Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Resumo

Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

Resumo

A espermatogênese é um processo de diferenciação único que, em última análise, dá origem a um dos tipos celulares mais distintos do corpo, o espermatozoide. A diferenciação das células germinativas ocorre nos bolsões citoplasmáticos de células somáticas de Sertoli que hospedam de 4 a 5 gerações de células germinativas simultaneamente e coordenam e sincronizam seu desenvolvimento. Portanto, a composição dos tipos de células germinativas dentro de uma seção transversal é constante, e essas associações celulares também são conhecidas como estágios (I-XII) do ciclo epitelial seminiferous. É importante ressaltar que os estágios também podem ser identificados a partir de túbulos seminiferos intactos com base em suas características diferenciais de absorção/dispersão de luz reveladas pela transilação, e o fato de que os estágios se seguem ao longo do túbulo em uma ordem numérica. Este artigo descreve um método de microdissecção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero do rato. O padrão de absorção de luz de túbulos seminiferos é primeiro inspecionado sob um microscópio de dissecção, e, em seguida, segmentos de túbulos representando estágios específicos são cortados e usados para aplicações a jusante. Aqui descrevemos protocolos de imunossuagem para preparações de abóbora específicas para o estágio e para segmentos de túbulos intactos. Este método permite que um pesquisador se concentre em eventos biológicos que ocorrem em fases específicas da espermatogênese, fornecendo assim uma ferramenta única para estudos de desenvolvimento, toxicológicos e citológicos de espermatogênese e mecanismos moleculares subjacentes.

Introdução

A diferenciação das células germinativas masculinas da espermatogonia diploide para a espermatozoide haploide madura, ou seja,a espermatogênese, é um processo complexo que ocorre no epitélio dos túbulos seminiferos nos testículos de um indivíduo sexualmente maduro¹. Descendentes mitóticos da espermatogonia A1 primeiro dividem-se cinco vezes para expandir a população comprometida com a diferenciação, em seguida, entram em meiose como espermatocitotas que, em última análise, dão origem a espermatoides haploides. A diferenciação de espermatozoides redondos em espermatozoides, ou seja,espermagênese, envolve mudanças complexas na morfologia celular, incluindo compactação nuclear e construção de estruturas específicas de esperma, como o acrossomo e o flagelo. No camundongo, todo o processo de espermatogênese leva 35 dias para completar^2,3.

Em qualquer local, o epitélio seminifero hospeda até cinco coortes de células germinativas diferenciadoras, além das células germinais/progenitoras e as células somáticas sertoli¹. As células germinativas diferenciadoras formam camadas concêntricas da composição da qual é previsível, e as células haploides em um dado passo de desenvolvimento sempre associam-se a certos tipos de espermatotocrócitos e espermatogonia^4,5. Portanto, qualquer seção transversal de um túbulo hospeda coortes de células germinativas de uma composição constante. Essas associações celulares específicas são definidas como os estágios do epitélio seminifero. Os estágios em si não apresentam estados estagnados como pontos de verificação, mas desenvolvem-se continuamente à medida que a diferenciação das coortes de células germinativas progride em sincronia^1,2,6. Em camundongos, existem 12 estágios (I-XII)² que são dispostos de forma segmental ao longo do eixo longitudinal do túbulo seminifero, e seguem-se em uma ordem lógica formando assim a onda de epitélio seminifero, ou onda espermatogênica^7,8,9 (Figura 1). A conclusão da espermatogênese leva quatro ciclos, e camadas hierárquicas ou coortes de células germinativas diferenciadas dentro de qualquer seção transversal de túbulo seminiferou são temporalmente um ciclo seminiferous separados um do outro. O comprimento do ciclo é dependente de espécies e no camundongo cada ciclo leva 8,6 dias¹⁰.

Os estágios podem ser identificados com base na composição celular e organização do epitélio seminifero nas seções de testítio histológico⁵ (Figura 1 e Figura 2). No entanto, a análise histológica é trabalhosa, demorada e requer fixação e coloração, e não pode, portanto, ser aplicada ao tecido vivo. É importante ressaltar que o estadiamento também pode ser realizado em tecido vivo sob um microscópio de dissecção, aproveitando padrões distintos de absorção/dispersão de luz exibidos por diferentes estágios do ciclo(Figura 2). A capacidade de cada estágio de absorver e dispersar a luz é relativa ao nível de condensação de cromatina de espermatâmicos pós-meioticos tardios que qualquer estágio hospeda e a embalagem dessas células em feixes^7,11. A diferenciação de espermatozoides, ou seja,a espermagogênese, é ainda dividida em 16 etapas de desenvolvimento, incluindo 8 passos de espermatização redonda (passo 1-8) e 8 passos de alongamento da espermicidade (passos 9-16) de diferenciação(Figura 1). Os espermatozoides alongados do passo 9-11 (estágio IX-XI) exibem apenas um baixo nível de condensação de cromatina, resultando em baixa quantidade de luz sendo absorvida. A condensação da cromatina começa na etapa 11 de espermatozoides (estágio XI), e os espermatóides alongados do passo 15-16 (estágio IV-VIII) contêm cromatina totalmente condensada e, portanto, exibem absorção máxima de luz(Figura 3). A cromatina precisa ser condensada para ser bem embalada na cabeça do esperma. Fatores adicionais que contribuem para o padrão de absorção de luz são a localização de espermatozoides alongados dentro do epitélio (basal vs. apical) e agrupamento de espermatóides alongados (pronunciados nos estágios II-V)¹¹ (Figura 3). Os feixes são vistos como pontos no meio dos túbulos e como listras nas bordas sob um microscópio de dissecção e quanto mais condensado a cromatina, mais escura a mancha/listra¹¹.

