Segmentando o crescimento de células endoteliais em placas de 6-bem em um agitador orbital para estudos mecanobiológicos

Kuin  T. Pang; Mean Ghim; Mehwish Arshad; Xiaomeng Wang; Peter  D. Weinberg

doi:10.3791/61817

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Artigo de método

Segmentando o crescimento de células endoteliais em placas de 6-bem em um agitador orbital para estudos mecanobiológicos

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DOI:

10.3791/61817

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3 de junho de 2021

Kuin T. Pang^*¹^,² , Mean Ghim^*¹ , Mehwish Arshad¹ , Xiaomeng Wang²^,³^,⁴ , Peter D. Weinberg¹

¹Department of Bioengineering, Imperial College London, ²Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), ³Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Singapore, ⁴Singapore Eye Research Institute, The Academia

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método de revestimento para restringir o crescimento de células endoteliais a uma região específica de uma placa de 6 poços para aplicação de estresse de tesoura usando o modelo de agitador orbital.

Resumo

O estresse de cisalhamento imposto na parede arterial pelo fluxo de sangue afeta a morfologia e função das células endoteliais. Tensões de calha de baixa magnitude, oscilação e multidirecional foram postuladas para estimular um fenótipo pró-aterosclerótico em células endoteliais, enquanto alta magnitude e tesoura unidirecional ou uniaxial são pensadas para promover a homeostase endotelial. Essas hipóteses requerem uma investigação mais aprofundada, mas as técnicas in vitro tradicionais têm limitações, e são particularmente pobres em impor tensões multidirecionais nas células.

Um método que está ganhando uso crescente é cultivar células endoteliais em placas multi-bem padrão na plataforma de um agitador orbital; neste método simples, de baixo custo, de alto rendimento e crônico, o meio giratório produz diferentes padrões e magnitudes de tesoura, incluindo tesoura multidirecional, em diferentes partes do poço. No entanto, tem uma limitação significativa: as células de uma região, expostas a um tipo de fluxo, podem liberar mediadores para o meio que afetam células em outras partes do poço, expostas a diferentes fluxos, distorcendo assim a relação aparente entre fluxo e fenótipo.

Aqui apresentamos uma modificação fácil e acessível do método que permite que as células sejam expostas apenas a características específicas de estresse de corte. A semeadura celular é restrita a uma região definida do poço, revestindo a região de interesse com fibronectina, seguida pela passivação utilizando solução passivating. Posteriormente, as placas podem ser giradas no agitador, resultando na exposição de células a perfis de tesoura bem definidos, como tesoura multidirecional de baixa magnitude ou tesoura uniaxial de alta magnitude, dependendo de sua localização. Como antes, o uso de plásticos de cultura celular padrão permite uma análise direta das células. A modificação já permitiu a demonstração de mediadores solúveis, liberados do endotélio sob características de estresse de tesoura definidas, que afetam células localizadas em outros lugares do poço.

Introdução

As respostas das células vasculares ao seu ambiente mecânico são importantes na função normal dos vasos sanguíneos e no desenvolvimento da doença¹. A mecanobiologia das células endoteliais (CES) que revestem a superfície interior de todos os vasos sanguíneos tem sido um foco particular da pesquisa mecanobiológica porque os CEs experimentam diretamente o estresse de cisalhamento gerado pelo fluxo sanguíneo sobre eles. Várias alterações fenotípicas, como respostas inflamatórias, rigidez e morfologia alteradas, liberação de substâncias vasoativas, e a localização e expressão de proteínas juncionais dependem da exposição da CE ao estresse de tesour....