Uma complexa tarefa de mergulho por comida para investigar organização social e interações em ratos

Os ratos são animais altamente sociais, tornando-os um modelo ideal para entender o comportamento social e como ele se relaciona com a tomada de decisões. Os ratos se dividem em grupos hierárquicos baseados em relações dominantes e submissas. Os ratos podem ser treinados para tarefas que expressam cooperação, gerenciamento de riscos, comportamento enganoso e comportamentos que mudam dependendo das decisões de outros ratos^1,2. Estudos com modelos de ratos expressando esses comportamentos se mostram úteis na compreensão da estrutura social e sua relação com a tomada de decisão com relevância para a psicologia humana.

Como recurso necessário, o acesso aos alimentos é uma das principais razões para a organização social entre os ratos³. Ratos ingênuos têm sido observados engajando-se na interação social e diferenciação em situações em que o acesso à alimentação foi limitado^{1,2,4,5,6,7,8}. Em um estudo, ratos adultos foram obrigados a atravessar um túnel debaixo d'água para acessar a comida e, em seguida, trazer a comida de volta através do túnel para a gaiola⁹. Os ratos individuais de cada grupo puderam ser categorizados de acordo com seu método de obtenção de alimentos. Dois perfis comportamentais surgiram: os primeiros são os "portadores", que mergulham e nadam debaixo d'água até o alimentador, obtêm uma pelota e seguram a pelota em sua boca enquanto nadam de volta para a gaiola. O segundo grupo são os "não transportadores", que não mergulham e obtêm alimentos apenas roubando dos transportadores. Em grupos de seis ratos, aproximadamente metade eram portadores e a outra metade não era⁹. Todos os ratos foram observados como portadores quando foram treinados individualmente no aparelho de mergulho¹⁰.

Tarefas comportamentais animais semelhantes envolvem competição por comida ou espaço e foram empregadas com galinhas¹¹, roedores^12,13,14,15e suínos¹⁶. No teste do tubo, dois ratos são enviados através de um tubo estreito de extremidades opostas, com um rato necessariamente cedendo direito de caminho para o outro. Este teste auxilia na medição da dominação social^17,18,19. Um teste comportamental chamado de teste de ponto quente tem ratos competindo por uma posição em um pequeno ponto quente em uma gaiola fria de outra forma^19,20.

Uma tarefa subsequente de mergulho por alimento mais complexa permite que ratos portadores tenham acesso a uma segunda gaiola, longe de não portadores, onde poderiam consumir seus alimentos separadamente⁴. Neste protocolo, apresentamos uma tarefa de mergulho por comida como modelo alternativo para a hierarquia social e o comportamento em ratos. Esta tarefa de mergulho por comida fornece um método para os ratos evitarem os grupos sociais da gaiola principal e, portanto, escaparem da agressão e das interações sociais de outros ratos. Essa tarefa introduz a opção de comportamento social evitado em ratos que possam elucidar nossa compreensão da agressão social.

O funcionamento social, que descreve a capacidade de se envolver em papéis sociais normais, pode ser afetado por condições como a depressão³. Indivíduos deprimidos muitas vezes lutam contra o desemprego, têm poucos contatos sociais e dificilmente se envolvem em atividades de lazer³. O tratamento eficaz da depressão é frequentemente medido pela melhoria da função social e interpessoal²¹. Os tratamentos antidepressivos, no entanto, variam em sua eficácia no tratamento de deficiências no funcionamento social relacionadas à depressão³.

Nesta metodologia, induzimos uma condição depressiva em ratos através do teste de Estresse Crônico e avaliamos o nível de anedonia dos ratos, uma das características de um estado semelhante à depressão, com um teste de preferência de sacarose. Ratos anedônicos, bem como ratos anedônicos que eram administrados antidepressivos, foram monitorados através da tarefa de mergulho por alimento em comparação com um grupo controle.

As tarefas de mergulho por alimentos mencionadas anteriormente se assemelham a testes de competição alimentar que muitas vezes usam apenas um par de animais ou uma dicotomia como ponto de comparação, como portadores e não portadores e uma única análise que compara a submissão ao domínio^15,17,22. Nosso método define interações mais complexas entre ratos através de divisões em múltiplos tipos de comportamento, incluindo: portadores e não portadores, aqueles que lutam por comida e aqueles que não o fazem, e ratos que compartilham alimentos ou vão para gaiolas separadas. Acreditamos que este protocolo é o único tipo que utiliza uma hierarquia para avaliar uma complexa estrutura de interação social em um grupo de animais, e não em pares. Será útil para estudos que testam a dominância com base na preferência alimentar, bem como estudos que visam esclarecer relações mais hierárquicas que não se limitam a um modelo dominante-submisso.

