Method Article

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

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O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Abstract

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O sucesso da implantação de tecido cultivado em laboratório ou de um dispositivo médico em um indivíduo está sujeito à resposta imune do hospedeiro receptor. Considerando um implante como um corpo estranho, uma resposta imune hostil e desregulada pode resultar na rejeição do implante, enquanto uma resposta regulada e recuperação da homeostase podem levar à sua aceitação. A análise dos microambientes de implantes dissecados em ambientes in vivo ou ex vivo pode ajudar na compreensão do padrão de resposta imune, o que pode, em última análise, ajudar no desenvolvimento de novas gerações de biomateriais. A citometria de fluxo é uma técnica bem conhecida para caracterizar células imunes e seus subgrupos com base em seus marcadores de superfície celular. Esta revisão descreve um protocolo baseado em cubagem manual, digestão enzimática e filtração através de um filtro celular para o isolamento de suspensões celulares uniformes do tecido dissecado do implante. Além disso, um protocolo de coloração por citometria de fluxo multicolor foi explicado, juntamente com as etapas para ajustes iniciais do citômetro para caracterizar e quantificar essas células isoladas por citometria de fluxo.

Introduction

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Os avanços no campo da medicina têm levado ao uso frequente de materiais implantados para apoiar a função ou o recrescimento do tecido lesado 1,2. Estes incluem dispositivos como marca-passos, implantes cosméticos reconstrutivos e placas ortopédicas usadas para fixação de fraturas ósseas 3,4. No entanto, os materiais utilizados para a confecção desses implantes e os locais em que são implantados desempenham papéis importantes na determinação do sucesso desses implantes 5,6,7

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Protocol

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NOTA: A Figura 1 fornece uma visão geral do protocolo de citometria de fluxo.

1) Preparação do reagente

  1. Preparar meios para diluir enzimas e para cultura de tecidos.
    1. Adicionar 5 mL de solução tampão do ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) em 500 mL de meio RPMI e agitar bem. Conservar o meio a 4 °C até nova utilização.
  2. Calcular o volume da solução enzimática.
    NOTA: O volume da solução enzimática é o volume do meio contendo as enzimas (colagenase e DNase I) que serão necessárias para digerir o tecido cortado em cubos em placas de 6 poços; depende d....

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Results

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O processo de desenvolvimento de painéis de citometria de fluxo para análise imunológica muitas vezes depende da comparação dos resultados com dados existentes e a literatura na área. O conhecimento de como as populações podem se apresentar na citometria de fluxo é fundamental para a interpretação adequada dos dados. Independentemente disso, populações e tipos celulares podem aparecer de forma diferente em diferentes tecidos, portanto, alguma variabilidade é esperada. No contexto de tecid.......

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Discussion

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Esta revisão descreve uma metodologia detalhada para isolar células de implantes de biomateriais para obter uma suspensão celular uniforme. Além disso, um protocolo detalhado foi fornecido para coloração da suspensão celular para citometria de fluxo multicolorida, juntamente com as etapas para a configuração de um citômetro de fluxo para resultados ótimos. Os métodos de isolamento celular podem envolver várias etapas, muitas vezes utilizando dissecção manual do tecido seguida de digestão enzimática com enzimas proteolíti.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, incluindo o Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia. Isenção de responsabilidade: Os NIH, seus diretores e funcionários não recomendam ou endossam qualquer empresa, produto ou serviço.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos cônicos de 50 mLFisher Scientific14-432-22
Placa de 6 poçosFisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
BD CytofixBD Biosciences554655Para fixar apenas células
Albumina de soro bovinoMillipore SigmaA7906Para preparar FACS tampão de coloração
CD11b AF700Biolegend101222Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5Biolegend117325Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594Biolegend120121Clone: 4B12
CD200R3 APCBiolegend142207Clone: Ba13
CD206 PEBiolegend141705Clone: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778Clone: 104/A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199Clone: GL1
CD8a BV421Biolegend100737Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouseBD Biosciences552843Para controle de compensação
DNase IMillipore Sigma11284932001Desoxirribonuclease pancreática bovina I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7Biolegend123113Clone: BM8
Fc BlockBiolegend101301Clone: 93
Kit de Solução de Fixação/PermeabilizaçãoBD Biosciences554714Para fixação e permeabilização de células.
Tampão HEPESThermo Fisher15630080Buffer para complementar o meio celular
LiberaseMillipore Sigma5401127001Mistura de Colagenase I purificada e Collagenase II
LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas azuis fixávelThermo FisherL23105Corante de viabilidade
Ly6c AF488Biolegend128015Clone: HK1.4
Ly6g BV510Biolegend127633Clone: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894Clone: M5 / 114.15.2
Tampão fosfato salino ThermoFisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176Meios de cultura de células
Siglec F BV605BD Biosciences740388Clone: E50-2440
Placade 96 poços com fundo em V

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.

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Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

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