Artigo de método

Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

DOI:

10.3791/61824

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10 de dezembro de 2020

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1Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS), Eindhoven University of Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste protocolo é executar uma co-cultura dinâmica de macrófagos humanos e miofibroblasts em andaimes eletroscarados tubulares para investigar a regeneração de tecidos conduzidos por materiais, usando um bioreator que permite o desacoplamento do estresse da tesoura e do estiramento cíclico.

Resumo

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O uso de biomateriais resorbáveis para induzir a regeneração diretamente no corpo é uma estratégia atraente do ponto de vista translacional. Tais materiais induzem uma resposta inflamatória após a implantação, que é o condutor da posterior resorção do material e da regeneração de novos tecidos. Essa estratégia, também conhecida como engenharia de tecidos in situ, é perseguida para obter substituições cardiovasculares, como enxertos vasculares projetados por tecidos. Tanto os processos inflamatórios quanto os regenerativos são determinados pelas pistas biomecânicas locais no andaime (ou seja, estresse de estiramento e calha). Aqui, descrevemos em detalhes o uso de um bioreator desenvolvido sob medida que permite exclusivamente a dissociação do estresse de estiramento e tesoura em um andaime tubular. Isso permite a avaliação sistemática e padronizada da capacidade inflamatória e regenerativa dos andaimes tubulares sob a influência de cargas mecânicas bem controladas, que demonstramos com base em um experimento dinâmico de co-cultura usando macrófagos humanos e miofibroblasts. As principais etapas práticas dessa abordagem — a construção e a configuração do bioreator, a preparação dos andaimes e a semeadura de células, a aplicação e a manutenção do fluxo de estiramento e cisalhamento e a colheita de amostras para análise — são discutidas detalhadamente.

Introdução

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A engenharia de tecidos cardiovasculares (TE) está sendo perseguida como opção alternativa de tratamento às próteses cardiovasculares permanentes atualmente utilizadas (por exemplo, enxertos vasculares, substituições de válvulas cardíacas), que são subótimas para grandes coortes de pacientes1,2,3,4. Aplicações muito procuradas incluem enxertos vasculares (TEVGs)5,6 e válvulas cardíacas (TEHVs)7,8. Na maioria das vezes, as metodologias cardiovasculares de TE fazem uso de biomateriais resorbáveis (naturais ou sintéticos) que servem como um andaime instrutivo para a formação do novo tecido. A formação de novos tecidos pode ser projetada completamente in vitro, semeando o andaime com células e culminando em um bioreator antes da implantação (te in vitro)9,10,11, ou diretamente in situ, em que o andaime sintético é implantado sem pré-cultivo, a fim de induzir a formação de novos tecidos diretamente no corpo (in situ TE)12,13,14. Tanto para abordagens in vitro quanto in situ cardiovascular TE, a regeneração funcional bem sucedida é predominantemente dependente tanto da resposta imune do hospedeiro à construção implantada quanto do carregamento biomecânico adequado.

A importância do carregamento biomecânico para te cardiovascular é bem reconhecida15. No caso dos implantes cardiovasculares, as células que povoam o andaime são expostas ao estiramento cíclico e estresses de cisalhamento que surgem como resultado do ambiente hemodinâmico. Inúmeros estudos têm relatado o efeito estimulante do estiramento (cíclico) na formação de componentes matriciais, como o colágeno16,17,18,19, glicosaminoglicas (GAGs)20e elastina21,22, por vários tipos de células. Por exemplo, Huang et al. demonstraram que o estiramento biaxial elevou a deposição e organização do colágeno e da elastina em TEVGs in vitro usando um bioreator vascular23. Embora a ênfase tipicamente reside no alongamento como a carga dominante, esses estudos muitas vezes fazem uso de bioreatores orientados pelo fluxo em que a amostra também é exposta ao fluxo de cisalhamento. Embora relativamente pouco se saiba sobre a influência isolada das tensões de tesoura na formação de tecidos e inflamação em 3D, alguns dados estão disponíveis. Por exemplo, Hinderer et al. e Eoh et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento, além de uma microestrutura de andaime 3D, foi importante para a formação de elastina madura por células musculares vasculares humanas em um sistema de modelo in vitro24,25. Ao todo, esses achados ilustram a relevância tanto do alongamento cíclico quanto do estresse de cisalhamento para te cardiovascular.

