare cola de tecido e pomada para os olhos. Prepare o óculos de proteção a laser de 532 nm para cirurgiões.
    NOTA: Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico de sobrevida importante e deve ser conduzido usando técnicas assépticas.
  3. Configure o sistema de iluminação com uma fonte laser de 532 nm. Prepare uma broca odontológica.
  4. Preparar a solução de Rosa Bengala em solução salina (10 mg/mL). Coloque uma alíquota de trombina bovina (0,1 U/μL) no balde de gelo.
  5. Injetar cetoprofeno (4,0 mg/kg) por via subcutânea no camundongo como analgesia 30 min antes da cirurgia ou utilizar o esquema analgésico recomendado pelas diretrizes institucionais locais.

2. Ligadura da artéria carótida comum ipsilateral

  1. Anestesiar camundongos machos C57BL/6NCrl de 10-14 semanas de idade, pesando 22 a 30 g, por injeção intramuscular de Ketamina (60 mg/kg) e Xilazina (10 mg/kg).
    NOTA: Todo o procedimento cirúrgico, englobando a ligadura da artéria carótida comum ipsilateral através da monitorização do fluxo sanguíneo cerebral, deverá levar ~120 min. O regime anestésico será tipicamente eficaz durante toda essa duração, mas a profundidade anestésica deve ser reavaliada pelo menos a cada 15 min. Ao aprender esses procedimentos, pode ser necessário redosar a anestesia.
  2. Realize uma pinça dos dedos dos pés para garantir que o animal esteja totalmente anestesiado. Remova os pelos do pescoço esquerdo para a ligadura CCA e a cabeça para o afinamento do crânio com o creme de depilação.
  3. Coloque o rato sobre o adaptador de pequenos animais na posição supina. Esterilizar a área cirúrgica limpando a pele com três toques alternados de iodopovidona e etanol 70%.
  4. Fixe a cabeça do mouse usando barras auriculares. Sob um microscópio dissecante, fazer uma incisão cervical-esquerda de 0,5 cm usando uma microtesoura e pinça reta a cerca de 0,2 cm lateral à linha média.
  5. Use um par de pinças finas serrilhadas para afastar o tecido mole e a fáscia para expor a artéria carótida comum esquerda (ACCE). Separe cuidadosamente a ACC esquerda do nervo vago usando um par de pinças finas e lisas.
  6. Coloque uma sutura permanente de duplo nó ao redor da ACE com fio de seda 5-0 cortado em segmentos de 20 mm e, em seguida, feche a ferida com clipes estéreis da ferida.

3. Afinamento do crânio acima do ramo da ACM e fotoativação

  1. Vire o mouse para a posição prona no adaptador de animais pequenos. Gire o rolo do clipe nasal por 15°. Esterilizar a área cirúrgica limpando a pele com três toques alternados de betadina e etanol 70%.
  2. Realizar incisão de 0,8 cm no couro cabeludo com uma microtesoura e pinça reta ao longo do olho esquerdo e orelha para expor o músculo temporal, que está localizado entre o olho e a orelha (Figura 1B).
  3. Sob o microscópio dissecante, fazer uma incisão de 0,5 cm ao longo da borda do músculo temporal no osso parietal esquerdo por um par de pinças finas serrilhadas. Fazer uma segunda incisão vertical de 0,3 cm no músculo temporal por uma microtesoura. Retrair o músculo temporal para expor a borda do osso parietal e do osso escamoso. Certifique-se de visualizar o ponto de sutura coronal entre os ossos frontal e parietal (Figura 1B,C).
  4. Umedecer o crânio aplicando soro fisiológico estéril para revelar a ACM esquerda. Marque o ramo proximal da ACM no osso escamoso com caneta marcadora. Desenhe suavemente um círculo de cerca de 1 mm de diâmetro ao redor da área marcada com a broca dentária pneumática (ajuste de velocidade da rebarba a 50% do controlador de velocidade) e, em seguida, afione o crânio com cerca de 0,2 mm de profundidade sem tocar na dura-máter inferior. Pare a perfuração até que uma camada muito fina de osso seja deixada.
  5. Misturar a solução de trombina (T, 0,1 U/μL, 80 U/kg) e Rosa bengala (RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) com base no peso corporal do rato. Por exemplo, para um camundongo de 25 g de peso corporal, misture 20 μL de trombina (0,1 U/μL) e 125 μL de RB (10 mg/mL).
  6. Injetar lentamente solução de T+RB (145 μL por 25 g de peso corporal) no seio retro-orbital com uma seringa de insulina (agulha #31G).
    NOTA: Em experimentos piloto, a taxa de mortalidade de doses crescentes de trombina misturada com a dose padrão de corante RB (50 mg/kg) foi examinada para fotoativação. A mortalidade foi de 0% para 80 U/kg de trombina (n=13), 43% para 120 U/kg de trombina (n=7) e 100% para 160 U/kg (n=5) e 200 U/kg de trombina (n=5). Optou-se, portanto, pela dose de 80 U/kg de trombina. A imagem por contracção speckle laser também foi utilizada para excluir a possibilidade de coagulação sanguínea desenfreada próxima à cavidade orbitária após injeção de T+RB no seio retro-orbital (Figura 1 Suplementar), bem como deposição disseminada de fibrina no hemisfério contralateral que não foi submetida à iluminação a laser (Figura 2 Suplementar).
  7. Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento.
  8. Aplique o iluminador com uma luz laser de 532 nm (com energia de 0,5 mW) no local perfurado com distância de 2 polegadas por 20 min. Visualize a iluminação no ramo proximal da ACM através de um óculos de proteção a laser (Figura 1C,D).
    NOTA: O MCA com iluminação de 532 nm mostra fluorescência vermelha sob o óculos. A ACM distal desaparecerá após 10 min de iluminação. Excluir o animal se o fluxo distal da ACM ainda estiver presente após 20 min de iluminação.
  9. Pare a iluminação a laser após 20 min. Feche a ferida com clipes estéreis da ferida.