Este artigo descreve o uso do método de microdisseção assistido pela transilação para o isolamento de segmentos de túbulos seminiferos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminifero. Uma vez isolados, os segmentos de túbulos encenados podem estar sujeitos a diversas análises a jusante, incluindo análises bioquímicas de RNA e proteínas^12,13,14,15,citometria de fluxo^16,cultura do túbulo ex vivo ¹⁷ e imunostaining¹⁸. Aqui também fornecemos protocolos detalhados a jusante para preparar monocamadas esmagadas de segmentos de túbulos encenados para análise morfológica de células vivas e imunostainings subsequentes, bem como imunostainings de montagem inteira de segmentos de túbulos. O fluxo de trabalho em poucas palavras descrita na Figura 4.

O método de microdisseção assistido pela transilluminação permite identificação e isolamento precisos de células germinativas em etapas específicas de diferenciação graças à composição celular sincronizada dos estágios. É importante ressaltar que também permite o estudo de eventos dependentes de estágio durante a espermatogênese no tecido vivo. Dada a falta de modelos in vitro escaláveis para espermatogênese, este método também tem uma vantagem única de permitir estudos de desenvolvimento e toxicológicos direcionados a curto prazo em segmentos de túbulos específicos do palco ex vivo^12,17. Embora descrevamos o método aqui para o camundongo, o mesmo procedimento pode ser aplicado a qualquer espécie de mamífero com arranjo longitudinal e segmental de estágios epiteliais seminiferosos, como o rato^4,7,15,19,20.

Protocolo

A manutenção de ratos de laboratório e todos os experimentos animais foi feita de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes para o cuidado e uso de animais de laboratório na Universidade de Turku.

1. Preparação de túbulos seminiferos para microdisseção

1. Sacrifique um camundongo adulto (≥8 semanas de idade, teste 80-120 mgs dependendo da cepa e idade) via asfixia de CO₂ seguida de deslocamento cervical.
   NOTA: O rato deve ser sexualmente maduro, e de preferência com pelo menos 8 semanas de idade. O padrão de transilluminação de camundongos juvenis difere do adulto porque a onda do epitélio seminifero ainda não foi totalmente estabelecida, e o tempo da primeira onda de espermatogênese é distinto^21,22. A falta de espermatozoides alongados em camundongos machos de 4 semanas de idade impede seu uso para microdisseção assistida por transilluminação. Todas as cepas de camundongos que têm espermatogênese normal podem ser usadas.
2. Pulverize o abdômen ventral com 70% de etanol. Abra a cavidade abdominopela usando uma tesoura estéril, fazendo uma abertura em forma de V.
3. Puxando a almofada de gordura epidídil com fórceps estéreis, localize os testículos, disseque-os usando uma tesoura e coloque-os em uma placa de Petri estéril de 100 mm contendo PBS.
   NOTA: Para manter a esterilidade, certifique-se de que todos os labware e ferramentas cirúrgicas estejam estéreis.
4. Usando tesouras finas decapsulam os testículos cortando uma fenda na tunica albuginea, a folha fibrosa grossa encapsulando o testículo. Em seguida, rasgar a tunica aberta usando um par de fórceps. Force os túbulos para fora pressionando com fórceps e descarte a tunica.
   NOTA: Ao descartar a tunica, pode ser benéfico para algumas aplicações a jusante que arteria testicularis seja removida juntamente com a tunica. Evite danificar os túbulos seminiferos.
5. Mova os túbulos seminiferos para uma nova placa de Petri e despeje PBS estéril suficiente para cobrir o fundo da placa de Petri. Em seguida, puxe suavemente os túbulos, mas evite danificar os túbulos.
   NOTA: Muito estresse mecânico afetará o padrão de transilluminação e afetará a viabilidade do tecido e sua arquitetura celular. Os túbulos também podem ser processados para imunostainings de montagem inteira a partir deste ponto sem encenação (3B). Às vezes é suficiente definir o estágio retrospectivamente, incluindo anticorpos contra proteínas expressas na diferenciação de espermatogógonas, como SALL4, c-KIT e DNMT3A^18,23. A densidade da espermatogonia é um indicador de estágio relativamente confiável(Figura 2).

