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Summary

Descrevemos um método mais consistente e rápido para quantificar a metástase pulmonar no modelo de câncer de mama 4T1 usando Fiji-ImageJ.

Abstract

O câncer de mama é uma malignidade devastadora, representando 40.000 mortes de mulheres e 30% de novos diagnósticos de câncer feminino nos Estados Unidos apenas em 2019. A principal causa de mortes relacionadas ao câncer de mama é a carga metastática. Portanto, modelos pré-clínicos para o câncer de mama precisam analisar a carga metastática para serem clinicamente relevantes. O modelo de câncer de mama 4T1 fornece um modelo de camundongos espontaneamente metástase e quantificável para o câncer de mama humano estágio IV. No entanto, a maioria dos protocolos 4T1 quantificam a carga metastática contando manualmente colônias manchadas em placas de cultura tecidual. Embora isso seja suficiente para tecidos com menor carga metastática, o erro humano na contagem manual causa resultados inconsistentes e variáveis quando as placas são confluentes e difíceis de contar. Este método oferece uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. Aqui, avaliamos o protocolo usando o pulmão, um tecido altamente metastático no modelo 4T1. Imagens de placas manchadas de azul de metileno são adquiridas e enviadas para análise em Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ então determina a porcentagem da área selecionada da imagem que é azul, representando a porcentagem da placa com carga metastática. Esta abordagem baseada em computador oferece resultados mais consistentes e rápidos do que a contagem manual ou a avaliação histopatológica para tecidos altamente metastáticos. A consistência dos resultados do Fiji-ImageJ depende da qualidade da imagem. Pequenas variações nos resultados entre as imagens podem ocorrer, assim é recomendável que várias imagens sejam tiradas e os resultados sejam mediados. Apesar de suas limitações mínimas, este método é uma melhoria para quantificar a carga metastática no pulmão, oferecendo resultados consistentes e rápidos.

Introduction

Uma em cada oito mulheres será diagnosticada com câncer de mama em sua vida, e ainda apesar de múltiplas opções de tratamento, o câncer de mama é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres americanas¹. Essas mulheres não estão morrendo pelo tumor primário na mama. Em vez disso, a carga metastática é responsável pela mortalidade desta doença, pois comumente se espalha para o pulmão, osso, cérebro, fígado e linfonodos². Por isso, os modelos de câncer de mama precisam avaliar a metástase para contribuir para conter a mortalidade dessa doença. O modelo de câncer de mama murine 4T1 é um excelente protocolo para conseguir isso. O método descrito aqui oferece uma melhoria para o modelo 4T1 usando Fiji-ImageJ para quantificar a metástase pulmonar, produzindo resultados consistentes e rápidos.

O modelo 4T1 é bem estabelecido, com a maioria dos laboratórios usando protocolos como os descritos por Pulaski e Ostrand-Rosenberg em 2001³. A linha celular 4T1 é resistente à 6-Thioguanina (6TG) e representativa do estágio IV, câncer de mama triplo negativo^3,4,5. É clinicamente relevante por ser um modelo ortotópico e metástase espontaneamente aos mesmos órgãos do câncer de mama humano^3,4. As células 4T1 metástases espontaneamente a uma taxa previsível com base na quantidade de células injetadas^3,4. É importante ressaltar que as diferenças genéticas entre os camundongos aqui utilizados causaram a variabilidade inter-individual esperada na carga metastática. Para avaliar a metástase, os tecidos são colhidos para coletar e quantificar células cancerígenas em locais distantes usando seleção de 6TG e coloração azul de metileno. O resultado é uma coleção de placas de cultura tecidual com pontos azuis representando colônias metastáticas. No entanto, o protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg quantifica as colônias metastáticas contando-as manualmente, e, portanto, este tem sido o meio padrão de avaliar a metástase neste modelo. Embora isso seja fácil para tecidos com baixa carga metastática, tecidos como os pulmões são frequentemente carregados de metástases. Como as placas pulmonares podem ser altamente confluentes, quantificar com precisão e precisão colônias metastáticas por contagem manual é difícil e propenso a erros humanos. Para quantificar melhor a carga metastática, descrevemos o uso do Fiji-ImageJ para uma solução baseada em computador para erro de contagem humana. A análise histopatológica com hematoxilina e eosina (H&E) é outro meio de quantificar metástases pulmonares, e curiosamente também foi melhorada com o software Fiji-ImageJ^6,7. No entanto, como a análise histopatológica observa uma única fatia do pulmão, pode ser imprecisa e não representativa. Isso porque o modelo 4T1 causa várias lesões metastáticas em todo o órgão que não são distribuídas uniformemente. Embora as tendências globais entre a análise histopatológica e a contagem manual possam ser^{semelhantes 8,}os valores individuais podem diferir e, portanto, a análise histopatológica não deve ser usada como único meio de quantificação. Demonstramos o benefício em comparação com a análise histopatológica e as inconsistências na contagem manual entre diferentes contadores, ao mesmo tempo em que demonstramos a consistência do uso do Fiji-ImageJ. Além disso, mostramos que esse método pode reduzir o tempo de incubação de 10-14 dias para 5 dias, o que significa que os pesquisadores podem analisar dados de seu estudo muito mais cedo do que quando se baseia na contagem manual.