4. Imagem intravital (opcional)

OBS: Para caracterizar a formação de trombo in vivo, utilizar imagem intraviral por spin-disk confocal com sistema de fotoativação23.

  1. Faça uma janela craniana de ~3 mm de diâmetro no osso parietal do crânio.
  2. Coloque uma tampa na janela craniana e localize a ACM distal (~50 μm de diâmetro) sob uma objetiva de imersão em água de 20x.
  3. Rotular a plaqueta circulante por injeção na veia caudal do anticorpo anti-GPIbβ conjugado com DyLight488 (0,1 mg/kg) 5 minutos antes da aquisição de imagens.
  4. Injetar a solução da mistura de trombina (80 U/kg) e Rosa bengala (50 mg/kg) por via retro-orbital 5 minutos antes da aquisição de imagens.
  5. Fotoative a ACM utilizando um sistema de laser de 561 nm com feixe de laser de 10 μm de diâmetro e registre a imagem até a formação do trombo.

5. Administração de tPA

  1. Coloque o animal anestesiado em uma almofada quente a 37 °C. No ponto de tempo pós-fotoativação selecionado, molhe uma gaze com ~45 °C de água morna e envolva-a na cauda por 1 min.
  2. Injetar tPA humano recombinante (10 mg/kg) através da veia caudal com um bolus de 50% e 50% durante 30 minutos por bomba de infusão.
    NOTA: Embora a dose clínica de tPA humano recombinante para o tratamento de AVC isquêmico agudo seja de 0,9 mg/kg, uma dose mais alta (10 mg/kg) é comumente usada em roedores para compensar a redução da reatividade de tPA entre espécies. Também seguimos o protocolo padrão de administração de tPA em modelos pré-clínicos de AVC, utilizando 50% como bolus e 50% infundidos através da veia caudal ao longo de 30 min.24

6. Monitor do fluxo sanguíneo cerebral (FSC)

NOTA: Para confirmar a recuperação do FSC após o tratamento com tPA, use um sistema de imagem bidimensional com contraste specklea laser 15 e registre imediatamente após a fototrombose (passo 3.9) ou 24 h após o tratamento com tPA.

  1. Coloque o animal anestesiado em decúbito ventral e faça uma incisão mediana no couro cabeludo com o crânio exposto.
  2. Hidrate o crânio com soro fisiológico estéril e aplique suavemente o gel de ultrassom no crânio. Evite pelos e bolhas no gel, que vão interferir no sinal da CBF.
  3. Monitorar o FSC em ambos os hemisférios cerebrais sob imageador de contraste speckle laser por 10 min.
  4. Após o registro da imagem da FBC, feche o couro cabeludo com cola de tecido e devolva o animal à gaiola.
  5. Analisar a FBC nas regiões selecionadas e calcular o percentual de recuperação da FBC em relação à região contralateral.
  6. Em seguida, coloque o animal de volta em uma gaiola quente para recuperação. Monitore os camundongos por 5-10 minutos até que eles se recuperem da anestesia. Coloque o alimento molhado na gaiola e devolva-o ao centro de cuidados com os animais.
    OBS: Proporcionar analgesia pós-operatória conforme preconizado pelas diretrizes institucionais locais.

7. Medida do volume de infarto pela coloração com cloreto de trifenil tetrazólio (TTC)

  1. Vinte e quatro horas após a fototrombose, anestesiar profundamente o animal de acordo com as diretrizes institucionais locais para cirurgia de não sobrevivência.
    NOTA: Administramos tribromoetanol (avertin) 250 mg/kg por injeção intraperitoneal (IP).
  2. Realizar perfusão transcárdica com PBS, coletar cérebro fresco e embutir em gel de ágar 3%.
  3. Seccionar o corte cerebral com 1 mm de espessura por vibratomo e incubar em solução TTC a 2% por 10 min.
  4. Quantifique o volume total de infarto de 6 fatias cerebrais como volume absoluto pelo software ImageJ.
    OBS: O edema cerebral não foi utilizado como medida de desfecho por dois motivos. Primeiro, a coloração TTC mede a viabilidade tecidual (via atividade redutora mitocondrial), que é uma consequência mais grave do que o edema. Em segundo lugar, à medida que o infarto prossegue, tanto o edema vasogênico quanto o citotóxico ocorrem e não podem ser facilmente distinguidos pelos métodos padrão de medição do edema cerebral. No entanto, usamos a marcação antiimunoglobina (IgG) para avaliar a integridade da barreira hematoencefálica (BHE) e encontramos extravasamento de IgG comparável 6 h após a fotoativação em ambos os modelos de AVC RB e T+RB (Figura 3 suplementar).