2. Microdisseção assistida por transilluminação

1. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de dissecção firmemente, gravando-a no palco.
   NOTA: É importante gravar bem a placa de Petri para evitar seu movimento que poderia causar a mistura dos segmentos de túbulos seminiferos coletados.
2. Para revelar o padrão de absorção de luz dos túbulos seminiferos em foco, certifique-se de que a amostra esteja iluminada de baixo e a luz passe pela amostra,ou seja, é transilluminada.
   NOTA: A quantidade de luz absorvida/dispersa é relativa ao nível de condensação de cromatina em espermatóides alongados e seu agrupamento dentro do túbulo seminifero: quanto mais condensado, mais luz é absorvida, ou seja,mais escura parece mais escura.
3. Conheça o padrão de absorção de luz de diferentes estágios, conforme descrito na Figura 2, Figura 5A e Figura S1, movendo cuidadosamente feixes de túbulos usando fórceps finos.
   NOTA: Os estágios sempre seguem-se em uma ordem lógica, formando a onda de epitélio seminifero. No entanto, é importante saber que a direção da onda espermatogênica ocasionalmente se inverte e depois volta novamente (também conhecida como modulações^4,9 ), às^vezescomplicando o procedimento. Além disso, o comprimento de cada etapa, em termos de quantos mm de túbulo, varia consideravelmente.
4. Levante cuidadosamente o túbulo de interesse usando fórceps com ponta fisada e, em seguida, corte um segmento de comprimento apropriado usando uma tesoura de microdisseção (ver Vídeo Suplementar 1). Um gancho na ponta dos fórceps facilita o levantamento e a segurando um túbulo e ajuda a evitar espremê-lo.
   NOTA: O comprimento dos segmentos a serem cortados depende de aplicações a jusante. Para a coleta de pedaços de túbulos agrupados de um estágio específico para análise de proteína ou RNA^12,13 (II-V, VII-VIII e IX-XI, Figura 5B) o comprimento é tipicamente de 2-5 mm. Quando a extração padrão de fenol-clorofórmio é usada, cerca de 200 ng de RNA podem ser derivados de 1 mm de túbulo. Para a coloração total dos segmentos de túbulos encenados, o comprimento dos segmentos deve ser de >5 mm. Para preparações de abóbora, o comprimento dos segmentos não deve exceder de 1 a 2 mm porque as células no meio do segmento podem não sair se for muito longo. Use uma balança mm sob a placa de Petri para uma medição precisa do comprimento do túbulo.