Outro determinante importante para o sucesso ou falha dos implantes de TE é a resposta imune do hospedeiro ao enxerto implantado26. Isso é particularmente importante para estratégias de TE in situ in situ, que realmente contam com a resposta inflamatória aguda ao andaime para iniciar os processos subsequentes de influxo celular e formação de tecido endógeno e remodelação27. O macrófago é um iniciador crítico da regeneração do tecido funcional, que tem sido mostrado por múltiplos estudos28,29,30. Análoga à cicatrização de feridas, a regeneração do tecido é regida pela sinalização paracrina entre macrófagos e células produtoras de tecidos, como fibroblastos e miofibroblasts31,32,33. Além de coordenar a nova deposição tecidual, os macrófagos estão envolvidos na resorção ativa do material do andaime estrangeiro34,35. Como tal, a resposta in vitro de macrófago a um bioma material foi identificada como parâmetro preditivo para o sucesso in vivo dos implantes36,37,38.

A resposta do macrófago a um andaime implantado depende de características de design de andaimes, como composição de material e microestrutura35,39,40. Além das propriedades do andaime, a resposta do macrófago a um andaime e seu crosstalk com myofibroblasts também é impactada por cargas hemodinâmicas. Por exemplo, o estiramento cíclico mostrou-se um importante modulador do fenótipo macrófago41,42,43,44 e a secreção de citocinas43,44,45,46 em andaimes eletroscardos 3D. Utilizando um sistema de co-cultura de macrófagos e células musculares lisas vasculares, Battiston et al. demonstraram que a presença de macrófagos levou ao aumento dos níveis de elastina e GAGs e que níveis moderados de estiramento cíclico (1,07-1,10) estimularam a deposição do colágeno I e elastina47. Em trabalhos anteriores, demonstramos que o estresse da cisalhamento é um importante determinante para o recrutamento de monócitos em andaimes eletroscados3D 48,49, e que tanto o estresse da cisalhamento quanto o estiramento cíclico impactam a sinalização paracrina entre monócitos humanos e células estrômicas mesenquimais50. Fahy et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias por monócitos humanos51.

Em conjunto, as evidências acima mostram que uma compreensão adequada e controle sobre cargas hemodinâmicas é crucial para o TE cardiovascular, e que é importante considerar a resposta inflamatória para conseguir isso. Inúmeros bioreatores foram descritos anteriormente para a cultura in vitro52,53,54,55,56,57,58 ou ex vivo59,60,61 cultura de tecidos cardiovasculares. No entanto, todos esses sistemas são projetados para imitar as condições fisiológicas de carregamento hemodinâmico tanto quanto possível. Embora isso seja altamente valioso para o propósito de criar tecidos cardiovasculares in vitro ou manter culturas ex vivo, tais sistemas não permitem estudos sistemáticos sobre os efeitos individuais das pistas individuais. Isso ocorre porque a aplicação tanto do estresse cíclico quanto do cisalhamento nesses bioreatores é impulsionada pelo mesmo fluxo pressurizado, que os liga intrinsecamente. Embora microsistemas que permitam manipulação mecânica precisa de várias pistas tenham sido descritos para substratos2D configurações de hidrogel 62 ou 3D63,64, tais configurações não permitem a incorporação de andaimes biomateriais 3D elastoméricos.

Aqui, apresentamos a aplicação de um sistema bioreator tubular que permite exclusivamente o desacoplamento do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico e ajuda a investigar mecanicamente seus efeitos individuais e combinados. Este sistema permite testar uma ampla variedade de enxertos vasculares projetados por tecido (por exemplo, origem sintética ou natural, microarquiteção diferente, várias porosidades). Para efetivamente desacoplar a aplicação do estresse e do alongamento da tesoura, os conceitos-chave que o bioreator usa são (1) separação do controle do estresse e do estiramento da tesoura usando sistemas de bomba distintos e (2) estimulação dos andaimes de forma "de dentro para fora" com dimensões computacionalmente orientadas. O fluxo é aplicado na superfície externa do andaime tubular através do uso de uma bomba de fluxo, enquanto o trecho circunferencial do andaime é induzido pela expansão de um tubo de silicone no qual o andaime é montado através do uso de uma bomba de tensão separada. As dimensões do tubo de silicone e do tubo de vidro que contém a construção são cuidadosamente escolhidas e validadas por meio de simulações de dinâmica computacional de fluidos, para garantir que o estresse da cisalhamento no andaime (devido ao fluxo) e o estiramento circunferencial (devido à expansão do tubo) não afetem significativamente uns aos outros. Este design de dentro para fora tem várias lógicas práticas. Se o estiramento for aplicado pela pressão do fluido luminal (semelhante ao carregamento fisiológico), ele requer inerentemente que o desenho da amostra seja livre de vazamentos. Além disso, a pressão necessária para esticar a amostra seria completamente determinada pela rigidez amostral, que pode variar entre amostras e dentro de uma amostra ao longo do tempo, dificultando o controle do trecho. Este bioreator monta o enxerto de tecido projetado em torno de um tubo de silicone e permite a aplicação de estresse de corte de parede (WSS) na parede externa do enxerto e pressuriza o enxerto por dentro. Dessa forma, condições iguais de carregamento entre amostras e dentro das amostras ao longo do tempo podem ser garantidas, e, além disso, as amostras podem ser vazadas, como é comum para andaimes vasculares porosos19. Este bioreator de dentro para fora destina-se especificamente a estudos sistemáticos sobre os efeitos da tesoura e/ou alongamento, em vez da engenharia de um vaso sanguíneo nativo in vitro, para o qual as configurações tradicionais de bioreatores vasculares são mais adequadas. Consulte a Figura 1A-B para os desenhos de design bioreator, e sua tabela correspondente 1 para uma descrição funcional e racionalidade por trás dos principais componentes do bioreator.

