Artigo de método

Um pequeno RNA não codificante MicC contribui para a virulência em proteínas da membrana externa em Salmonella enteritidis

DOI:

10.3791/61808

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27 de janeiro de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Agricultural Vocational College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Um sistema de recombinação mediado por λ-Red foi usado para criar um mutante de deleção de um pequeno micC de RNA não-codificante.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um pequeno RNA não codificante (sRNA) é um novo fator para regular a expressão gênica em nível pós-transcricional. Uma espécie de sRNA MicC, conhecido em Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, poderia reprimir a expressão de proteínas da membrana externa. Para investigar melhor a função de regulação do micC em Salmonella Enteritidis, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis e, em seguida, construímos o mutante 50336Δ micC pelo sistema de recombinação baseado em λ Red e o mutante complementado 50336Δ micC/p micC carregando plasmídeo recombinante pBR322 expressando micC. Os resultados da qRT-PCR demonstraram que a transcrição de ompD em 50336Δ micC foi 1,3 vezes maior do que na cepa selvagem, enquanto a transcrição de ompA e ompC em 50336ΔmicC foi 2,2 vezes maior e 3 vezes maior do que na cepa selvagem. Estes indicaram que micC reprime a expressão de ompA e ompC. No estudo seguinte, a patogenicidade de 50336ΔmicC foi detectada por camundongos Balb/c de 6 semanas de idade e galinhas de 1 dia de idade. O resultado mostrou que a DL 50 da linhagem selvagem 50336, os mutantes 50336Δ micC e 50336Δ micC/p micC para camundongos Balb/c com 6 semanas de idade foram 12,59 UFC, 5,01 UFC e 19,95 UFC, respectivamente. As DL 50 das cepas para frangos de 1 dia de idade foram 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC e2,54 x 10 8 UFC, respectivamente. Isso indicou que a deleção de micC aumentou a virulência de S. Enteritidis em camundongos e galinhas regulando a expressão de proteínas da membrana externa.

Introdução

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Os pequenos RNAs não codificantes (sRNAs) têm 40-400 nucleotídeos de comprimento, que geralmente não codificam proteínas, mas podem ser transcritos independentemente em cromossomos bacterianos 1,2,3. A maioria dos sRNAs é codificada nas regiões intergênicas (IGRs) entre regiões codificadoras de genes e interage com mRNAs alvo por meio de ações de pareamento de bases e regula a expressão de genes-alvo em nível pós-transcricional 4,5. Desempenham importantes papéis de regulação no metabolismo de substâncias, síntese de proteínas de membrana externa, quorum sensing e expressão gênica de virulência5.

MicC é um transcrito de RNA pequeno de 109 nucleotídeos presente em Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar Typhimurium, que poderia regular a expressão de múltiplas proteínas de membrana externa, como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. O MicC regula a expressão de OmpC inibindo a ligação do ribossomo ao líder de mRNA ompC in vitro e requer a chaperona de RNA Hfq para sua função em Escherichia coli6. Em Salmonella Typhimurium, MicC silencia o mRNA ompD através de um duplex de RNA de ≤12 pb dentro da sequência codificadora (códons 23-26) e, em seguida, desestabiliza o mRNA endonucleolítico7. Este processo de regulação é assistido pela proteína chaperona Hfq10. A OmpC é uma proteína abundante da membrana externa que foi considerada importante em ambientes onde as concentrações de nutrientes e toxinas eram elevadas, como no intestino6. A porina OmpD é a proteína de membrana externa mais abundante em Salmonella Typhimurium e representa cerca de 1% da proteína celular total11. A OmpD está envolvida na aderência a macrófagos humanos e células epiteliais intestinais12. MicC também reprime a expressão de porinas OmpC e OmpD. Acredita-se que MicC pode regular a virulência. Para explorar novos genes-alvo regulados por MicC e estudar a função de regulação de virulência do micC, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE) e, em seguida, construímos o mutante 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/p micC. Novos genes-alvo foram rastreados por qRT-PCR. A virulência de 50336ΔmicC foi detectada por infecções em camundongos e galinhas.