Neste protocolo, descrevemos detalhadamente a complexa tarefa de mergulho por alimento para investigar a organização social e as interações em ratos com mudanças no comportamento individual, particularmente após o desenvolvimento da anedonia. Esse modelo animal também pode ser utilizado para estudar outras condições psiquiátricas associadas a mudanças no comportamento social e na hierarquia.

Os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações das Declarações de Helsinque e Tóquio e as Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev. O código de autorização para este experimento era IL-55-8-12.

1. Preparação de ratos

1. Obter aprovação para experimentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
2. Selecione ratos adultos Deseca. Exclua animais que apresentam traços físicos anormais, como convulsões ou outros déficits motores.
   NOTA: Para este protocolo, usamos ratos machos adultos, pesando 300-350 g, com idade entre 4 e 8 meses. Ratos fêmeas também podem ser usados.
3. Mantenha os ratos à temperatura ambiente (22 °C ± 1 °C), com 12 h de luz e ciclos escuros de 12h. Fornecer comida de rato e ad libitum de água. Casa 3 ratos por gaiola.
   NOTA: Todos os ratos alojados na mesma gaiola devem estar no mesmo grupo experimental.
4. Aleatoriamente coloque 120 ratos em um dos três grupos experimentais. Use o Grupo 1 (n=60) w como um grupo de controle. Induzir o grupo experimental, Grupo 2 (n=30), com estressores conforme detalhado abaixo. Induzir o Grupo 3, o grupo experimental com tratamento (n=30), com anedonia e posteriormente administrar tratamento antidepressivo. O cronograma para o protocolo experimental pode ser encontrado na Figura 1.
5. Marque ratos com canetas coloridas no início do experimento para permitir a identificação individual.
6. Realize todos os experimentos entre 6:00.m e 12:00.m.
7. Pesar ratos diariamente durante todo o procedimento para possível perda de peso. A perda de peso acima de 20% excluirá os ratos do estudo. Veja a seção 3.1.3.

2. Indução de anedonia em ratos

1. Modelo de estresse imprevisível crônico
   1. Induzir ratos do grupo experimental e do grupo experimental com tratamento com características de um estado depressivo pelo modelo de Estresse Imprevisível Crônico, como previamente detalhado²³.
2. Modelo de estresse imprevisível crônico
   1. Induzir ratos dos dois grupos experimentais com comportamentos depressivos pelo modelo de estresse imprevisível crônico, como previamente detalhado²³.
      NOTA: Os ratos são expostos a 2 dos 7 estressores diariamente em uma ordem aleatória; um durante o dia e o segundo à noite durante 5 semanas^24,25.
   2. Introduza os seguintes estressores em ordem aleatória:
      1. Ratos domésticos com 6 animais por gaiola em vez de 3 por 18 h.
      2. Inclinar a posição da gaiola 45° ao longo do eixo vertical por 3 h.
      3. Privar animais de comida por 18 h.
      4. Privar os animais de água por 18h e, em seguida, introduzir uma garrafa de água vazia.
      5. Mantenha uma gaiola suja por 8h com 300 mL de água derramada na cama.
      6. Mantenha a iluminação contínua e inverta o ciclo claro/escuro por 48 horas semanais.
      7. Aqueça o ambiente a 40 °C por 5 min.
   3. Confirme o desenvolvimento da anedonia, uma das características de um estado semelhante à depressão, realizando um teste de preferência de sacarose. Veja a seção 4.
3. Terapia anti-depressão
   1. Administre 20 mg/kg de cloridrato de imipramina (antidepressivo tricíclico) intraperitoneal uma vez por dia durante 3 semanas aos ratos do grupo experimental^26,27,28.
      NOTA: Um subgrudo (n=3 em cada conjunto de ratos) do grupo experimental é administrado 0,9% de soro fisiológico (placebo) intraperitoneal uma vez por dia para a duração de 3 semanas, no mesmo volume do grupo de tratamento antidepressivo.