Este método é uma coleção de ajustes simples ao protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg³. Como o modelo 4T1 é amplamente utilizado, e como a metástase pulmonar é um parâmetro crítico para medir em modelos pré-clínicos, acreditamos que esse método pode ser amplamente utilizado e é altamente valioso para os pesquisadores de câncer de mama. Os únicos suprimentos adicionais necessários são uma câmera e acesso a um computador com Fiji-ImageJ, um software livre usado com frequência na análise de^{imagens 9}. Este método se concentra especificamente na metástase pulmonar, mas pode ser usado para outros tecidos com carga metastática significativa.

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Virginia Tech e de acordo com o Guia Nacional dos Institutos de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A realização deste protocolo requer permissão das instituições competentes e adesão a todas as diretrizes adequadas. 1. Cultura celular Faça mídia de cultura completa (RPMI + 10% soro bovino fetal +1% Pen Strep). Reviva células 4T1 de acordo com o Protocolo ATCC10 e incubar a 37 °C e 5% de CO2 em um frasco T-25 até confluente. Mude a mídia no dia seguinte à revitalização para remover células mortas, e novamente se a mídia for gasta antes que as células sejam confluentes o suficiente para a passagem. Uma vez que o frasco T-25 é confluente, as células de passagem para um frasco T-75 descartando mídia, lavando frasco com 5 mL de 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS), e adicionando 500 μL de Trypsin-EDTA. Incubar por 5-10 minutos a 37 °C até que as células se desprendem. Uma vez destacado, adicione 5 mL de mídia de cultura completa aquecida às células. Aspire e transfira os 5 mL para um frasco T-75 contendo 15 mL de mídia cultural completa aquecida. Células de passagem em frascos T-75 pelo menos quatro vezes. Faça isso uma vez que o frasco é confluente lavando com 8 mL de 1x DPBS, adicionando 1 mL de Trypsin-EDTA para desacoplar células, adicionando 10 mL de mídia aquecida às células, e diluindo 1:6-1:8 em um novo frasco T-75 contendo 20 mL de mídia cultura completa aquecida. Células de passagem até o número apropriado de frascos T-150 contendo 40 mL de mídia de cultura completa aquecida para o número de ratos a serem injetados. A maioria dos estudos exigirá vários frascos T-150 para garantir células suficientes para injeção. Quando os ratos estão prontos para serem injetados (8 semanas de idade ou pesando mais de 20 g, dependendo do IACUC ou protocolos institucionais), as células de colheita descartando mídia, lavando cada frasco com 10 mL de 1x DPBS e adicionando 2 mL de trypsin-EDTA. Incubar por 5-10 minutos a 37 °C até que as células se desprendem. Lave o frasco com 10 mL de mídia completa e transfira todos os conteúdos (10 mL de mídia + 2 mL de mistura celular trypsin-EDTA) para o próximo frasco. Continue a lavar e coletar células de cada frasco usando os mesmos 10 mL de mídia para evitar o uso de uma quantidade excessiva de mídia. Uma vez coletados todos os frascos, transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de 50 mL. Colete uma amostra de 10 μL para contar em um tubo de microcentrifuuagem e centrifugar o tubo cônico de 50 mL a 125 x g por 5 minutos. Enquanto as células estão sendo centrifugadas, adicione 10 μL de azul Trypan a 10 μL de amostra celular. Conte células usando um hemócito. Uma vez determinado o número total de células, calcule a concentração de células necessárias para injetar camundongos para 1,2 x 106 células por rato (por 100 μL). Após centrifugação, mídia decantada e pelota de célula resuspend em quantidade correta de 1x DPBS estéreis para 1,2 x 106 células por 100 μL. Divida a mistura celular/DPBS em tubos de microcentrifuuge para fácil acesso com a seringa ao aspirar células para injeção. Mantenha as células no gelo e injete logo depois, pois as células começarão a morrer depois de ficarem no gelo por longos períodos de tempo. 