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Criopreservação de oócitos recuperados do tecido ovariano para otimizar a preservação da fertilidade em meninas e mulheres pré-púberes

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DOI:

10.3791/61777

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23 de outubro de 2020

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1Développement Embryonnaire Précoce Humain et Pluripotence, Univ Montpellier, INSERM 1203, 2Département de Biologie de la Reproduction, Biologie de la Reproduction/DPI et CECOS, CHU Montpellier, Univ Montpellier, 3Centre d'AMP-CECOS, CHU Grenoble-Alpes, Univ Grenoble-Alpes

Neste artigo

Resumo

Propomos um protocolo para preservação da fertilidade em meninas pré-púberes e mulheres com risco de insuficiência ovariana prematura. Combina congelamento de tecido ovariano e criopreservação de oócitos recuperados do tecido ovariano. Essa estratégia melhora a segurança e otimiza o potencial reprodutivo de preservação da fertilidade, maximizando a chance de parto.

Resumo

A criopreservação de tecido ovariano humano (OTC) é cada vez mais usada em todo o mundo para preservar a fertilidade feminina em meninas pré-púberes e mulheres em risco de insuficiência ovariana prematura (POI) no contexto de tratamentos gonadotóxicos urgentes ou cirurgia ovariana. A preservação da fertilidade é desafiadora, pois não há consenso quanto ao manejo do paciente, estratégias de preservação da fertilidade ou mesmo protocolos técnicos laboratoriais, o que implica que cada procedimento deve ser adaptado às características do perfil do paciente e à sua própria relação risco-benefício. Durante a OTC, oócitos maduros/imaturos podem ser aspirados diretamente de folículos antrais grandes/pequenos dentro de amostras de tecido ovariano e/ou ser liberados em meios de cultura de folículos em crescimento durante a dissecção do tecido ovariano em meninas e mulheres pré-púberes. Neste manuscrito, apresentamos um protocolo que combina o congelamento do tecido ovariano com a criopreservação de oócitos maduros/imaturos recuperados de amostras de tecido ovariano, melhorando o potencial reprodutivo de preservação da fertilidade. Coleta, manuseio e armazenamento adequados de tecido ovariano e oócitos antes, durante e após a criopreservação serão descritos. O uso subsequente e a segurança de amostras de tecido ovariano e oócitos criopreservados/descongelados também serão discutidos, bem como o momento ideal para a maturação in vitro de oócitos imaturos. Recomendamos o uso sistemático deste protocolo na preservação da fertilidade de meninas e mulheres pré-púberes, pois aumenta todo o potencial reprodutivo de preservação da fertilidade (ou seja, vitrificação de oócitos além de OTC) e também melhora a segurança e o uso da preservação da fertilidade (ou seja, descongelamento de oócitos versus enxerto ovariano), maximizando a chance de parto bem-sucedido para as pacientes em risco de IOP.

Introdução

O campo da preservação da fertilidade tem crescido nas últimas duas décadas devido ao crescente número de pacientes em risco de insuficiência ovariana prematura (IOP)1,2,3. As opções médicas atualmente disponíveis para preservar a fertilidade são a criopreservação do tecido ovariano (OTC)4, congelamento de oócitos/embriões após estimulação ovariana5, administração de análogos de GnRH6 ou transposição ovariana7. A OTC é um grande avanço para a preservação da fertilidade, particularmente em meninas pré-púberes, onde é a única opção atualmente disponível para preservar a fertilidade e também em mulheres que não podem retardar o início do tratamento gonadotóxico 2,4.

A OTC permite a preservação de um grande número de folículos primordiais, que estão localizados no 1 mm externo do córtex ovariano2. O tecido ovariano congelado/descongelado pode ser posteriormente utilizado por enxerto (ortotópico ou heterotópico, autólogo ou doador) ou cultivado in vitro para obtenção de oócitos maduros2. O enxerto de amostras de tecido ovariano pré-púbere congelado e descongelado demonstrou induzir a puberdade 8,9. Nas mulheres, os resultados reprodutivos após o autoenxerto ortotópico do córtex ovariano congelado e descongelado são tranquilizadores, com taxas de nascidos vivos atingindo 57,5% após concepções naturais10 e entre 30% a 70% após concepções de Técnicas de Reprodução Assistida (TRA)11. Desde o primeiro nascimento vivo de transplante ortotópico de tecido ovariano humano congelado/descongelado em 200412, essa técnica permitiu o nascimento de pelo menos 130 crianças em todo o mundo2. As funções hormonais e reprodutivas do tecido do enxerto geralmente duram vários anos 11,13,14, confirmando sua funcionalidade a longo prazo.

