O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.
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Artigo de método
Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
O sucesso da implantação de tecido cultivado em laboratório ou de um dispositivo médico em um indivíduo está sujeito à resposta imune do hospedeiro receptor. Considerando um implante como um corpo estranho, uma resposta imune hostil e desregulada pode resultar na rejeição do implante, enquanto uma resposta regulada e recuperação da homeostase podem levar à sua aceitação. A análise dos microambientes de implantes dissecados em ambientes in vivo ou ex vivo pode ajudar na compreensão do padrão de resposta imune, o que pode, em última análise, ajudar no desenvolvimento de novas gerações de biomateriais. A citometria de fluxo é uma técnica bem conhecida para caracterizar células imunes e seus subgrupos com base em seus marcadores de superfície celular. Esta revisão descreve um protocolo baseado em cubagem manual, digestão enzimática e filtração através de um filtro celular para o isolamento de suspensões celulares uniformes do tecido dissecado do implante. Além disso, um protocolo de coloração por citometria de fluxo multicolor foi explicado, juntamente com as etapas para ajustes iniciais do citômetro para caracterizar e quantificar essas células isoladas por citometria de fluxo.
Introdução
Os avanços no campo da medicina têm levado ao uso frequente de materiais implantados para apoiar a função ou o recrescimento do tecido lesado 1,2. Estes incluem dispositivos como marca-passos, implantes cosméticos reconstrutivos e placas ortopédicas usadas para fixação de fraturas ósseas 3,4. No entanto, os materiais utilizados para a confecção desses implantes e os locais em que são implantados desempenham papéis importantes na determinação do sucesso desses implantes 5,6,7
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Protocolo
NOTA: A Figura 1 fornece uma visão geral do protocolo de citometria de fluxo.
1) Preparação do reagente
- Preparar meios para diluir enzimas e para cultura de tecidos.
- Adicionar 5 mL de solução tampão do ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) em 500 mL de meio RPMI e agitar bem. Conservar o meio a 4 °C até nova utilização.
- Calcular o volume da solução enzimática.
NOTA: O volume da solução enzimática é o volume do meio contendo as enzimas (colagenase e DNase I) que serão necessárias para digerir o tecido cortado em cubos em placas de 6 poços; depende d....
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Resultados
O processo de desenvolvimento de painéis de citometria de fluxo para análise imunológica muitas vezes depende da comparação dos resultados com dados existentes e a literatura na área. O conhecimento de como as populações podem se apresentar na citometria de fluxo é fundamental para a interpretação adequada dos dados. Independentemente disso, populações e tipos celulares podem aparecer de forma diferente em diferentes tecidos, portanto, alguma variabilidade é esperada. No contexto de tecid.......
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Discussão
Esta revisão descreve uma metodologia detalhada para isolar células de implantes de biomateriais para obter uma suspensão celular uniforme. Além disso, um protocolo detalhado foi fornecido para coloração da suspensão celular para citometria de fluxo multicolorida, juntamente com as etapas para a configuração de um citômetro de fluxo para resultados ótimos. Os métodos de isolamento celular podem envolver várias etapas, muitas vezes utilizando dissecção manual do tecido seguida de digestão enzimática com enzimas proteolíti.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, incluindo o Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia. Isenção de responsabilidade: Os NIH, seus diretores e funcionários não recomendam ou endossam qualquer empresa, produto ou serviço.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos cônicos de 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Placa de 6 poços | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | Para fixar apenas células |
| Albumina de soro bovino | Millipore Sigma | A7906 | Para preparar FACS tampão de coloração |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | Para controle de compensação |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Desoxirribonuclease pancreática bovina I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Kit de Solução de Fixação/Permeabilização | BD Biosciences | 554714 | Para fixação e permeabilização de células. |
| Tampão HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer para complementar o meio celular |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Mistura de Colagenase I purificada e Collagenase II |
| LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas azuis fixável | Thermo Fisher | L23105 | Corante de viabilidade |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5 / 114.15.2 |
| Tampão fosfato salino Thermo | Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Meios de cultura de células |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| Placa | de 96 poços com fundo em V |
Referências
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.
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Reimpressões e permissões