O uso do bioreator é demonstrado com base em uma série de estudos recentes do nosso grupo em que investigamos as influências individuais e combinadas do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e formação tecidual em andaimes eletrosopunis resorbáveis para in situ tecido cardiovascular19,43,44. Para isso, usamos macrófagos humanos e miofibroblasts em mono ou em co-cultura para simular as várias fases da cascata regenerativa in situ. Demonstramos que a secreção de citocinas por macrófagos humanos é claramente impactada tanto pelo estresse do estiramento cíclico quanto pelo cisalhamento, afetando a deposição matricial e a organização por myofibroblasts humanos nestes andaimes, tanto via sinalização paracririna quanto pelo contato direto19,43,44. Notavelmente, esses estudos revelaram que, no caso da aplicação combinada de estresse e alongamento da tesoura, os efeitos na formação e inflamação tecidual são dominados por uma das duas cargas, ou há efeitos sinérgicos de ambas as cargas. Esses achados ilustram a relevância da desacoplamento de ambas as cargas para obter uma melhor compreensão da contribuição do ambiente mecânico nos processos de TE. Esse entendimento pode ser aplicado para otimizar sistematicamente parâmetros de design de andaimes em regimes de carregamento hemodinâmicos relevantes. Além disso, os dados mecanicistas de ambientes tão bem controlados podem servir de entrada para modelos numéricos que estão sendo desenvolvidos para prever o curso da remodelação de tecidos in situ, como relatado recentemente para TEVGs65 ou TEHVs66, para melhorar ainda mais a capacidade preditiva.

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Protocolo

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Nos estudos descritos neste protocolo, macrófagos humanos primários isolados de casacos periféricos de sangue e miofibroblasts humanos isolados da veia safena após cirurgia coronariana por passagem foram utilizados44. Os casacos buffy foram obtidos de voluntários saudáveis e anonimizados que forneceram consentimento por escrito informado, que foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica Institucional da Sanquin Research. O uso de células vena saphena humanas (HVSCs) foi de acordo com o "Código De Uso Secundário Adequado do Tecido Humano" desenvolvido pela Federação das Sociedades Médicas (FMWV) nos Países Baixos.

1. Preparações Gerais e Ações Necessárias Antes de Configurar o Bioreator

NOTA: Para obter detalhes sobre os respectivos protocolos de isolamento e cultivo, consulte o trabalho anterior19,43,44. Todos os cálculos no protocolo são dados como exemplos para um experimento de co-cultura com monócitos e miofibroblasts, semeados em 8 andaimes carregados hemodinamicamente e 2 controles estáticos (n=10).