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Protocolo

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Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Conselho Nacional de Pesquisa. O comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de Yangzhou aprovou todos os experimentos e procedimentos aplicados nos animais (SYXK2016-0020).

1. Cepas bacterianas, plasmídeos e condições de cultura

  1. Utilizar as bactérias e plasmídeos listados na Tabela 1.
  2. Cultivar bactérias em caldo LB ou em placas de ágar LB a 37 °C, na presença de 50 μg/mL de ampicilina (Amp), quando apropriado.
  3. Cepas de cultura contendo plasmídeos sensíveis à temperatura são usadas para a construção de mutantes de deleção a 30 °C.

2. Clone gene micC de S. Enteritidis cepa 50336

  1. Baseado na sequência a montante e a jusante do gene micC de S. Typhimurium cepa SL1344, projetam primers vmicC-F e vmicC-R para amplificar um fragmento contendo o gene micC por PCR usando SE50336 genomic DNA como modelo.
  2. Misturar 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers vmicC-F e vmicC-R, respectivamente, 5 μL de template, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos para PCR.
  3. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 53 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min.
  4. Sequenciar o produto da PCR para obter a sequência do gene micC .

3. Construção do mutante de deleção micC

NOTA: O mutante micC negativo da cepa 50336 de Salmonella Enteritidis foi construído usando recombinação mediada por λ-vermelho, conforme descrito anteriormente13,14. Os primers utilizados estão listados na Tabela 2.

  1. Amplificar de cloranfenicol contendo fragmentos de homologia do gene micC .
    1. Projetar primers micC-F e micC-R para amplificar o de cloranfenicol (Cm) do plasmídeo pKD3, incluindo extensões de homologia de 50 pb do gene 5' e 3' do gene micC .
    2. Extraia o plasmídeo pKD3 como o modelo de PCR.
    3. Mistura de 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers micC-F e micC-R, respectivamente, 5 μL de molde, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos como mistura de reação de PCR
    4. Amplificar o de Cm com as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 1 min, 52 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 10 ciclos; 94 °C por 1 min, 63 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min.
    5. Detectar o tamanho do produto da PCR por eletroforese em gel de agarose. Purificar e recuperar o produto da PCR com kit de recuperação de gel de DNA, e determinar a concentração de DNA por espectrofotômetro.
      CUIDADO: A PCR deve ser realizada duas vezes. O primeiro produto da PCR foi diluído na proporção de 1:200 e usado como molde para a PCR secundária, para eliminar a interferência de recombinação adicional pelo plasmídeo pKD3.
  2. Construa1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::cat
    1. Misturar 100 μL de células competentes SE50336 com 5 μL de plasmídeo pKD46 uniformemente e incubar no gelo por 30 min. Choque térmico da mistura acima a 42 °C por 90 s e transfira rapidamente a mistura para gelo por 2 min para transformar o plasmídeo pKD46 em SE50336. Selecionar colônias positivas cultivando durante a noite a 30 °C em uma placa resistente a Amp (50 μg/mL).
    2. Adicionar 30 mM de L-arabinose à cultura líquida SE50336/pKD46 e induzir a expressão da recombinase através de uma cultura de agitação a 30 °C durante 1 h. Em seguida, prepare células competentes.
    3. Misturar 100 ng de produto de PCR purificado (passo 3.1) e 40 μL de células competentes SE50336/pKD46 num copo de choque eléctrico (por exemplo, Bio-Rad). Realizar transformação de choque elétrico com os parâmetros de tensão 1,8 kV, pulso 25 μF e resistência 200 Ω.
    4. Após a eletrotransformação, transferir a mistura para 1 mL de meio SOC e uma cultura de agitação a 150 rpm e 30 °C por 1 h. Em seguida, esfregar a mistura em uma placa LB resistente a Cm (34 μg/mL) e cultivar a 37 °C durante a noite para rastrear colônia positiva.
    5. Cultivar a colônia positiva acima a 42 °C por 2 h. Selecionar a colônia sensível a Amp (50 μg/mL), mas resistente a Cm (34 μg/mL) a 37 °C durante a noite para obter a 1ª cepa recombinante sem pKD46.
  3. Identificar a 1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::Cat.
    1. Extrato 50336ΔmicC::DNA genômico do gato como o modelo de PCR. Use os mesmos componentes de reação de PCR da etapa 2.1. Realizar a reação de PCR com as mesmas condições da etapa 2.1.
    2. Detectar o tamanho do produto da PCR por eletroforese em gel de agarose e sequenciar o produto da PCR.
  4. Construa o mutante de deleção 50336ΔmicC.
    1. Eletroporato 100 ng de pCP20 plasmidial em 40 μL de 50336ΔmicC::Células competentes do gato com os parâmetros de tensão 1,8 kV, pulso 25 μF e resistência 200 Ω, transformadores positivos de tela em placa resistente a Amp (50 μg/mL) e Cm (34 μg/mL) a 30 °C.
    2. Transferir acima dos transformadores positivos para LB não resistentes e cultivá-los durante a noite a 42 °C e, em seguida, isolar colônias únicas em uma placa LB a 37 °C. Selecione a colônia que é sensível a Amp e Cm. Este mutante é o mutante de deleção micC SE50336ΔmicC.
    3. Verificar 50336ΔmicC por PCR.
      1. Extrato 50336ΔmicC genomic DNA como modelo de PCR. Misturar 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primer vmicC-F, 1 μL de primer vmicC-R, 5 μL de template, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos para PCR.
      2. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 53 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10min.