3. Imunostaining de diferentes preparações

1. Preparação de abóbora: verificação de etapa e imunostaining
   NOTA: As peças de túbulos específicas do estágio podem ser esmagadas em um slide de microscópio com um vidro de cobertura para realizar análise morfológica de células vivas por microscopia de contraste de fase e imunostaining subsequente. Recomenda-se que um iniciante use esta abordagem para verificar as etapas ao se familiarizar com o método de microdissecção assistido pela transilluminação.
   1. Colete o segmento em um volume de 10 μL usando uma pipeta e mova-o para um slide de microscópio.
   2. Esmague o túbulo colocando um copo de cobertura (20 mm x 20 mm) cuidadosamente no túbulo. Como resultado, as células fluirão para fora do túbulo e formarão uma monocamada de célula viva. Coloque um papel filtro na borda do vidro de cobertura para facilitar a disseminação das células. Evite esmagar as células demais para mantê-las vivas.
   3. Monitore célula se espalhando sob um microscópio. Use um microscópio de contraste de fase em 40x objetivo para verificar o reconhecimento de estágio examinando os tipos de células presentes (Figura 2, Figura S2).
   4. Uma vez que as células tenham se espalhado para formar uma monocamada redonda de ambas as extremidades do túbulo, mergulhe o slide em um recipiente contendo nitrogênio líquido enquanto segura-o com fórceps. Mantenha-o submerso por 10 s. Alternativamente, coloque o slide em uma placa de gelo seca para congelar.
   5. Remova o vidro da tampa, desligando-o usando um bisturi.
   6. Sem demora, proceda com a fixação e coloque rapidamente o deslizamento em um recipiente com 90% de etanol por 2-5 min.
      NOTA: Certifique-se de que a preparação da abóbora não descongele antes de colocá-la em 90% de etanol. Outros fixativos também podem ser usados, como acetona, por 10 minutos.
   7. A seco ao ar e armazena à temperatura ambiente (RT) (até alguns dias) ou a -80 °C (longo prazo).
   8. Para imunostaining, pós-fixar as amostras em 4% de paraformaldeído (PFA) por 10 min na RT.
   9. Enxágüe em PBS e permeabilize com Triton X-100 de 0,1% em PBS por 5 min.
   10. Enxágüe em PBS e desenhe um anel de graxa em torno de cada amostra de abóbora.
   11. Adicione 50-100 μL de 10% BSA (albumina de soro bovino) em 0,1% Tween em PBS (PBST) dentro do anel de graxa e bloco amostras por 30 minutos na RT.
   12. Remova a solução BSA e incuba com um anticorpo primário diluído em 10% de BSA em PBST por 1 h no RT.
   13. Lave 3x por 5 min com PBST.
   14. Incubar com um anticorpo secundário diluído em 10% de BSA em PBST.
       NOTA: Para manchar os acroosos, as amostras podem ser incubadas com anticorpo de aglutina de amendoim rotulado por Rhodamina (PNA, 1:1000) em 10% BSA em PBST por 1 h na RT(Figura S3) em vez de anticorpos primários e secundários específicos.
   15. Lave 3x por 5 min cada com PBST, enxágue com PBS e monte com um montador contendo DAPI.
2. Imunostaining integral de túbulos seminiferos
   NOTA: O protocolo abaixo descreve a coloração de montagem total para os segmentos de túbulos encenados (a partir da etapa 2.4). Se um pesquisador quiser realizar coloração de montagem integral sem encenação (a partir da etapa 1.5), preste atenção às notas em 3.2.1 e 3.2.7.
   1. Usando uma pipeta, transfira os segmentos de túbulos (da etapa 2.4) em PBS gelado para um tubo cônico de 15 mL e permita-lhes sedimentar no gelo.
      NOTA: Se usar túbulos não encenados a partir de 1,5., separe os túbulos em uma placa de Petri, pipetting para cima e para trás em uma placa inclinada várias vezes. Use uma pipeta de 1 mL com uma ponta de corte. Esta etapa visa abrir a estrutura do tecido. No entanto, evite muita tubulação, pois pode danificar os túbulos. A sedimentação dos túbulos levará algumas dezenas de segundos. Pequenos fragmentos de túbulos, células intersticiais e detritos celulares permanecem no supernante.
   2. Remova cuidadosamente o supernatante (SN) por pipetação ou com um aspirador. Adicione 10 mL de PBS gelado e misture por inversão.
   3. Deixe sedimentar e, em seguida, remova o SN como antes.
   4. Adicione 5 mL de 4% PFA e fixe por 5h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) a +4 °C.
      NOTA: O tempo de fixação depende das proteínas de interesse e de sua localização subcelular. Para proteínas nucleares e citoplasmáticas, uma fixação de 2 h é tipicamente suficiente, no entanto, marcadores de membrana, como GFRα1 (receptor da família GDNF alfa 1; Figura 6A,B), beneficiar de uma fixação mais longa, até 6 h.
   5. Deixe sedimentar, remova o SN (PFA) como antes e enxágue brevemente adicionando 10 mL de PBS e invertendo o tubo.
   6. Deixe sedimentar, remova o SN como antes e repita a etapa de lavagem do PBS três vezes por pelo menos 10 minutos cada em uma mesa rotativa a +4 °C e continue com a coloração ou armazene a +4 °C.
      NOTA: Se as condições de trabalho forem estéreis e limpas, as amostras podem ser armazenadas e usadas por pelo menos algumas semanas. Alternativamente, adicione azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (c/v) de uma solução de estoque de 2% para ajudar a preservar os túbulos antes de armazenar a +4 °C.
   7. Usando uma pipeta de 1 mL, mova 10-20 segmentos de túbulos fixos para um tubo de fundo redondo de 2 mL. Deixe sedimentar e remova o SN.
      NOTA: Se trabalhar com túbulos longos que não foram encenados, despeje os túbulos em uma placa de Petri e usando tesouras de microdisseção e segmentos de corte de fórceps de cerca de 5 a 20 mm. Segmentos muito longos se emaranharão durante o procedimento de coloração, enquanto segmentos muito curtos são facilmente perdidos.
   8. Adicione 1 mL de 2% BSA + 10% FBS (soro bovino fetal) em 0,3% Triton X-100 em PBS (PBSX). Bloqueie por pelo menos 1h em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT.
   9. Enxágüe com 1 mL de PBSX, remova o SN por pipetação e adicione 250 μL de anticorpo primário diluído em 1% de BSA em PBSX (1:100-1:2000 diluição). Incubar por 2 h no RT ou durante a noite a +4 °C em uma mesa rotativa (20-30 rpm).
   10. Remova a solução de anticorpos por pipetação e enxágue os túbulos com 1 mL de PBSX como acima. Lave três vezes por 1h em PBSX em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT.
       NOTA: Após esta primeira lavagem, a amostra pode ser deixada durante a noite a +4 °C, se necessário.
   11. Remova o SN e adicione 250 μL de anticorpo secundário diluído em 1% de BSA em PBSX (tipicamente diluição de 1:500 de um anticorpo rotulado fluorescente). Cubra em papel alumínio e incuba em uma mesa rotativa (20-30 rpm) no RT por 1h.
   12. Repita 3.2.10.
   13. Por fim, remova o SN e despeje os túbulos em um slide de microscópio. Separe suavemente e organize os túbulos em tiras lineares usando pontas de carregamento de gel. Escorra o excesso de tampão e adicione o meio de montagem e uma mancha de cobertura.
       NOTA: Evite secar os túbulos enquanto os organiza. A contra-coloração dos núcleos com DAPI não é necessária na maioria dos casos. Sele a borda da tampa com esmalte para evitar a secagem e a deterioração da amostra. Os slides podem ser armazenados por 1-2 semanas a +4 °C antes da imagem.

Resultados

Uma encenação bem-sucedida assistida por transilluminação e microdisseção de túbulos seminiferos de camundongos depende principalmente de encontrar as condições adequadas de iluminação e um microscópio de dissecção adequado, e a capacidade de reconhecer características específicas que caracterizam cada etapa. Os estágios VII-VIII parecem homogêneos escuros porque contêm um alto número de espermatozoides alongados totalmente condensados que estão alinhados na superfície apical do epitélio(Figura 5A e Figura S1). Depois que os espermatozoides maduros são liberados no lúmen na espermicanação, o túbulo parece muito pálido nos estágios IX-XI devido à ausência de espermatozoides condensados alongados no epitélio. A característica mais fácil de identificar em túbulos transilluminados é o ponto de espermicidade (asterisco na Figura 5A e Figura S1), que é a transição repentina da zona escura (VII-VIII) para a zona pálida (IX-XI). A zona pálida é seguida pela zona de ponto fraco (XII-I). A aparência irregular tem origem na organização de espermatozoides alongados com cromatina condensada em feixes. Os pacotes se tornam muito proeminentes na seguinte zona de ponto forte seguinte (II-V). Além disso, os feixes esperceides migram em direção aos núcleos celulares Sertoli que estão localizados perto da lamina basal, que se reflete como aparência listrada do túbulo estágio II-V quando transiladuminado(Figura 2, Figura 5A, B e Figura S1). Os feixes finalmente se dispersam no estágio VI e os espermatóides alongados se movem perto do lúmen para serem liberados do epitélio no estágio VIII.