2. Injeções Prepare as células para injeção tocando ou misturando suavemente o tubo de microcentrifuuge para resuspensar as células e, em seguida, aspirar 600 μL em uma seringa de 1 mL. Vire a seringa para cima e puxe o êmbolo para baixo para afastar as células da abertura da seringa. Toque na seringa para livrá-la de bolhas de ar. Conecte o bisel da agulha e distribua as células de volta ao tubo de microcentrifuuge até que apenas 500 μL permaneçam na seringa. Coloque a seringa no gelo.NOTA: As células 4T1 caem rapidamente da suspensão. Portanto, é importante misturar as células de volta à suspensão tocando com frequência. Anestesize 8 semanas de idade/>20 g fêmea BALB/c mouse usando isoflurane ou outro agente anestésico aprovado. Monitore a respiração do rato para avaliar a profundidade da anestesia. Uma vez que o mouse esteja devidamente anestesiado como indicado pela falta de reflexo da córnea, coloque o mouse em suas costas. Usando o polegar, o ponteiro e o dedo médio, segure suavemente o mouse. Use o ponteiro e os dedos médios para segurar a parte superior do corpo e o polegar do mouse para a perna esquerda traseira. Seja gentil, mas firme. Com o bisel da agulha para cima, injete 100 μL de células subcutâneas na almofada de gordura mamária abdominal esquerda do rato. Monitore para uma boa sangria e qualquer vazamento, e certifique-se de que o mouse acorde e se mova facilmente após a injeção. Troque agulhas entre cada rato.NOTA: Não permita que a agulha entre na cavidade peritoneal. Isso faria com que o câncer se espalhasse rapidamente e não representasse o modelo. Para garantir uma injeção subcutânea, puxe suavemente para cima na agulha quando inserida na almofada de gordura mamária abdominal esquerda. Se a agulha for facilmente levantada para cima, ela está corretamente posicionada subcutânea. 3. Monitoramento Monitore camundongos pelo menos 3 vezes por semana para peso, escore de condição corporal, tamanho do tumor, condição do tumor, respiração, nível de atividade, aparência e movimento. Uma vez que o tumor atinja 0,7-0,8 cm de diâmetro, comece a monitorar diariamente. Considere a eutanásia quando o tamanho do tumor atinge 1,5 cm, ou a perda de peso atinge 20%, ou declínio clínico severo no escore da condição corporal, condição do tumor, respiração, nível de atividade, aparência ou movimento são observados com base em diretrizes institucionais.NOTA: O escore da condição corporal é crucial para monitorar, pois o peso corporal pode aumentar à medida que o tumor aumenta de tamanho, negando a perda de condições corporais devido à carga da doença. Os protocolos exatos de monitoramento dependerão do IACUC aprovado ou dos protocolos institucionais. 4. Necropsia Eutanize o mouse usando CO2 seguindo as diretrizes institucionais. Spray mouse com 70% de etanol para desinfetar. Faça uma incisão na linha média ventral do rato para expor a cavidade corporal. Remova o rim. Continue cortando a linha média até que o diafragma esteja visível. Use uma tesoura para perfurar o diafragma para esvaziar os pulmões. Corte o diafragma para ter melhor acesso à cavidade. Use uma tesoura sem corte para cortar o centro da caixa torácica. Torção de pino de volta para expor o pulmão e o coração. Perfunda o coração com 2 mL de 1x DPBS não estéril inserindo uma agulha no ápice do coração até que ele se acumule na cavidade abdominal onde o rim foi removido. Para remover o coração e os pulmões, use uma tesoura sem cortes para cortar o esôfago e a traqueia diretamente acima do coração. Usando fórceps, comece a puxar o coração para longe do corpo e corte em qualquer tecido conjuntivo mantendo-o preso. Os pulmões sairão com o coração. Identifique os pulmões multi-lobed (direita) e single-lobed (esquerda). Mantenha o coração preso para referência, mas uma vez identificados os pulmões, corte o coração. Rotule uma placa de 12 poços contendo 1x Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS) em cada poço. Cada rato precisa de 2 poços. Coloque o pulmão multi-lobed (à direita) na placa de 12 poços para avaliação de metástase e mantenha no gelo. Mantenha o vizinho bem vazio por enquanto.NOTA: É importante usar o mesmo pulmão (multi-lobed) de cada rato para garantir que cada amostra esteja próxima em tamanho. O pulmão mono lobed pode então ser usado para outras análises, como histopatologia.NOTA: As amostras estão estáveis no gelo ou a 4 °C por algumas horas. 