3. O teste de organização social (tarefa complexa de mergulho por alimentos)

NOTA: O aparelho experimental foi descrito em estudos anteriores^9,29,30 com pequenas modificações. Todas as partes do aparelho devem ser compostas de plexiglass transparente.

1. Prepare aparelhos e aclimate ratos.
   1. Conecte duas gaiolas (50 cm x 50 cm x 50 cm) a um aquário (130 cm x 35 cm x 50 cm) através de túneis (45 cm x 15 cm x 15 cm)(Figura 2). Certifique-se de que não há acesso de uma gaiola a outra sem mergulhar no aquário²⁵. Mantenha a temperatura da água a 25 °C.
   2. Coloque tubos com pelotas de alimentos (uma pelota de alimento em cada tubo) em uma extremidade do aquário.
      NOTA: A redução da acessibilidade das pelotas de alimentos na gaiola de partida deve incentivar gradualmente o rato, que de outra forma desenvolveria o hábito de roubar, a mergulhar para chegar ao alimento.
   3. No primeiro dia do experimento, introduza cada grupo de 6 ratos em aparelhos experimentais sem água para sessões de 3 horas. Retorne os ratos à gaiola padrão após a sessão.
      1. Restringir o acesso de alimentos de ratos às sessões de 3 horas, sem outro acesso à comida durante o resto do dia.
      2. Remova ratos que perderam mais de 20% de seu peso base do experimento junto com seu grupo social, e dê comida e água ad libitum.
      3. Toalha manualmente de ratos secos ou fornecer acesso a uma fonte de calor até secar e antes de colocá-los de volta em sua carcaça regular para evitar hipotermia.
      4. Repita essas sessões para os dias 2-3.
         NOTA: Gravar ratos de vídeo no aparelho continuamente durante sessões de 3 horas. Certifique-se de que a câmera está configurada como de alta definição (720p) e o foco automático está desligado.
2. Realizar tarefa de mergulho por comida
   1. Nos dias 4-17, adicione água progressivamente até que o nível máximo de água seja atingido, como descrito anteriormente⁴. Nos dias 17-21, mantenha o nível máximo de água.
   2. Observe ratos mergulhando para acesso à pelota.
   3. Regissos parâmetros a seguir para cada rato:
      1. Avalie a frequência de entrada no túnel.
      2. Conte cada tentativa de mergulhar para comer.
         NOTA: A viagem da gaiola para o aquário de volta para uma gaiola não deve exceder de 5-6 segundos, o que garantirá que a pelota permaneça comestível.
      3. Avalie o número de vezes que a comida é obtida por ataque entre ratos que nadam para comer e ratos que não o fazem.
      4. Regissue o número de vezes que a comida é transportada por um rato que nada.
      5. Registo o tempo que os ratos passaram em gaiolas separadas em comparação com o tempo gasto na gaiola original.
         NOTA: Todos os dados foram obtidos por observação visual contínua.

4. Avaliação da anedonia: O teste de preferência de sacarose

1. Avalie a anedonia pelo teste de preferência de sacarose com pequena modificação, conforme descrito anteriormente^{23,25,31,32,33}. Realizar este teste nos dias -6, 0, 35, 41, 62 e 68 do procedimento (ver Figura 1 para cronograma do protocolo).
   1. Permitir que os ratos consumam solução de sacarose por 24h, acessando livremente as duas garrafas em cada gaiola, contendo 100 mL de solução de sacarose (1%, w/v).
   2. Após 24h, substitua uma das garrafas por água por mais 24 horas.
   3. Privar ratos de água por 12 horas^{e 34}.
   4. Dê aos ratos ambas as garrafas (uma com água e outra com sacarose). Após 4h, registo o volume da solução de sacarose consumida e da água.
   5. Calcular a preferência de sacarose como preferência de sacarose (%) = consumo de sacarose (mL)/(consumo de sacarose (mL) + consumo de água (mL)) × 100%.
      NOTA: Ao utilizar o modelo de Estresse Imprevisível Crônico em conjunto com um teste de organização social, recomendamos não apenas registrar a média de sacarose e consumo de água, mas também notar mudanças no comportamento de cada rato individual. Isso permitirá uma compreensão mais específica das mudanças comportamentais dentro do indivíduo, em vez de dentro do grupo, quando confrontado com um modelo hierárquico, como a tarefa de mergulho por alimento.