O estágio exato do segmento do túbulo pode ser verificado com precisão por microscopia de contraste de fase das preparações de abóbora(Figura 2 e Figura S2). As etapas específicas nas preparações de abóbora são reconhecidas com base no desenvolvimento acrosomal da etapa 1-8 de espermatozoides redondos, o status da condensação de cromatina em espermatóides alongados e a presença de feixes espermióides¹⁶ (Figura 3 e Figura S2). Além disso, a presença de tipos celulares anteriores, como espermatogonia tipo B e leptoteno ou espermatos de zygoteno, que podem ser reconhecidos com base em suas características morfológicas, pode ser usada para apoiar o reconhecimento de palco. O tamanho dos núcleos de espermatocitocitos pachytene aumenta de tamanho em torno do estágio VI, o que também pode fornecer ajuda adicional na encenação.

As preparações de abóbora encenadas podem ser utilizadas para estudar a expressão e localização de proteínas de interesse no epitélio seminifero usando imunostaining. Isso permite uma análise muito precisa da expressão específica do tipo celular devido à composição celular bem definida em cada estágio. A expressão específica do estágio pode ser aumentada ainda mais pela co-coloração do acrosome (por exemplo,com PNA) que permite a visualização de passos distintos de diferenciação espercida redonda. Imagens representativas de acroosos manchados de PNA em vários estágios são fornecidas na Figura S3. A coloração acrosomal também pode ser usada para definir o palco retrospectivamente. No entanto, a encenação assistida pela transilluminação é um método consideravelmente mais fácil e rápido para encontrar o estágio desejado do que usar fragmentos não encenados de forma casual.

A coloração de montagem total do túbulo seminifero é tipicamente usada para estudar os tipos de células que estão em contato com a membrana do porão do epitélio seminifero, seja no lado tubular (espermatogonia, espermatos pré-legortone e células sertoli; Figura 6A,B) ou o lado intersticicial (células mióides peritubulares e macrófagos peritubulares; Figura 6C e Figura S4A)²⁴. No entanto, o método também pode ser usado para estudar células ou estruturas que estão localizadas mais profundamente no epitélio, como a barreira do exame de sangue (Espin, Figura S4B),ou células germinativas pós-amióticas (marcador acríal PNA, Figura S4C). Se utilizar segmentos de túbulos não encenados, é possível estimar um determinado estágio retrospectivamente usando um anticorpo contra uma proteína expressa na diferenciação da espermatogonia (A1, A2, A3, A4, In e B; coletivamente A_diff)(Figura 2). A encenação, então, conta com a densidade de uma difusa a_difusão que se submete a seis divisões mitóticas de forma dependente de estágio durante o primeiro ciclo de diferenciação espermatogênica¹, dobrando assim o número de espermatogonia_diff em sincronia após cada divisão^1,25. No entanto, a encenação retrospectiva é menos precisa do que a encenação assistida pela transilluminação porque não há marcadores específicos para gerações distintas de A_diff e a avaliação da densidade_diff pode ser propensa a erros.