No entanto, o autotransplante de amostras de tecido ovariano apresenta um risco teórico de reintrodução de células malignas viáveis em alguns pacientes 15,16,17,18, particularmente em sobreviventes de leucemia19. Até o momento, nenhum caso de transmissão de câncer através do enxerto de córtex ovariano congelado/descongelado foi relatado em sobreviventes saudáveisde câncer 11, sugerindo que a natureza fibrosa avascular do córtex ovariano poderia representar um microambiente inóspito para a disseminação de células malignas. No entanto, o enxerto de tecido ovariano ainda representa uma técnica experimental e desafiadora, indicando que o uso de oócitos deve ser considerado atualmente como uma abordagem mais fácil e segura do que o enxerto de tecido ovariano para restaurar a fertilidade. Curiosamente, oócitos imaturos podem ser facilmente recuperados do tecido ovariano durante a OTC em meninas e mulheres pré-púberes16, sugerindo que poderia representar uma fonte confiável para maximizar o potencial de restauração da fertilidade, além do congelamento do tecido cortical ovariano. Esses oócitos podem ser aspirados manualmente ex vivo no laboratório de ART a partir de folículos antrais visíveis ou isolados de meios gastos após a dissecção do tecido ovariano. Os oócitos recuperados podem então ser vitrificados diretamente em um estágio imaturo ou amadurecidos antes da etapa de vitrificação usando maturação in vitro (IVM) 20 , 21 .

Neste manuscrito, propomos um protocolo que combina a criopreservação de tecido ovariano com o isolamento e criopreservação de oócitos maduros (oócitos em estágio MII) e/ou imaturos (ou seja, oócitos em estágio de vesícula germinativa (GV) e metáfase I (MI)) recuperados de tecido ovariano. Este protocolo descreve todas as etapas específicas necessárias para maximizar o potencial de preservação da fertilidade em meninas e mulheres pré-púberes.

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Protocolo

Todas as mulheres (maiores de 18 anos), bem como todas as meninas menores e seus pais, assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido para preservar a fertilidade da paciente em risco de IOP. Este protocolo é considerado um procedimento de ART de rotina em nosso centro de preservação da fertilidade. Segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos de nossas instituições.

1. Controle de qualidade

  1. Incluir idade feminina ≤ 38 anos, contendo concentração circulante de hormônio anti-mulleriano >1 ng/mL e mostrando a presença de um risco aumentado de IOP devido ao tratamento gonadotóxico. Exclua mulheres elegíveis para vitrificação de oócitos para procedimento de preservação da fertilidade, mulheres com uma condição que impeça dar um consentimento totalmente informado ou mulheres com alto risco de complicações de anestesia ou cirurgia.
  2. Confirme a presença de um consentimento assinado pelo paciente antes de iniciar este procedimento.
  3. Identifique dois locais vagos dentro de dois tanques de armazenamento de criopreservação distintos. Metade dos criotubos/canudos serão mantidos no primeiro tanque de armazenamento, enquanto a outra metade dos criotubos/canudos será mantida no outro tanque para minimizar o risco de perda total das amostras em caso de falha do tanque.
  4. Verifique a disponibilidade e funcionalidade de todos os dispositivos médicos exigidos neste protocolo. Tesouras de dissecação cirúrgica estéreis com lâminas retas afiadas e pontas finamente afiadas, bem como pinças de tecido atraumático estéreis são recomendadas para a etapa de dissecação.
  5. Verifique se todas as etapas de controle de qualidade foram respeitadas para todos os dispositivos médicos (particularmente, validação e controle de rotina dos processos de esterilização, verificação de validade/número de lote e rastreamento).
  6. Mantenha um ambiente asséptico/estéril durante todo o procedimento e realize com cautela todas as precauções de segurança.
  7. Use pratos, pipetas e instrumentos cirúrgicos diferentes para cada paciente.