8. Medição da formação do trombo

OBS: Para medir a formação do trombo, coletar o cérebro em 1 h e 2 h após a fototrombose para a medida do trombo na ACM por imunoquímica (IHQ) e para a dosagem de fibrina no hemisfério cerebral por imunoblot, respectivamente.

  1. Realizar o IHQ para a caracterização da composição do coágulo. Fixe o cérebro com paraformaldeído a 4% durante a noite e, em seguida, desidrate o cérebro com 30% de sacarose para a incorporação da OCT.
  2. Seccionar o cérebro com orientação sagital em 20 μm de espessura e realizar a IHQ com anticorpos específicos contra fibrinogênio, plaquetas (glicoproteína IIb), hemácias (TER119) e vasos sanguíneos (isomectina GS-IB4).
  3. Realizar a medição de fibrina no hemisfério cerebral por immunoblot com um anticorpo contra fibrinogênio.

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Resultados

Primeiro, comparamos o conteúdo de fibrina em coágulos sanguíneos induzidos por fototrombose RB versus T+RB. Camundongos foram sacrificados por perfusão transcárdica de fixadores 2 h após a fotoativação, e cérebros foram removidos para coloração por imunofluorescência do ramo da ACM nos planos longitudinal e transversal. Na fototrombose RB, o ramo da ACM estava densamente preenchido com plaquetas CD41+ e pouca fibrina (Figura 2A,C). Em contraste, o ramo da ACM na ...

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Discussão

O tradicional acidente vascular cerebral fototrombótico RB, introduzido em 1985, é um modelo atraente de isquemia cerebral focal para procedimentos cirúrgicos simples, baixa mortalidade e alta reprodutibilidade do infarto cerebral. 5 Nesse modelo, o corante fotodinâmico RB ativa rapidamente as plaquetas à excitação luminosa, levando a agregados densos que ocluem o vaso sanguíneo 5,8,23. No entanto, a pequ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 para C.Y. K.; e NS106592 para Y.Y.S.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)SigmaT8877infarto
4-0 Sutura de monofilamento de nylonLOOK766Bsuprimentos cirúrgicos
5-0 sutura de sedaHarvard Apparatus624143suprimentos cirúrgicos
feixe de laser de 543nmMelles Griot25-LGP-193-249fototrombose
camundongos machos adultosCharles RiverC57BL/610~14 semanas de idade (22~30 g)
Barra de anestesia para oficina mecânica adaptadora de camundongosconfiguração cirúrgicaUVA
Avertin (2, 2, 2-Tribromoetanol)SigmaT48402eutanásia
Broca odontológicaDentamericaRotex 782configuração cirúrgica
Microscópio digitalDino-LiteAM2111imagem cerebral
Dissecação microscópioOlympusSZ40configuração cirúrgica
Fórceps curva fina (serrilhada)FST11370-31instrumento cirúrgico
Fórceps curva fina (lisa)FST11373-12instrumento cirúrgico
cabra anti-coelho Alexa Fluro 488InvitrogenA11008Imuno-histoquímica
Halsted-Mosquito hemostáticosFST13008-12instrumento cirúrgico
Bomba de calor com almofada de aquecimentoGaymarTP700bomba de infusão de configuração cirúrgica
KD Scientific200tratamento trombolítico
Seringa de insulina com agulha 31GBD328291fototrombose
CetaminaCCM, anestesia UVA
Protetor a laser google 532nmThorlabsLG3fototrombose
CetoprofenoCCM, UVAAINE analgesia
micro agulha titularesFST12060-01instrumento cirúrgico
micro tesouraFST15000-03instrumento cirúrgico
MoorFLPI-2 gerador de imagens de fluxo sanguíneoMoor780-nm fonte de laserLaser Speckle Contrast
Imaging Adaptador de mouseRWD68014configuração cirúrgica
Pomada Puralube VetFisherNC0138063prevenção de secura ocular
Dicas afastadorasKent ScientificSurgi-5014-2configuração cirúrgica
Rose BengalSigma198250fototrombose
TrombinaSigmaT7513fototrombose
Cola tecidualAbbott LaboratoriesNC9855218suprimentos cirúrgicos
tPAGenetechCathflo activase 2mgtratamento trombolítico
VibratomeStoelting51425TTC infacrt
XylazineCCM, anestesia UVA
,

Referências

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