4. Construção da cepa micC complementada

  1. Projetam primers pBR-micC-F e pBR-micC-R com sítios de restrição NheI e SalI.
    1. Amplificar o gene micC completo com sequências de flanco usando mistura de reação de PCR que contém 5 μL de DNA genômico SE50336 como modelo, primers 1 μL de pBR-micC-F e 1 μL de pBR-micC-R como primers, 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM) e 35 μL de ddH2O.
    2. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 52 °C por 50 s, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min. Purificar e recuperar produto PCR.
  2. Digerir o produto da PCR e o plasmídeo pBR322, respectivamente, usando a enzima de restrição NheI e SalI, e ligá-los usando T4 ligase a 16 °C durante a noite para obter o plasmídeo pBR322-micC.
  3. Transformar pBR322-micC em células competentes SE50336ΔmicC e selecionar transformador positivo para obter a cepa complementada SE50336ΔmicC/pmicC. Extrair o plasmídeo pBR322-micC da cepa complementada e verificá-lo por digestão e sequenciamento da enzima de restrição.

5. Isolamento de RNA e PCR quantitativo em tempo real

  1. Cultura SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC em meio LB durante a noite a 24 °C com cultivo de 180 rpm a um OD600 de 2,0. Coletar cultura bacteriana por centrifugação a 13000 rpm por 2 min.
  2. Extrair RNA total usando o reagente TRIzol. Incubar 50 μL de RNA isolado com 2 μL de DNaseI e 6 μL de tampão 10x a 37 °C por 30 min para remover o DNA. Determinar a quantidade de RNA pipetando 1 μL de amostra de RNA para um microespectrofotômetro.
  3. Síntese de cDNA
    1. Use 1 μg de RNA total para síntese de cDNA em 20 μL do sistema de reação de transcrição reversa (4 μL de tampão 5x, 1 μL de mistura de enzimas RT, 1 μL de mistura de primers RT, 10 μL de RNA total e 4 μL de ddH2O). Incubar acima do sistema de reacção a 37 °C durante 15 min e depois a 85 °C durante 5 s.
  4. Projetar primers baseados na sequência dos genes-alvo ompA, ompC e ompD. Realizar transcrição reversa-PCR usando um kit de reagentes RT. Os componentes da reação de PCR contêm 2,5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 1 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers do gene alvo (ompA, ompC ou ompD), 2,5 μL de template, 0,5 μL de Taq DNA polimerase e 17,5 μL de ddH2O.
    1. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 60 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10min.
  5. Realizar PCR em tempo real utilizando kit RT-PCR verde SYBR em instrumento RT-PCT em triplicatas.
    1. Utilizar os seguintes componentes da reação de PCR: 10 μL de tampão SYBR 2x, 0,4 μL de primer forward e primer reverso respectivamente, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μL de cDNA e 6,8 μL de RNase free H2O.
    2. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 95 °C por 1 min por um ciclo; 95 °C por 5 s, 60 °C por 34 s por 40 ciclos.
    3. Normalizar todos os dados para o giro gênico de referência endógeno. Utilizar o método 2-Δ ΔCT para quantificação dos dados15.