2. Na véspera da conservação

  1. Preparar uma placa de Petri de FIV estéril de 60 mm contendo um meio de FIV coberto com óleo mineral e incubar a placa durante a noite a 37 °C numa atmosfera de 5% de O2 e 5% de CO2. Utilize esta placa para recolher os complexos cumulus-oócitos (COCs) que serão potencialmente recuperados do tecido (ver secção 7.2).
  2. Preparar uma placa de Petri para FIV estéril de 35 mm contendo meio de FIV e incubar a placa durante a noite a 37 °C numa atmosfera de 5% de O2 e 5% de CO2. Use esta placa para a etapa de desnudação do oócito (ver seção 9.1).
  3. Preparar uma placa de Petri de FIV estéril de 35 mm contendo meio de FIV coberto com óleo mineral e incubar a placa durante a noite a 37 °C numa atmosfera de 5% de O2 e 5% de CO2. Utilize esta placa para recolher os ovócitos após a etapa de desnudação (ver secção 9.4).

3. Coleta e transporte de tecido ovariano

  1. Realizar a cirurgia laparoscópica sob anestesia geral utilizando um portal de 10 mm posicionado no umbigo e dois portais de 5 mm, um posicionado no quadrante inferior esquerdo e outro posicionado no quadrante direito.
  2. Realizar uma ooforectomia unilateral parcial ou completa de acordo com a decisão consensual do oncologista, do cirurgião e da equipe médica da unidade de ART com base na reserva ovariana, no tamanho e no aspecto macroscópico de ambos os ovários (Figura 1, A1–B1) e no protocolo gonadotóxico planejado. Realize a ooforectomia com uma tesoura afiada ou um grampo cirúrgico. Não use nenhum dispositivo de dissecção que possa induzir lesões colaterais, elétricas ou térmicas no tecido ovariano a ser preservado.
    NOTA: Uma ooforectomia unilateral completa é geralmente realizada em meninas pré-púberes 16,22, enquanto uma ooforectomia unilateral parcial pode ser comumente alcançada em pacientes adultas com ovários grandes e/ou alta reserva ovariana.

Processo de dissecção e secção do ovário; as imagens mostram ovário, pedaços de SAF, córtex, medula, CL.
Figura 1: Criopreservação do tecido ovariano. Criopreservação de tecido ovariano em uma menina pré-púbere (A, paciente de 7 anos) e em uma mulher (B, paciente de 28 anos), ambas portadoras de leucemia mieloide aguda. (A1–B1) Visão laparoscópica do ovário. (A2-B2-B3) Dissecção do tecido ovariano. (B4) Tecido ovariano cortical. CL: corpo lúteo. SAF: pequeno folículo antral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Realize a evacuação do tecido ovariano usando uma bolsa de recuperação de amostras laparoscópica artesanal ou comercial.
  2. Colocar o tecido ovárico num tubo estéril contendo meio de cultura a 4 °C. O tecido deve ser completamente imerso no meio de cultura.
  3. Transporte imediatamente o tecido ovariano em uma bolsa isolada a 4 °C para o laboratório de ART para obter os melhores resultados.
    NOTA: Se necessário, o tecido ovariano pode ser transportado em temperaturas frias (em torno de 4 °C) para o laboratório por até 26 h após a coleta sem ameaçar a qualidade do tecido23.

4. Preparação do tecido ovariano

  1. Transferir o tecido ovárico para uma placa de Petri de FIV estéril de 90 mm contendo 20 ml de meio de cultura pré-arrefecido a 4 °C.
  2. Coloque a placa de Petri contendo o tecido ovariano em uma placa fria (a 4 °C) colocada em uma bancada limpa de fluxo laminar vertical para minimizar o risco de contaminação por microrganismos.

