As alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme de Pseudomonas aeruginosa diferem entre os isolados clínicos cultivados de pacientes com fibrose cística e infecção pulmonar crônica. Após a microscopia confocal, o software COMSTAT pode ser utilizado para quantificar variações na arquitetura do biofilme (por exemplo, área de superfície, espessura, biomassa) para isolados individuais para avaliar a eficácia de agentes anti-infecciosos.
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Artigo de método
Quantificando os efeitos dos antimicrobianos na arquitetura de biofilme in vitro usando o software COMSTAT
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os biofilmes são agregados de microrganismos que dependem de uma matriz autoproduzida de substância polimérica extracelular para proteção e integridade estrutural. O patógeno nosocomial, Pseudomonas aeruginosa, é conhecido por adotar um modo de crescimento de biofilme, causando infecção pulmonar crônica em pacientes com fibrose cística (FC). O programa de computador, COMSTAT, é uma ferramenta útil para quantificar as mudanças induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme de P. aeruginosa , extraindo dados de imagens confocais tridimensionais. No entanto, a operação padronizada do software é menos comumente abordada, o que é importante para o relatório ideal do comportamento do biofilme e comparação entre centros. Assim, o objetivo deste protocolo é fornecer uma estrutura simples e reprodutível para quantificar estruturas de biofilme in vitro sob diferentes condições antimicrobianas via COMSTAT. A técnica é modelada usando um isolado de CF P. aeruginosa , cultivado na forma de réplicas de biofilme e exposto à tobramicina e ao anticorpo monoclonal anti-Psl, Psl0096. A abordagem passo a passo visa reduzir a ambiguidade do usuário e minimizar a chance de ignorar etapas cruciais de processamento de imagem. Especificamente, o protocolo enfatiza a eliminação de variações subjetivas associadas à operação manual do COMSTAT, incluindo segmentação de imagem e a seleção de funções de análise quantitativa apropriadas. Embora esse método exija que os usuários gastem mais tempo processando imagens confocais antes de executar o COMSTAT, ele ajuda a minimizar a heterogeneidade de biofilme deturpada em saídas automatizadas.
Introdução
Os biofilmes são agregados de microrganismos orientados em uma matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) autoproduzidas. A matriz EPS é muito complexa, consistindo principalmente de células bacterianas, água, proteínas, polissacarídeos, lipídios e ácidos nucléicos1, todos os quais tornam os biofilmes distintamente diferentes das células planctônicas de vida livre. Os EPS de biofilme são aderentes uns aos outros e a várias superfícies. A matriz EPS possui propriedades que medeiam a troca célula a célula de metabólitos, material genético e compostos usados para sinalização e defesa intercelular2. Essas proprie....
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Protocolo
1. Coleta de isolados bacterianos
- Obtenha isolados de P. aeruginosa de uma coorte de pacientes pediátricos com FC submetidos a tratamento de erradicação com tobramicina inalada no SickKids (Toronto). Congelar isolados a -80 °C em citrato de glicerol e subcultura pelo menos três vezes antes da utilização.
2. Formação de biofilme in vitro
NOTA: Use um método de lamínula com câmara1 para formação de biofilme in vitro com modificações. O fluxo de trabalho geral desse modelo é mostrado na Figura 1.
- Culti....
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Resultados
Um isolado de P. aeruginosa cultivado de um paciente infectado com FC é usado para demonstrar os pontos fortes dessa abordagem na quantificação precisa das alterações induzidas por antimicrobianos na arquitetura do biofilme in vitro . O fluxo de trabalho geral desse modelo é representado na Figura 1. O procedimento de processamento de imagem e análise COMSTAT no ImageJ é mostrado na Figura 2. Uma abordagem simples de limite de histograma para s.......
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Discussão
Não existe um método prescrito para comparar quantitativamente imagens tridimensionais de estruturas de biofilme in vitro , e os procedimentos descritos neste contexto são muitas vezes difíceis de padronizar devido à variabilidade interoperadora20. Assim, este protocolo oferece uma estrutura simples e reprodutível para aplicações COMSTAT que buscam quantificar mudanças na arquitetura do biofilme in vitro sob diferentes condições antimicrobianas. Os pontos fortes desta técnica são.......
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Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à Cystic Fibrosis Foundation por fornecer financiamento para esta pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-Psl mAb, Psl0096 | Ágar Sangue Medimune | ||
| (TSA com 5% de Sangue de Ovelha) Médio | Fisher Scientific | R01200 | |
| Tampa de Vidro com Câmara de Oito Poços com Poços Não Removíveis | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| Invitrogen SYTO 9 Mancha de Ácido Nucleico Verde Fluorescente | Thermo Fisher Scientific | S34854 | |
| LB BROTH (LENNOX), Esterilizado em Autoclave Líquida | BioShop Canada | LBL666 | |
| Tobramicina, 900 µ g/mg | Alfa Aesar da Thermo Fisher Scientific | J66040 | Recomenda-se realizar um teste de concentração inibitória mínima (CIM) para cada lote feito para garantir o controle de qualidade da potência antimicrobiana |
| Quorum Volocity 6.3 | Quorum Technologies | Software de análise de imagem |
Referências
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Rybtke, M., Hultqvist, L. D., Givskov, M., Tolker-Nielsen....
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Reimpressões e permissões
