Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Resumo

Aqui apresentamos um método de limpeza de tecido hidrofóbico que permite a visualização de moléculas-alvo como parte de estruturas cerebrais intactas. Esta técnica foi validada para o controle F344/N e ratos transgênicos HIV-1 de ambos os sexos.

Resumo

Os métodos de limpeza de tecidos hidrofóbicos são procedimentos facilmente ajustáveis, rápidos e de baixo custo que permitem o estudo de uma molécula de interesse em amostras de tecidos não endalterados. Os procedimentos tradicionais de imunolabelação requerem o corte da amostra em seções finas, o que restringe a capacidade de rotular e examinar estruturas intactas. No entanto, se o tecido cerebral pode permanecer intacto durante o processamento, estruturas e circuitos podem permanecer intactos para a análise. Métodos de limpeza previamente estabelecidos levam tempo significativo para limpar completamente o tecido, e os produtos químicos severos podem muitas vezes danificar anticorpos sensíveis. O método iDISCO limpa rapidamente e completamente o tecido, é compatível com muitos anticorpos e não requer nenhum equipamento de laboratório especial. Esta técnica foi inicialmente validada para o uso em tecido de camundongos, mas o protocolo atual adapta esse método a hemisférios de imagem de control e cérebros de ratos transgênicos. Além disso, o presente protocolo também faz vários ajustes no protocolo pré-existente para fornecer imagens mais claras com menor coloração de fundo. Os anticorpos para Iba-1 e hidroxilase de tyrosina foram validados no rato transgênico HIV-1 e em ratos de controle F344/N usando o presente método de limpeza de tecido hidrofóbico. O cérebro é uma rede entrelaçada, onde as estruturas trabalham juntas mais frequentemente do que separadamente umas das outras. Analisar o cérebro como um todo o sistema em oposição a uma combinação de peças individuais é o maior benefício de todo esse método de limpeza cerebral.

Introdução

Várias técnicas de limpeza tecidual foram validadas para uso no cérebro: hidrogel, hidrofílico e hidrofóbico. Essas técnicas visam tornar um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação através da administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índice de refração do meio de imagem escolhido, uma imagem clara da amostra pode ser obtida. Técnicas baseadas em hidrogel, como clarity, protegem biomoléculas no tecido ligando-as a hidrogéis à base de acríl, o que evita danos estruturais e perda de proteínas¹. No entanto, as técnicas de hidrogel utilizam produtos químicos sever....

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul.

1. Preparação da solução de estoque

1. Solução 1 (1 L): A 900 mL de H₂O desionizado adicione 100 mL de salina tamponada de fosfato de 10x (PBS) e 2 mL de Triton X-100.
2. Solução 2 (1 L): A 900 mL de H₂O desionizado, adicione 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 e 1 mL de solução de estoque heparin de 10 mg/mL.
3. Solução 3 (500 mL): A 400 mL da Solução 1, adicione 11,5 g de glicina e 100 mL de dimetilsulfoxida (DMSO).
4. Solução 4 (50 mL): A 42 mL da Solução ....

Resultados

A limpeza completa de grandes seções do tecido cerebral de rato F344/N e HIV-1 foi alcançada usando este protocolo de limpeza de tecido hidrofóbico modificado. A Figura 1 exibe uma imagem confocal típica para TH na região de nigra substantia. A Figura 1A representa uma mancha densa e positiva. Áreas densas como essas podem ser analisadas focando-se através do plano "Z" para confirmar a coloração positiva e a morfologia celular adequada. A Fi.......

Discussão

A limpeza de tecidos oferece uma solução para as limitações do protocolo IHC tradicional. Uma amostra transparente minimiza a dispersão e absorção da luz, que fornece acesso óptico de nível celular a tecidos intactos^18,19. As técnicas de limpeza de tecidos tornam um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação com a administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índice de refração do mei.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Subunidade B da toxina do cólera (recombinante), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
	Glycine Fisher Chemical	G46-500
Cabra anti-coelho Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Soro de cabra	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparina	Acros Organics	41121-0010
Iba1 anticorpo primário	FUJIFILM Wako	019-19741
Epóxi Kwik-sil	VWR	70730-062
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Máquina de perfusão	VWR	70730-062	mini bomba de fluxo variável
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH anticorpo primário	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500