5. Aspiração folicular manual de amostras de tecido ovariano

  1. Aspire os folículos antrais visíveis (se presentes na superfície do tecido ovariano) com uma agulha de seringa de 21 G conectada a uma seringa descartável de 1 mL.
    NOTA: Esta etapa pode ser complicada. Uma alternativa pode ser abrir suavemente cada folículo antral visível com um bisturi e enxaguar o interior de cada folículo com meio de fertilização in vitro para liberar suavemente os COCs dentro do meio de dissecação.
  2. Lave os fluidos foliculares coletados em uma placa de Petri de fertilização in vitro estéril de 60 mm contendo 5 mL de meio de cultura de fertilização in vitro à temperatura ambiente.
  3. Enxágue a seringa com 1 mL de meio de cultura de fertilização in vitro em temperatura ambiente e lave o líquido na mesma placa de Petri de fertilização in vitro. Repita esta etapa duas vezes.
  4. Identifique e isole os COCs sob um microscópio invertido (ampliação de 50x a 200x).
  5. Transfira os AOCs saudáveis com uma pipeta para uma nova placa de Petri de FIV estéril de 60 mm contendo meio de fertilização in vitro pré-equilibrado coberto com óleo a 37 ° C em uma atmosfera de 5% O2 e 5% CO2.
    NOTA: Os AOCs saudáveis contêm um oócito translúcido. Descarte os AOCs atrésicos que apresentam um oócito de cor marrom.
  6. Armazene a placa de Petri de fertilização in vitro na incubadora a 37 ° C em uma atmosfera de 5% O2 e 5% CO2 até a etapa de desnudação (consulte a etapa 9).

6. Dissecção do tecido ovariano

  1. Prepare a solução de congelamento fresco em um tubo estéril de 50 mL. A solução de congelamento contém 1,5 M de dimetilsulfóxido (DMSO) e 10% de albumina sérica humana em meio de cultura de fertilização in vitro. Suavemente vórtice.
    NOTA: Deve ser preparado imediatamente antes do uso.
  2. Corte o tecido ovariano e remova a medula o máximo possível (Figura 1, B4).
  3. Corte o córtex ovariano em fatias medindo 10 mm x 10 mm x 1 mm ou 0,5 mm x 0,5 mm x 1 mm no caso de ooforectomia unilateral completa ou parcial, respectivamente (Figura 1, A2–B2–B3). O corte é realizado com tesouras cirúrgicas afiadas estéreis e pinças atraumáticas.
    NOTA: Uma fatia de tecido ovariano é mantida intacta com o córtex ovariano e a medula para análise histológica adicional (consulte a etapa 8).
  4. Após a dissecção, execute duas etapas de lavagem (ou mais, se necessário) para cada amostra cortical ovariana em 1 mL de meio de cultura de fertilização in vitro para remover o sangue. Após a lavagem, transferir todas as amostras de tecido para uma nova placa de Petri de 60 mm com meio de cultura de FIV fresco.
  5. Coloque cada amostra cortical ovariana em um criotubo contendo 1 mL de solução de congelamento.
    NOTA: A mistura é desnecessária. A fatia de tecido ovariano mantida para análise histológica adicional não é criopreservada (ver etapa 8).
  6. Conservar as amostras durante 30 min a 4 °C para equilibrar com a solução de congelação.
  7. Criopreservar todas as amostras com uma técnica de congelação lenta. A taxa de resfriamento é de -2 °C/min de +4 °C até -9 °C, -50 °C/min até -30 °C; segure durante 1 min, +4 °C/min até -15 °C, -2 °C/min até -40 °C; e finalmente -25 °C/min até -150 °C usando um freezer programável.
  8. Remova os criotubos imediatamente e mergulhe-os em nitrogênio líquido a -196 °C.
  9. Coloque metade dos criotubos em um primeiro tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e a outra metade dos criotubos em um segundo tanque de nitrogênio líquido.

7. Isolamento manual do COC dos meios gastos de dissecação

  1. Identifique os COCs do meio gasto de dissecção sob um microscópio (ampliação de 50x a 200x) (Figura 2).

Estágios de maturação oocitária; imagens de microscopia com cúmulos marcados, corona radiata, oócitos atrésicos.
Figura 2: CCOs maduros e imaturos recuperados do tecido ovariano. COCs maduros (A) e imaturos (B1–B3,C1–C2) recuperados do tecido ovariano. (A) COC maduro contendo um oócito maduro (presença do primeiro corpo polar, oócito em estágio de metáfase II). (B1) COC imaturo saudável contendo um oócito imaturo (sem corpo polar, oócito em estágio Metaphase I). (B2-B3) COCs imaturos saudáveis contendo oócitos imaturos em estágio de vesícula germinativa (sem corpo polar, oócitos em estágio de prófase I). (C1-C2) COCs insalubres contendo um oócito atrésico de cor marrom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Transfira os COCs saudáveis com uma pipeta para uma nova placa de Petri de fertilização in vitro estéril de 60 mm contendo meio de fertilização in vitro pré-equilibrado coberto com óleo a 37 ° C em uma atmosfera de 5% O2 e 5% CO2 (consulte a etapa 2.1).
    NOTA: Descarte os COCs atrésicos.
  2. Armazene a placa de Petri de fertilização in vitro na incubadora a 37 ° C em uma atmosfera de 5% O2 e 5% CO2 até a etapa de desnudação (consulte a etapa 9).