Figura 1: Mapa do ciclo epitelial seminifero para encenação de espermatogênese de camundongos. Colunas verticais mostram associações celulares em diferentes estágios do ciclo epitelial seminifero (marcado com numerais romanos I-XII). As células germinativas mais imaturas estão na parte inferior, enquanto as mais diferenciadas estão na parte superior. Para acompanhar o progresso da diferenciação das células germinativas, é preciso mover-se da esquerda para a direita, e de baixo para cima. Um ciclo do epitélio seminifero é uma série completa de estágios que se seguem entre si em uma ordem numérica. Uma espermatogonia indiferenciada; A1-4, tipo A1-A4 espermatogonia; In, espermatogonia intermediária; B, espermatogonia tipo B; Pl, espermatos de pré-lêptoteno; L, espermatodos leptoteno; Z, espermatos de zygoteno; P, espermatos pachytene; D, espermatotocitotas de diploteno; 2°, espermatozoides secundários mais divisões meioticas. Os algarismos árabes 1-16 referem-se a passos de maturação espercida pós-meiopética (espermaogênese). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Associações celulares em estágios do ciclo epitelial seminifero do rato. Estágios do ciclo epitelial seminiferos seguem-se em uma ordem lógica, e assim formam a onda espermatogênica ao longo do eixo longitudinal de um túbulo seminifero. O painel superior ilustra as associações de células germinativas em diferentes estágios, e a localização de tipos de células dentro dos bolsões citoplasmicos das células sertoli (cinza claro) no epitélio seminiferous. A ilustração do túbulo seminifero visualiza a onda espermatogênica e padrões específicos de transilluminação do ponto pálido, fraco, ponto forte e zonas escuras. A partir de cada estágio indicado, são mostradas imagens representativas de contraste de fase de células vivas das preparações de abóbora e testídas periódicas de ácido-Schiff (PAS) manchadas de testídas. Os dois painéis inferiores mostram segmentos de túbulos seminiferos após transilluminação (superior) ou coloração com anticorpos (inferior) contra SALL4 (vermelho, um marcador pan-espermatogonial) e DNMT3A (verde, um marcador_{de diff} A). Os padrões de transilluminação para os estágios IX-XI, XII e VI são destacados com áreas encaixotadas. Tanto o padrão de absorção de luz (superior) quanto a densidade da espermatogonia diferenciadora positiva DNMT3A (inferior) podem ser usados para definir o estágio (aproximado) do ciclo seminiferante. Gerações sucessivas de A_diff são referidas como tipo A1-A4, espermatogonia intermediária (In) e tipo B. Divisão de cada um resulta em duplicação da densidade celular espermatogonial. A maior densidade celular na membrana do porão do epitélio seminifero é vista nos estágios VI-VIII quando os espermatos pré-legotonas pré-pósptotenas (Pl) são observados. Barras de escala: preparação de abóbora. 10 μm, outras 50μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Passos de espergengênese. Características distintas de espermatóides em diferentes etapas da espermagogênese. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Fluxo de trabalho deste estudo. O padrão de transilluminação foi totalmente estabelecido em um rato adulto (>8 semanas de idade). Sacrifique o mouse e prossiga com dissecção e decapsulação de testis sem demora. Puxe suavemente os túbulos em uma placa de Petri. Fixar túbulos para colorações de montagem inteira ou proceder com transilluminação. Sob transilluminação 1) corte segmentos curtos de túbulos de estágio específico para preparações de abóbora (controle de qualidade ou para imunostaining) ou 2) cortem segmentos mais longos para coletar piscinas de estágio para análises de RNA e proteômica, cultura tecidual ou para manchas de montagem integral. Transfira segmentos de túbulos curtos para um slide de microscópio em volume de 10 μL de PBS. Coloque um deslizamento de cobertura no segmento para forçar a saída das células e formar uma monocamada de célula viva. Observe os tipos de células sob um microscópio, em seguida, fixe e manche. WMS, coloração de montagem total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Túbulo seminifero de um rato adulto visto sob microscopia de transiluminação. (A) Um longo segmento de túbulos seminiferos como visto sob transilluminação exibindo a onda de epitélio seminifero. Quatro zonas distintas podem ser identificadas com base na compactação de cromatina em espermatóides e sua localização dentro do epitélio: zona escura (estágios VII-VIII), zona pálida (estágios IX-XI), zona de ponto fraco (estágios XII-I) e zona de ponto forte (estágios II-VI). Asterisco, ponto de espere espermicação. As setas indicam dois segmentos curtos dentro da zona de ponto fraco que têm uma aparência pálida devido ao estresse mecânico no túbulo. Barra de escala: 500 μm. Os insets 1-5 são ampliações mais altas dos segmentos de túbulos selecionados. (B) Segmentos agrupados de túbulos seminiferos representando os estágios II-V (zona de ponto forte), VII-VIII (zona escura) e IX-XI (zona pálida). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imunostainings de montagem total usando marcadores espermatogonais, células sertoli e macrófagos peritubulares. (A) Coloração de montagem total para um segmento representando o estágio XI-II com anticorpos contra GFRα1 (vermelho), SALL4 (verde) e DNMT3B (azul). A coloração revela três populações distintas de espermatogonia: isolada (A_s) ou emparelhada (A_pr)espermatogonia tronco indiferenciada (GFRα1⁺/SALL4⁺/DNMT3B^-; áreas pontilhadas brancas), sincronitárias curtas (aqui 4 células alinhadas; A_al4) progenitor spermatogonia (GFRα1^-/SALL4⁺/DNMT3B^-; áreas pontilhadas amarelas) e diferenciação de espermatogonia (GFRα1^-/SALL4⁺/DNMT3B⁺). As células SALL4⁺/DNMT3B⁺ são do tipo A3-A4. (B) Coloração de túbulos seminiferos de montagem total com anticorpos contra GFRα1 (vermelho), USF1 (verde) e SOX9 (azul). GFRα1 mancha o subconjunto de espermatogonia. USF1 é expresso por células spermatogonia e SOX9⁺ Sertoli. (C) Os macrófagos peritubulares em camundongos adultos são positivos tanto para F4/80 (vermelho) quanto para MHCII (azul). DAPI mancha DNA (verde). Núcleos grandes e brilhantes são núcleos de células myoid peritubulares. Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1: Um longo segmento de túbulos seminiferos como visto sob transilluminação exibindo a onda de epitélio seminifero. Quatro zonas distintas podem ser identificadas com base na compactação de cromatina em espermatóides e sua localização dentro do epitélio: zona de ponto fraco (estágios XII-I), zona de ponto forte (estágios II-VI), zona escura (estágios VII-VIII) e zona pálida (estágios IX-XI). O ponto de espermicação (asterisco) pode ser reconhecido como a zona escura transita abruptamente para a zona pálida. Barra de escala: 500 μm. Os insets 1-4 são ampliações mais altas dos segmentos de túbulos selecionados. Clique aqui para baixar este número.

