Usando análise de imagem baseada em computador para melhorar a quantificação da metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1

Summary

Descrevemos um método mais consistente e rápido para quantificar a metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 usando Fiji-ImageJ.

Abstract

O câncer de mama é uma malignidade devastadora, representando 40.000 mortes de mulheres e 30% de novos diagnósticos de câncer feminino nos Estados Unidos apenas em 2019. A principal causa de mortes relacionadas ao câncer de mama é a carga metastática. Portanto, modelos pré-clínicos para o câncer de mama precisam analisar a carga metastática para serem clinicamente relevantes. O modelo de câncer de mama 4T1 fornece um modelo de camundongos espontaneamente metástase e quantificável para o câncer de mama humano estágio IV. No entanto, a maioria dos protocolos 4T1 quantificam a carga metastática contando manualmente colônias manchadas em placas de cultura tecidual. Embora isso seja suficiente para tecidos com menor carga metastática, o erro humano na contagem manual causa resultados inconsistentes e variáveis quando as placas são confluentes e difíceis de contar. Este método oferece uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. Aqui, avaliamos o protocolo usando o pulmão, um tecido altamente metastático no modelo 4T1. Imagens de placas manchadas de azul de metileno são adquiridas e enviadas para análise em Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ então determina a porcentagem da área selecionada da imagem que é azul, representando a porcentagem da placa com carga metastática. Esta abordagem baseada em computador oferece resultados mais consistentes e rápidos do que a contagem manual ou a avaliação histopatológica para tecidos altamente metastáticos. A consistência dos resultados do Fiji-ImageJ depende da qualidade da imagem. Pequenas variações nos resultados entre as imagens podem ocorrer, assim é recomendável que várias imagens sejam tiradas e os resultados sejam mediados. Apesar de suas limitações mínimas, este método é uma melhoria para quantificar a carga metastática no pulmão, oferecendo resultados consistentes e rápidos.

Introduction

Uma em cada oito mulheres será diagnosticada com câncer de mama em sua vida, e ainda apesar de múltiplas opções de tratamento, o câncer de mama é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres americanas¹. Essas mulheres não estão morrendo pelo tumor primário na mama. Em vez disso, a carga metastática é responsável pela mortalidade desta doença, pois comumente se espalha para o pulmão, osso, cérebro, fígado e linfonodos². Por isso, os modelos de câncer de mama precisam avaliar a metástase para contribuir para conter a mortalidade dessa doença. O modelo de câncer de mama murine 4T1 é um excelente p....

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e de acordo com o Guia Nacional dos Institutos de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A realização deste protocolo requer permissão das instituições competentes e adesão a todas as diretrizes adequadas.

1. Cultura celular

1. Faça mídia de cultura completa (RPMI + 10% soro bovino fetal +1% Pen Strep). Reviva células 4T1 de acordo com o Protocolo ATCC¹⁰ e incubar a 37 °C e 5% de CO₂ em um frasco T-25 até confluente. Mude a mídia no dia seguinte à revitalizaç....

Results

Este método contém ajustes simples do protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T1³ e pode ser visualizado na Figura 1. Quando 3 pesquisadores separados contaram manualmente colônias metastáticas para 12 placas pulmonares (diluição de 1:10), os resultados foram muito inconsistentes entre diferentes contadores(Figura 2A). Todos os pesquisadores foram orientados a "contar as colônias metastáticas que aparecem como pontos azuis", mas as inconsi.......

Discussion

Como demonstrado, contar manualmente as colônias metastáticas em cada placa pulmonar pode ser um método impreciso e impreciso para quantificar a metástase pulmonar, demonstrando a necessidade de um melhor meio de quantificação(Figura 2). A análise histopatológica difere ligeiramente da contagem manual e da análise fiji-imageJ(Figura 2B e 4D),provavelmente porque os slides de H&E não são uma amostra representativa de todo o órgão. O protocolo col.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Câmara de anestesia	Ver comentários	Ver comentários	Usar materiais aprovados nas políticas da sua instituição
Agente anestésico	Ver comentários	Ver comentários Utilizar	materiais aprovados nas políticas da sua instituição
BALB/c Ratos fêmeas	O Laboratório Jackson	000651
Tesoura romba	Roboz	RS-6700
Calculadora	Qualquer	Qualquer Câmera
	Qualquer		Qualquer Qualquer Mínimo de 8 megapixels
Centrifugar	Qualquer	Qualquer	Precisa ser capaz de 125 x g e 300 x g Configuração de
eutanásia de CO2	Ver comentários	Ver comentários	Use materiais aprovados nas políticas da sua instituição
Câmaras frigoríficas, geladeira, câmaras frigoríficas	Qualquer	Qualquer
Computador com Fiji-ImageJ	Qualquer	Qualquer Precisa	ser capaz de executar Fiji-ImageJ
Câmara de Contagem	Fisher Scientific	02-671-10
Tesoura curva	Roboz	RS-5859
Água destilada	Qualquer	Qualquer Elastase
	MP Biomedicals	100617
Balança eletrônica	Qualquer	Qualquer
Soro fetal bovino (FBS)	R& D Systems	S11150
Fórceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubadora	Ver comentários	Ver comentários	Precisa ser capaz de 5% CO2 e 37 ° C
Metanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicilina Estreptomicina	ATCC	30-2300
Pinos ou agulhas	Qualquer	Qualquer Para	fixar ratos durante a necropsia
Paquímetros de plástico	VWR	25729-670
RMPI-1640 Médio	ATCC	30-2001
Balancim ou roda rotativa	Qualquer
Qualquer tesoura afiada	Roboz	RS-6702
Filtro descartável estéril com membrana PES	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Frascos	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Frascos	Fisher Scientific	10-126-10
Frascos T-75	Fisher Scientific	13-680-65
Copo de plástico tri-encurralado	Fisher Scientific	14-955-111F	Usado para pesar camundongos
Trypan blue	VWR	97063-702
Tripsina-EDTA	ATCC	30-2101
Tipo IV colagenase	Sigma-Aldrich	C5138
Placas de cultura de tecidos de 3,5 cm	Seringa Nunclon	153066
de 1 mL	BD	309659
tubos de microcentrífuga de 1,7 mL	VWR	87003-294
Placas de cultura de tecidos de 10 cm	Fisher Scientific	08-772-22
Placa de 12 poços	Corning	3512
Tubo de centrífuga de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank' s Solução Salina Balanceada (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in agulhas	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL&tímido; 2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Tioguanina	Sigma-Aldrich	A4882
70 μ Filtro de células M	Fisher Scientific	22-363-548
70% etanol	Sigma Aldrich	E7023	Diluir a 70% com água DI