Artigo de método

Visualizando a Interiorização Imunoreativa Do Peptídeo Relacionado ao Gene calcitonina do Rato Cranial Dura Mater com Imunofluorescência e Rastreamento Neural

DOI:

10.3791/61742

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6 de janeiro de 2021

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui apresentamos um protocolo para visualizar a correlação espacial do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras nervosas imunoreativas e vasos sanguíneos na duracolia craniana usando imunofluorescência e histoquímica fluorescente com CGRP e fábulina, respectivamente. Além disso, a origem dessas fibras nervosas foi retrógrada traçada com um rastreador neural fluorescente.

Resumo

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O objetivo deste estudo foi examinar a distribuição e a origem do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras sensoriais imunoreativas do duracococa craniano utilizando imunofluorescência, reconstrução tridimensional (3D) e técnica de rastreamento retrógrado. Aqui, as fibras nervosas e vasos sanguíneos foram manchados usando imunofluorescência e técnicas histoquímicas com CGRP e fábula fluorescente, respectivamente. A correlação espacial das fibras nervosas e vasos nervosos transmotivos cgrp-immuoreactive dural e vasos sanguíneos foram demonstradas pela reconstrução 3D. Enquanto isso, a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP foram detectadas pela técnica de rastreamento neural com fluorogold (FG) da área ao redor da artéria meningeal média (MMA) na duracaca craniana mater à gânglio triginal (TG) e gânglios de raiz dorsal cervical (C) (DRGs). Além disso, as características químicas dos neurônios rotulados por FG nos TG e DRGs também foram examinadas juntamente com CGRP utilizando imunofluorescências duplas. Aproveitando a amostra transparente de montagem integral e a reconstrução 3D, mostrou-se que as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias rotuladas por fálico funcionam juntas ou formando separadamente uma rede neurovascular dural em uma visão 3D, enquanto os neurônios rotulados por FG foram encontrados nos ramos oftálmico, maxilar e mandibular de TG, bem como os IPS C2-3 ao lado da aplicação do rastreador em que alguns dos neurônios rotulados por FG apresentavam expressão CGRP-imunoreactive. Com essas abordagens, demonstramos as características distributivas das fibras nervosas cgrp-imunoreativas ao redor dos vasos sanguíneos na dura-duracaca craniana, bem como a origem dessas fibras nervosas de TG e DRGs. Do ponto de vista da metodologia, pode fornecer uma referência valiosa para a compreensão da complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana sob a condição fisiológica ou patológica.

Introdução

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A dura-máter craniana é a camada mais externa de meninges para proteger o cérebro e contém vasos sanguíneos abundantes e diferentes tipos de fibras nervosas1,2. Muitos estudos têm demonstrado que a dura-dura-maternidade craniana sensibilizada pode ser o fator-chave que leva à ocorrência de dores de cabeça, envolvendo a vasodilatação anormal e a inervação3,4,5. Assim, o conhecimento da estrutura neurovascular na dura-escola craniana é importante para a compreensão da patogênese das dores de cabeça, especialmente para a....

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Protocolo

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-09-29-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados neste estudo 12 ratos machos adultos Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Os animais [número de licença SCXK (JING) 2017-0005] foram fornecidos pelos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Drogas.

1. Innervation of rat cranial dura mater

  1. Perfusões
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Resultados

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Estrutura neurovascular da dura mater craniana
Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias dural e tecidos conjuntivos foram claramente demonstradas em toda a duraza mater de todo o monte em um padrão 3D(Figura 2C, D,E,F). Mostrou-se que tanto as fibras nervosas espessas quanto as finas CGRP-imunoreactive funcionam em paralelo às a.......

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Discussão

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Neste estudo, demonstramos com sucesso a distribuição e a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP no dura-pena craniano usando imunofluorescência, reconstrução 3D e abordagens de rastreamento neural com anticorpo CGRP e rastreador neural FG, fornecendo as evidências histológicas e químicas para entender melhor a rede neurovascular dural.

Como era conhecido, o CGRP desempenha um papel crítico na patogênese da enxaqueca4,17. Mostro.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pelo projeto do Programa Nacional de P&D da China (Project Code nº 2019YFC1709103; nº 2018YFC1707804) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Código de Projeto nº 81774211; nº 81774432; nº 81801561).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 488 burro anti-rato IgG (H+L)Invitrogen por Thermo Fisher ScientificA21202Proteger da luz; RRID: AB_141607
Instrumento de estereotaxia cerebralNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersão 1.1Software do microscópio fluorescente
Sistema de imagem confocalOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Proteger da luz
Sistema de imagem fluorescenteOlympusBX53
Micrótomo de congelamentoThermoMicrom International 
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersão 4.2Sistema de software de processamento de imagem confocal
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Soro de burro normalJackson ImmunoResearch017-000-121
Faloidina 568Molecular& nbsp; SondasA12380Protegem da luz
Photoshop e  IlustraçãoAdobeCS6Software de edição de fotos
Coelho anti-fluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost mais lâminas de microscópioThermo#4951PLUS-00125x75x1mm
GmbH

Referências

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  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-9....

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Colora o por Imunofluoresc nciaT cnica de Rastreamento NeuralMarca o Retr grada com FluorogoldImagem por Microscopia ConfocalG nglio Trig meoG nglios da Raiz Dorsal CervicalReconstru o 3DPrepara o de Montagem Integral

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