5. Análise estatística

1. Determine comparações entre grupos que utilizam o Kruskal-Wallis seguidos por Mann-Whitney para dados não paramétricos ou uma análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida pelo teste pós-hoc de Bonferroni ou pelo teste t-test do Aluno para dados paramétricos.
   NOTA: Os resultados são considerados estatisticamente significativos quando p < 0,05, e altamente significativos quando p < 0,01.

Mudanças de peso corporal
A ANOVA unidirecional não mostrou diferenças nas mudanças no peso corporal entre grupos experimentais durante os 21 dias da tarefa de mergulho por alimento. Dos dias 2 a 21, houve mudanças no peso corporal para todos os 3 grupos (p<0,01, Tabela 1).

Teste de preferência de sacarose
No início do experimento (dia 0), não houve diferença no percentual de preferência por sacarose entre o grupo experimental de ratos induzidos pela anedonia (85,6% ± 18,6), o grupo experimental tratado com terapia antidepressivo (85,1% ± 18,8) e o grupo controle (85,7% ± 9,9). No dia 35, em comparação com o grupo controle (84,13% ± 12,3), houve uma preferência percentual significativamente menor no grupo experimental (62,69% ± 17,7, p<0,01) e no grupo experimental com tratamento (68,48% ± 13,9, p<0,01, Figura 3A). Ainda não houve diferenças entre o grupo experimental e o grupo experimental com o tratamento. No dia 62, os ratos experimentais apresentaram preferência por sacarose por cento menor (68% ± 15) do que o grupo controle (78,5% ± 16) e o grupo experimental com tratamento (77% ± 16, p<0,05, Figura 3B). Não houve diferenças entre o grupo de tratamento e o grupo controle neste momento. Os dados são apresentados como preferência percentual de sacarose ± desvio padrão.

Tarefa de mergulho por comida
A atividade social dos ratos em situação de acesso restrito aos alimentos é ilustrada na Figura 4. Ratos do grupo experimental demonstraram um aumento na frequência de entradas no túnel (113% ± 3,7, p<0,01, Figura 4A), mergulho por alimentos (141% ± 7, p<0,01, Figura 4B),alimentos obtidos por transporte (168% ± 12, p<0,01, Figura 4C), tempo gasto em gaiolas separadas (123% ± 7,9, p<0,01, Figura 4D), e alimentos obtidos por ataque (232% ± 26, p<0,01, Figura 4E) em comparação com o grupo experimental com tratamento (44% ±7, 53% ± 6, 54% ± 5, 55% ± 4,7, 67% ± 3,4, respectivamente). As diferenças entre o grupo experimental de ratos e os ratos experimentais tratados com antidepressivos foram estatisticamente maiores do que a diferença entre o grupo experimental e o grupo controle em todos os 5 parâmetros do teste de mergulho para alimentos (p<0,05). Os dados são apresentados como uma porcentagem média em comparação com os controles ± erro padrão da média.

Figura 1. Uma linha do tempo do protocolo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Ilustração do aparelho de mergulho por comida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. O teste de preferência de sacarose (A) após 35 dias e (B) após 62 dias. Não houve diferença no consumo de sacarose no início do experimento. (A) Até o dia 35 do experimento, o grupo anedônico (p<0,01) e o grupo anedônico tratado com terapia antidepressivo (p<0,01) apresentaram preferência percentual significativamente menor do que o grupo controle. (B) No dia 62, os ratos induzidos com anedonia apresentaram menor preferência por sacarose em comparação com o controle e o grupo anedônico tratado com tratamento antidepressivo (p<0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Atividade social de ratos em situação de acesso restrito aos alimentos. (A) Frequência de entradas no túnel. (B) Mergulho para comer. (C) Alimentos obtidos por transporte. (D) Tempo gasto em gaiolas separadas. (E) Alimento obtido por ataque. Os dados são apresentados como uma porcentagem média em comparação com valores de controle médios + erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mesa 1. Alterações no peso corporal (em percentagem) durante a tarefa de mergulho por alimento. Não houve diferenças entre os 3 grupos experimentais para alterações no peso corporal durante os 21 dias da tarefa. Dos dias 2 a 21, houve um efeito global entre os dias expressos como uma mudança no peso corporal (p<0,01).

Os autores não têm nada a revelar.