8. Análise histológica do tecido ovariano

  1. Fixe a fatia restante de tecido ovariano (contendo córtex ovariano e medula) em uma solução de formalina a 3% em uma bancada limpa química para exame histológico.
    NOTA: Deve ser realizado apenas quando as amostras corticais forem congeladas e armazenadas com sucesso.
    CUIDADO: A solução de formalina é irritante, corrosiva e tóxica. Esta etapa deve ser realizada com cuidado e fora do laboratório de fertilização in vitro.
  2. Prescreva uma análise histológica completa desta amostra de tecido ovariano com uma avaliação da presença potencial de células malignas, bem como uma descrição do número e tipo de folículos ovarianos (ou seja, folículos primordiais, primários, secundários e antrais, respectivamente).

9. Desnudação e seleção de oócitos

  1. Realize a desnudação do oócito. Exponha brevemente os COCs à solução de hialuronidase (80 UI / mL ou concentração final de 0,1 mg / mL) com pipetagem suave (aspiração repetida e expulsão dos COCs na solução de desnudação) usando uma ponta de pipeta de grande diâmetro (volume 0,1–20 μL, comprimento: 40,5 mm, diâmetro do cone de trabalho: 6 mm, diâmetro da abertura: 0,36 mm) por 30 s, imediatamente seguido por duas etapas de lavagem em meio pré-equilibrado coberto com óleo mineral para remover o excesso de enzima (consulte a etapa 2.1).
  2. Otimize a remoção de células do cumulus e corona radiata pipetando suavemente usando uma ponta de pipeta de 150 μm em meio de fertilização in vitro pré-equilibrado (consulte a etapa 2.1).
  3. Execute uma etapa de seleção de oócitos saudáveis usando um microscópio invertido (ampliação de 200x a 400x). O estágio de maturação de oócitos saudáveis pode ser GV, MI ou oócitos em estágio MII (Figura 3). Os oócitos saudáveis têm as seguintes características morfológicas: um citoplasma intacto e redondo, um tamanho entre 100-150 μm e uma cor pálida.
    NOTA: Descarte oócitos atrésicos e não saudáveis (Figura 3, D1–D3).

Imagens microscópicas dos estágios de maturação do oócito; vesícula germinativa (GV) identificada em algumas células.
Figura 3: Oócitos maduros e imaturos recuperados do tecido ovariano. (A) Oócito maduro (oócito em estágio metásico II: presença do primeiro corpo polar (PB, seta), sem núcleo visível), (B1–B2) Oócitos imaturos (oócito em estágio Metáfase I: sem corpo polar, sem núcleo visível), (C1–C3) Oócitos imaturos (oócitos em estágio de vesícula germinativa (VG): sem corpo polar, presença de um grande halo com nucléolos dentro do citoplasma (seta)). Em C1, os oócitos em estágio de vesícula germinativa exibem tamanho heterogêneo. (D1–D3) Oócitos atrésicos. PB: corpo polar. GV: Vesícula Germinativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Incubar ovócitos saudáveis dentro da incubadora a 37 °C, 5% de O2 e 5% de CO2 até a etapa de vitrificação (ver etapa 2.1).

10. Vitrificação de oócitos

  1. Confirme a identificação do paciente/espécime.
  2. Execute uma nova etapa de seleção de oócitos saudáveis usando um microscópio invertido (ampliação de 200x a 400x).
    NOTA: Descarte oócitos atrésicos e insalubres.
  3. Tire uma foto de cada oócito saudável usando um microscópio invertido antes da etapa de vitrificação. Observe o estágio de maturação de cada oócito.
    NOTA: Anexe todos esses dados (imagem, tamanho, estágio de maturação) no arquivo do paciente.
  4. Use números de identificação diferentes por canudo para diferenciá-los se estiver criopreservando mais de um canudo por paciente.
  5. Criopreservar um ou dois oócitos por palha.
    NOTA: Oócitos viáveis maduros e imaturos devem ser criopreservados separadamente. Ao criopreservar dois oócitos juntos na mesma palheta, recomenda-se selecionar oócitos com características morfológicas semelhantes.
  6. Criopreservar oócitos saudáveis usando um kit de vitrificação de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
  7. Carregue os oócitos criopreservados em um dispositivo apropriado para crioarmazenamento em nitrogênio líquido de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  8. Coloque metade dos canudos em um primeiro tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e a outra metade dos canudos em um segundo tanque de nitrogênio líquido.