Figura S2: Microscopia de contraste de fase de monocamadas de células vivas de diferentes estágios do ciclo epitelial seminifero. (A) Estágio I. Os espermatóides redondos passo 1 ainda carecem da estrutura acrosomal. Eles são caracterizados por um pequeno núcleo redondo (círculos vermelhos) com um único cromocentro distinto (setas brancas). O corpo cromatóide é visível no citoplasma como um grânulo escuro em contato próximo com a membrana nuclear (setas azuis). O núcleo celular de Sertoli (círculo branco) contém três focos escuros: um grande nucleoslus com dois cromocentros de satélite. As células de sertoli são vistas sem vida em preparações de abóbora, mas ocasionalmente fluem para fora do túbulo junto com células germinativas. (B) Etapa II-IV. Na etapa 4 de espermatozoides redondos (círculos vermelhos), a estrutura acrosomal (setas vermelhas) aparece como uma vesícula branca ligeiramente achatada presa ao envelope nuclear. Espermicas alongadoras formam feixes e já possuem um flagelo espesso (setas brancas) indicando a presença de bainha mitocondrial no pedaço médio da cauda do esperma. Os núcleos de espermatos pachyteno (PSpc) são aproximadamente duas vezes maiores que os de espermatozoides redondos e são caracterizados por regiões de cromatina escura distribuídas por todo o núcleo. (C) Etapa V-VI. Na etapa 5-6 de espermatozoides redondos (círculo vermelho), o acrossomo é ainda mais achatado e se espalha sobre o núcleo (setas vermelhas). A área do envelope nuclear de frente para o acrosmo parece escura devido à presença do acroplaxome, uma placa rica em proteínas entre a membrana acrosomal e a membrana nuclear. Espermatozoides alongados são liberados de feixes (setas brancas). Os espermatozoides pachyteno (PSpc) são frequentemente observados no epitélio. (D) Estágio VII-VIII. O acrosome (setas vermelhas), um forro escuro no envelope nuclear com sombras brancas, é totalmente estendido e cobre quase todo o lado apical da etapa 7-8 de espermatozoides redondos (círculos vermelhos). Esta etapa é caracterizada por espermatozoides maduros (setas brancas) que podem ser abundantes em muitas partes da preparação da abóbora. O núcleo dos espermatotocitotas pachytene (PSpc) cresce em tamanho durante o desenvolvimento e aparece maior no estágio VII-VIII do que nos estágios anteriores. As áreas escuras de cromatina dentro do núcleo de espermatotas pachytene (PSpc) parecem confusas devido à alta atividade transcricional e eventos meioticos. (E) Estágio X. Os núcleos esperceides do passo 10 (setas brancas) iniciaram o alongamento, mas a cromatina ainda não se condensa. Acrossós começam a formar um gancho na ponta nuclear (seta vermelha). Os núcleos de espermatos pachytene (PSpc) aparecem muito grandes enquanto se preparam para divisões meioticas. (F) Estágio XII. O estágio XII é caracterizado pela presença de placas de metafase meiotica (círculos traços brancos). Pequenas células redondas com padrão típico de cromatina condensada são espermatotocitas de zygoteno (ZSpc), nas quais os cromossomos irmãos estão se alinhando para iniciar a formação do complexo sináptono. Barras de escala: 10 μm. Clique aqui para baixar este número.

Figura S3: Identificação do estágio do ciclo epitelial seminifero com base na coloração acrosomal e nuclear. As preparações de abóbora fixas de acetona foram manchadas com PNA conjugado por Rhodamine e DAPI. Estágio I: Enquanto nenhum acrossomo existe na etapa 1, espermatóides redondos, um acrossomo totalmente desenvolvido pode ser detectado em espermatóides alongamentos. Etapas II-IV: O desenvolvimento acrosomal começa com o aparecimento de grânulos proacrosomal/acrosomal em espermatóides redondos. A vesícula acrosomal na superfície nuclear aparece em volta até o passo 3 espertecia e, em seguida, achata na etapa 4 espermatóides. Estágio V: O ângulo subtenido pelo acrossomo estende-se de 40 graus até a máxima de 95°. Estágio VI–VII: O ângulo subtenido pelo acrossomo estende-se de 95 graus a 120 graus. Estágios VIII-IX: O acrossomo é totalmente estendido na etapa 8 esperceides (estágio VIII), e os núcleos polarizam no lado apical da célula fazendo contato com a membrana plasmática (não mostrada). Pelo estágio IX o núcleo de espermatóides torna-se deformado; superfícies dorsais e ventrais são vistas pela primeira vez. EstágioS X-XI: Os espermatóides mostram o ângulo dorsal. Fase XII: Esta etapa é melhor caracterizada pelo aparecimento de divisões meioticas; placas de metafase são indicadas com setas brancas. Espermatóides alongantes com seus acroosos também são vistos. Barras de escala: 10μm. Clique aqui para baixar este número.

Figura S4: Coloração de montagem inteira para marcadores não convencionais. (A) A actina muscular suave alfa (aSMA) é expressa por células myoid peritubulares. (B) Espin localiza para junções apertadas de células sertoli e contribui para a barreira do exame de sangue. (C) PNA localiza-se acrostos de espermatóides. Barras de escala: 50μm. Clique aqui para baixar este número.