5. Tecidos de processamento NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser feitas utilizando técnica estéril. Rotule 1 tubo cônico de 15 mL por rato e adicione 2,5 mL de mistura de colagenase tipo IV e 30 unidades de elastase a cada tubo. Para fazer a mistura de colagem tipo IV, dissolva 2 mg de colagenase tipo IV por mL 1x HBSS e filtro estéril. Isso pode ser armazenado até 12 meses a -20 °C e descongelado quando necessário. Transfira o pulmão para o segundo, limpe 1x HBSS bem para essa amostra. Redemoinho usando fórceps para remover qualquer sangue restante. Transfira o pulmão limpo para a placa de cultura de tecido de 3,5 cm vazia. Pulmão picado com tesoura. Enxágüe a placa com 2,5 mL de HBSS 1x, transfira 1x HBSS e peças pulmonares em um tubo cônico de 15 mL já contendo coquetel de colagenase/elastase (total de 5 mL). Incubar por 75 minutos a 4 °C. Continue misturando amostras durante este tempo, então coloque tubos em uma roda de roqueiro ou rotativa. Durante esta etapa de incubação, rotule tubos de centrífugas de 50 mL e placas de cultura tecidual de 10 cm para cada rato. Se fizer uma diluição, rotule placas suficientes de cultura tecidual de 10 cm para as diluições.NOTA: Rotule a tampa das placas de cultura tecidual. Se rotular a placa em si, a escrita interferirá na análise Fiji-ImageJ. Traga volume de cada tubo até 10 mL total com 1x HBSS. Despeje o conteúdo sobre um coador de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL para cada amostra. Use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer suavemente a amostra através do coador para permitir que mais células se filtrem. Centrifugar por 5 minutos a 350 x g em temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatante e lave a pelota com 10 mL de 1x HBSS. Repita este passo duas vezes. Resuspend pellet em 10 mL de 60 μM 6TG mídia de cultura completa, seja RPMI ou IMDM. Amostras de placas em placas de cultura celular de 10 cm, utilizando um esquema de diluição, se desejar. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 5 dias.NOTA: 1:2, 1:10 e 1:100 são diluições comuns que precisarão ser empiricamente determinadas com base nos parâmetros do estudo.ATENÇÃO: O 6TG é tóxico. Tenha cuidado ao manusear e siga todas as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental para o descarte. 6. Placas de coloração Despeje a mídia cultural das placas em recipiente de lixo apropriado. Fixar as células adicionando 5 mL de metanol não diluído por placa e incubar por 5 minutos no RT, certificando-se de girar metanol para que cubra toda a placa.ATENÇÃO: O metanol é perigoso se ingerido, inalado ou está na pele. Use um capuz de fumaça para este passo. Despeje o metanol das placas em recipiente de lixo apropriado. Enxágüe placas com 5 mL de água destilada por prato e despeje água em recipiente de resíduos apropriado. Adicione 5 mL de 0,03% azul de metileno por placa e incubar por 5 minutos na RT, certificando-se de redemoinho de solução azul de metileno para cobrir toda a placa. Despeje o azul de metileno no recipiente de resíduos apropriado. Enxágüe novamente as placas com 5 mL de água destilada por prato. Vire as placas de cabeça para baixo e borre contra uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Coloque a placa em sua tampa e deixe o ar secar durante a noite no RT.NOTA: Colônias metastáticas serão azuis. Uma vez que as placas são secas, elas podem ser armazenadas em RT indefinidamente. 