6. Ensaios de virulência

  1. Culturas SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC em LB de meio a início de fase estacionária (OD600 de 2-3) a 24 °C, colher por centrifugação e diluir para CFU mL-1 apropriado em PBS estéril.
  2. Para infecções em camundongos, diluir as cepas cultivadas para 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL e 103 UFC/200 μL gradientes ressuspensions. Infectar grupos de cinco camundongos Balb/c de 6-8 semanas de idade por cepa por injeção subcutânea. Injetar no grupo controle 200 μL de solução salina fisiológica.
  3. Para infecções em frangos, diluir acima de três cepas para 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL e 109 UFC/200 μL gradientes ressuspensions. Infectar grupos de vinte galinhas de 1 dia de idade por cepa por injeção subcutânea.
  4. Monitorar sinais de doenças e mortes de animais experimentais diariamente. Calcular a DL50 (dose letal mediana) 14 d pós-infecção, conforme descrito anteriormente16. Processar os dados usando um software de análise de dados.
  5. Em grupos de infecção, colete o coração, fígado, baço, pulmão e rim de pintinhos recém-mortos. Pesar 0,5 g dos tecidos acima separadamente e triturá-los com operação estéril. Diluir as amostras de moagem gradualmente, espalhar-as em placa LB e cultivar por 8-10 h a 37 °C. Registrar a quantidade de cepas de Salmonella colonizadas em tecidos de pintinhos.

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Resultados

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Construção do mutante 50336Δ micC e linhagem complementada 50336Δ micC /p micC
O resultado do clone do gene micC indicou que este gene era composto por 109 pb mostrando 100% de identidade com o de S. Typhimurium. Com base nos dados de sequência, o mutante de deleção 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/pmicC foram constr...

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Discussão

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S. A enteritidis é um importante patógeno intracelular facultativo que pode infectar galinhas jovens e produzir sintomas desde enterite até infecção sistêmica e morte17,18. Além disso, S. Enteritidis causa infecções latentes em frangos adultos e portadores crônicos contaminam produtos avícolas, resultando em infecções transmitidas por alimentos em humanos19. O mecanismo patogênico de S. Enteritidis ainda precisa ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência da China (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), Um Projeto Financiado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
dextroseSangon BiotechA610219para preparação de caldo
Kit de purificação de DNATIANGENDP214para purificação de DNA
Ex Taq TaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Reagentequímico 10017608para preparação de caldo
K2HPO4Sinopharm ReagenteQuímico 20032116para preparação de caldo
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombinação
Mini Kit de PlasmídeoTIANGENDP106extração de plasmídeo
NaClSinopharm Reagente Químico10019308para preparação
de caldo(NH4)2SO4Sinopharm Reagente Químico10002917para preparação de caldo
PrimeScriptRRT Kit de reagente com borracha gDNA TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Ligação
TRIzol Invitrogen15596018RNA isolamento
TriptonaOxóideLP0042para preparação de caldo
Extrato de leveduraOxóideLP0021para preparação de caldo
centrífugaEppendorf5418centrifugação
Aparelho de eletroforeseBio-Rad164-5050Eletroforese
  Sistema de ElectroporaçãoBio-Rad165-2100para transformação bacteriana
EspectrofotômetroBioTek EpochDetecção de absorbância
Sistema de PCR em tempo realSistema Applied Biosystems7500qRT-PCR

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

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