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Resultados

Um total de 81 OTC de 81 pacientes do sexo feminino foram realizados entre 2007 e 2020, incluindo 43 meninas pré-púberes e 38 mulheres. A média de idade das pacientes do sexo feminino (meninas e mulheres pré-púberes) foi de 14,21 ± 9,61 anos (média ± erro padrão). O paciente mais jovem tinha 5 meses e o mais velho 33,6 anos (Tabela 1). A média de idade das meninas e mulheres pré-púberes foi de 6,84 ± 4,81 anos (mín-máx: 0,5-15,1) e 22,76 ± 5,92 anos (mín-máx: 14,2-33,6), respectivamente (Mann-Whitney, p ...

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Discussão

O presente manuscrito fornece um protocolo que combina congelamento de tecido ovariano e criopreservação de oócitos recuperados do tecido ovariano, aumentando o potencial de fertilidade em meninas e mulheres pré-púberes em risco de IOP. Recomendamos fortemente a realização deste protocolo antes do início de qualquer terapia gonadotóxica, a fim de otimizar a quantidade (ou seja, número de oócitos viáveis), bem como a qualidade (ou seja, integridade do DNA e competência citoplasmática) dos...

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Divulgações

Nenhum dos autores tem interesses conflitantes.

Agradecimentos

Agradecemos a todos os membros de nossos centros envolvidos na atividade de preservação da fertilidade (Ginecologistas, Biólogos, Oncologistas e Anatomopatologistas). O estudo foi realizado como parte dos procedimentos de rotina para preservação da fertilidade. Nenhum financiamento foi recebido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa descartável de 1 mlCDD1323101/7002655Outros materiais e tamanhos também podem ser adequados
agulha de seringa de calibre 21MerckZ192481Outros materiais e tamanhos também podem ser adequados
Placa de Petri de FIV de 35 mmNunc150255Outros materiais e tamanhos também podem ser adequados
Placa de Petri de FIV de 60 mmNunc150270Outros materiais e tamanhos também podem ser adequado
90 mm FIV Placa de PetriNunc150360Outros materiais e tamanhos também podem ser adequados
Pinça atraumáticaMedlanePI 299 04Outros materiais e tamanhos também podem ser adequados
Cultura Única Contínua Completa com HSAIrvine Scientific90165Meio de cultura de FIV para coleta de fluido folicular, incubação de COCs, desnudação de oócitos e incubação de oócitos até a etapa de vitrificação.
CryotubeThermo Scientific368632Outros produtos também podem ser adequados
Dimetilsulfóxido (DMSO)MILTENYI BIOTEC SAS170-076-303CryoMACS DMSO 10 (EP)
GT40Air Liquide1,13,517Tanque de armazenamento
HSV Canudo de vitrificação de alta segurançaIrvine Scientific25251Canudos de vitrificação
Albuminade soro humanoVitrolife10064Outros produtos também podem ser adequados
Meio Leibovitz L15EurobioCM1L15000UMeio de cultura para coleta, transporte e dissecção de tecido ovariano
Meio Leibovitz L15 Meiode cultura EurobioCM1L15000Upara solução de congelamento
Mars-IVF Classe II Workstation / L126 IVF DualCooperSurgicalWM1500 / 6-133-911-121Estação de trabalho
Planejador de freezer programávelKRYO 500Kryo 560-16Outros equipamentos também podem ser adequados
Tesouras com lâminas retas afiadas e pontas finamente afiadasMedlaneCI 034 03Outros materiais e tamanhos também podem ser adequados
StripperCooperSurgicalMXL3-STR-CGROutros produtos também podem ser adequados
Pontas (150µ m) para StripperCooperSurgicalMXL3-150Outros produtos também podem ser adequados
Kit de vitrificaçãoIrvine Scientific90133Os protocolos estão disponíveis em http://www.irvinesci.com/products/90133-so-vitrification-freeze-solutions. Outros produtos também podem ser adequados

Referências

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