Vídeo suplementar 1: Cortando um pequeno segmento de túbulo seminiferous representando o estágio VII-VIII. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

O método de microdissecção assistido pela transilluminação que descrevemos acima permite uma abordagem orientada para o estágio para o estudo da espermatogênese. A espermatogênese é um processo altamente sincronizado, e todas as etapas-chave durante a diferenciação espermatogênica são reguladas e executadas de forma dependente de etapas, como comprometimento de diferenciação (nas etapas VII-VIII), início da meiose (VII-VIII), divisões meioticas (XII), início de alongamento esperscopado (VIII) e espermicidade (VIII)^1,26,27. A análise orientada ao palco fornece uma ferramenta poderosa para estudar esses eventos particulares que se restringem a etapas específicas da espermatogênese e, portanto, encontradas apenas em estágios definidos do ciclo epitelial seminiferous. Dominar o método requer alguma prática e o uso de um microscópio de dissecção de boa qualidade e condições de iluminação adequadas são fundamentais para o sucesso. Implementar este método como parte do kit de ferramentas cotidiana tem a capacidade de melhorar muito o impacto e a relevância biológica da pesquisa sobre funções reprodutivas masculinas, permitindo uma dissecção mais precisa de eventos moleculares durante a espermatogênese.

Todas as cepas de camundongos WT que estudamos exibem um padrão de transilaminação semelhante e exibem associações celulares conservadas em estágios do ciclo epitelial seminiferous. Na condição de que a diferenciação espersiogênica das células germinativas não seja grosseiramente diferente dos camundongos WT, o mesmo também se aplica a todos os modelos de camundongos eliminados que estudamos. Além disso, pode ser aplicado a outras espécies que exibem arranjo segmentar longitudinal de etapas do ciclo epitelial seminifero⁷. No entanto, espécies com estágios não segmentais (como o humano) não podem ser utilizadas. Dado o papel essencial da condensação da cromatina na alongamento dos espermatóides na definição do padrão de transilluminação, é evidente que qualquer má regulação desse processo inevitavelmente implicará na implementação deste método. Em camundongos juvenis e adultos jovens (5-6 semanas) o padrão de transilluminação ainda não foi totalmente estabelecido e, portanto, apenas camundongos com mais de 8 semanas devem ser usados. Também é importante ter em mente que apertar e puxar os túbulos inevitavelmente implicará no padrão de transilluminação porque distorce a arquitetura celular dentro do epitélio seminiferous.

Os segmentos isolados de túbulos seminiferos também podem ser cultivados permitindo a observação ex vivo e a manipulação de processos acoplados à espermatogênese, incluindo a meiose. Para garantir a viabilidade do tecido e para evitar a degradação do RNA e da proteína, as amostras devem ser coletadas e processadas no máximo 2 horas após o sacrifício do camundongo. Para a cultura ex vivo de túbulos seminiferos, o tempo do sacrifício ao início da cultura não deve exceder 1 hora. A integridade dos fragmentos de túbulos pode normalmente ser mantida até 72 horas in vitro se colhida corretamente.

O estágio do ciclo epitelial seminifero pode ser verificado e ainda mais precisamente definido utilizando microcopia de contraste de fase das preparações de abóbora¹⁶. A microscopia é realizada em células vivas, o que fornece uma dimensão adicional na análise e permite a observação de organela ou movimentos celulares em estágios específicos de espermatogênese^28,29,30. A microscopia de contraste de fase fornece um estágio exato para a imunossuagem subsequente, que permite uma análise muito detalhada da expressão proteica e da dinâmica de localização durante a espermatogênese, incluindo alterações específicas do estágio.

Enquanto as células são liberadas do contexto epitelial em preparações de abóbora, imunossuagens de montagem total de segmentos de túbulos permitem o estudo de células espermatogênicas em seu ambiente fisiológico. Portanto, os preparativos de montagem inteira podem fornecer uma melhor visualização da arquitetura do túbulo seminiferante e seus contatos intercelulares do que imunostaining em seções transversais. É importante ressaltar que a encenação assistida pela transilação dos segmentos de túbulos antes da imunossuagem torna a abordagem ainda mais poderosa, incluindo informações sobre o estágio específico de um determinado segmento. A coloração de montagem total é uma ferramenta particularmente útil para o estudo de células na periferia de túbulos seminiferos, como células myoid peritubulares, macrófagos peritubulares e espermatogonia, mas também pode abrir novas percepções sobre pesquisas sobre células germinativas médias e pós-meióticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A9647
vidro de cobertura 20x20 mm	Menzel Glä ser	11961988
Tubo cônico Falcon 15 ml	Sarstedt	62.554.502
soro bovino fetal (FBS)	Caneta de graxa Biowest	S1810
(ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000
lâmina de microscópio Superfrost Plus	Thermo Scientific	22-037-246
Parafolmaldeído (PFA)	Microscopia Eletrônica Sciences	15714
Placa de Petri (100 mm)	Greiner	664160
solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	11503387
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher	P36962
aglutinina de amendoim marcada com rodamina (PNA)	Vector Laboratories	RL-1072
Triton X-100	Sigma	93443
Tween-20	Sigma	P2287