7. Análise de imagem Remova as tampas rotuladas das placas, tomando cuidado para garantir a identificação clara das amostras. Alinhe todas as placas de pulmão manchadas em uma superfície limpa e leve para tirar uma foto de todas as placas em uma imagem. Tire uma foto da coleção de placas em uma área bem iluminada, certificando-se de minimizar reflexos, pois as placas são muito reflexivas. Reflexões nas placas influenciarão a análise da imagem e, portanto, precisam ser evitadas.NOTA: Fiji-ImageJ tem um limite superior de 2 gigapixels. A maioria dos smartphones modernos terá câmeras suficientes. Não use uma câmera inferior a 8 megapixels. A câmera usada neste experimento foi de 12,2 megapixels em um Google Pixel 2. Corte a imagem para incluir as placas, mas exclua as tampas ou qualquer outra coisa no fundo da imagem. Carregue a imagem cortada no Fiji-ImageJ. Alterar a imagem para preto e branco usando os seguintes comandos: Imagem, Ajuste, Limiar de Cor, Método de Limiar: Padrão, Cor limiar: B&W, Espaço limiar: Laboratório. Deselecione a caixa de fundo Escuro. A imagem agora deve ser em preto e branco. Preto representa o fundo leve, e branco representa as colônias metastáticas azuis. Usando a ferramenta Circle na barra de ferramentas Fiji-ImageJ, selecione a área a ser analisada. Desenhe um círculo para usar em todas as placas para garantir que cada placa seja analisada para a mesma área. Escolha um tamanho que maximize a área analisada nas placas, minimizando o ruído de fundo que aparece na borda das placas. O tamanho aparece na barra de ferramentas à medida que é desenhado, por isso é possível fazer um círculo perfeito monitorando a altura e a largura à medida que o círculo é desenhado. Analise o círculo selecionado para determinar qual percentual da área é branca, o que representa a área da placa que possui colônias metastáticas azuis. Use os seguintes comandos:Analisar, Analisar partículas, tamanho (pixel2): 0-Infinito, Circularidade: 0.00-1.00, Mostrar: Nada, e verificar a caixa Resumo. Bata ok. Registo da área de %. Este é o percentual da área selecionada que é branca e, portanto, representa a carga metastática.NOTA: Recomenda-se salvar os resultados em Fiji-ImageJ ou copiar/colar toda a página de resultados em um documento separado. Se os resultados da % Área forem inesperados ou suspeitos, é possível ver se alguma das outras medidas também estava suspeita ou se a % Área foi registrada incorretamente. Mova o círculo, sem alterar seu tamanho, agarrando-o em seu centro, para a próxima placa da imagem. Repita as etapas 7.6 e 7.7 para todas as placas da imagem. Repita as etapas 7.1 – 7.8 em pelo menos mais duas imagens. Uma vez analisadas todas as placas e imagens, a média dos resultados da área % entre diferentes imagens para cada placa para mitigar quaisquer inconsistências entre as imagens.

Representative Results

Este método contém ajustes simples do protocolo Pulaski e Ostrand-Rosenberg 4T13 e pode ser visualizado na Figura 1. Quando 3 pesquisadores separados contaram manualmente colônias metastáticas para 12 placas pulmonares (diluição de 1:10), os resultados foram muito inconsistentes entre diferentes contadores(Figura 2A). Todos os pesquisadores foram orientados a “contar as colônias metastáticas que aparecem como pontos azuis”, mas as…

Discussion

Como demonstrado, contar manualmente as colônias metastáticas em cada placa pulmonar pode ser um método impreciso e impreciso para quantificar a metástase pulmonar, demonstrando a necessidade de um melhor meio de quantificação(Figura 2). A análise histopatológica difere ligeiramente da contagem manual e da análise fiji-imageJ(Figura 2B e 4D),provavelmente porque os slides de H&E não são uma amostra representativa de todo o órgão. O …

Materials

Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
1 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water