  1. Comece o isolamento celular e a cultura celular. As densidades de semeadura para as amostras co-cultivadas de monócitos e miofibroblasts (com uma razão de semeadura de 2:1) são de 30 × 106 monócitos/cm3 e 15 × 106 miofibroblasts/cm3, respectivamente.
    NOTA: O material eletrospun tem alta porosidade (>90%). Para estimar o número necessário de células por enxerto, o volume do andaime é calculado com a fórmula para o volume de um cilindro oco: π*(espessura)2*comprimento ≈ 0,04 cm3. A quantidade total de células por enxerto é de 1,2 × 106 monócitos e 0,6 × 106 miofibroblasts. Para 10 amostras, são necessários pelo menos 12 × 106 monócitos e 6 × 106 miofibroblasts; começar com até ~10-15% mais células para explicar possíveis erros de pipetação.
  2. Degas o meio de cultura celular que será usado para experimentos envolvendo o bioreator.
    1. Prepare o meio para coculturas, que consiste em RPMI-1640:aDMEM (1:1), complementado com 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina e 0,5% L-glutamina.
    2. Coloque o meio durante a noite (O/N) em uma incubadora em um frasco de cultura celular com tampa de filtro para degas.
    3. Substitua a tampa do filtro por uma tampa apertada e armazene a 4 °C.
    4. Pouco antes do uso, adicione 0,25 mg/mL L-ácido ascórbico L 2-fosfato (vitamina C) ao meio.
      NOTA: Para os cálculos, a quantidade de média exigida por câmara de cultura de fluxo é de 50 mL. Refrescar o meio três vezes por semana; O meio velho de 25 mL é substituído por um meio fresco de 25 mL. Para 10 amostras; após a semeadura, é necessário um total de 500 mL de meio fresco, e para cada alteração média subsequente, é utilizado um total de 250 mL de meio fresco. Prepare sempre o meio fresco, especialmente, a vitamina C deve ser adicionada pouco antes de mudar o meio.
  3. Prepare andaimes eletroscópidos isotrópicos (3 mm de diâmetro luminal, 200 μm de espessura da parede), conforme descrito por Van Haaften et al.19 (Figura 1G-I). Em suma, os andaimes de policaprolactona tubular (PCL-BU) são produzidos por eletropinning a partir de 15% (w/w) soluções de clorofórmio-polímero. As soluções de polímero são eletrospunadas à temperatura ambiente e 30% de umidade relativa, a uma vazão de 40 μL/min, 16 cm de distância do alvo cilíndrico rotativo (Ø 3 mm, 500 rpm), e uma tensão aplicada de 16 kV no bocal de eletropinning e -1 kV no alvo.
    NOTA: Embora os enxertos PCL-BU tenham sido utilizados para esses experimentos, uma grande variedade de enxertos de tecido elastomérico podem ser montados neste bioreator (por exemplo, de diferentes origens sintéticas ou naturais, microarquiteturas diferentes, porosidades diferentes)
    1. Remova os andaimes eletrospundos do mandril.
      1. Faça um pequeno furo na tampa de um tubo de 15 mL para 'segurar' o mandril no centro e evitar que ele toque na parede do tubo.
      2. Coloque o mandril com o andaime eletrospun no tubo falcão e encha-o com água deionizada.
      3. Congele os tubos O/N a -20 °C.
      4. Coloque os tubos em temperatura ambiente (RT) e retire os mandrels após alguns minutos, deixando os enxertos eletrospun no gelo.
      5. Deixe o gelo descongelar completamente, remova o tubo eletrospun da água descongelada e 'pendure' para secar verticalmente por várias horas. Certifique-se de que os andaimes não 'colapsam' sob seu próprio peso.
    2. Andaimes secos sob vácuo O/N.
    3. Imagem uma pequena amostra dos enxertos eletrospun usando microscopia eletrônica de varredura (SEM) para avaliar sua microestrutura (por exemplo, morfologia de fibras, diâmetro da fibra). Os enxertos nos estudos de exemplo têm orientação de fibra isotrópica e diâmetro de fibra de 5 μm(Figura 1H-I).
  4. Um dia antes de iniciar o experimento, coloque o reservatório hidráulico cheio de água deionizada na incubadora. Feche todas as oito conexões para câmaras de cultura de fluxo com tampas brancas de Luer. Conecte-se ao sistema de ar comprimido e insira o sensor de pressão. Execute a bomba de tensão (ver passo 5.6) O/N para permitir uma pequena expansão do foles de Teflon.
    NOTA: Certifique-se de que todos os materiais e equipamentos necessários sejam limpos e/ou autoclavados (ver Tabela de Materiais,Comentários/Descrição da coluna para os quais os materiais podem ser autoclavados), de acordo com o protocolo do fabricante ou conforme descrito nas etapas 7.3-7.6.
  5. Assegurar condições de trabalho estéreis para o restante do protocolo.
    1. Execute as etapas 2-5.3 (configuração do sistema), passo 6.3 (mudança média) e etapas 7.1-7.2 (colheita de construções vasculares) em um armário de fluxo laminar estéril.
    2. Coloque materiais que não sejam diretamente necessários para as etapas subsequentes em pratos fechados de Petri para manter tudo o mais limpo possível.
    3. Superfícies de material limpo ou seco regularmente, encharcando um tecido de papel com 70% de etanol, e limpam as superfícies dos componentes bioreatores e do gabinete de fluxo laminar.

2. Configuração do Bioreator

NOTA: Realize o passo 2 em um gabinete de fluxo laminar.

  1. Corte os andaimes eletrospunos em tubos de aproximadamente 25 mm de comprimento e documente-os antes do uso (por exemplo, fotografe para o comprimento, pese com equilíbrio para a massa inicial).
  2. Descontaminar os andaimes eletroscarados.
    1. Coloque os andaimes eletrospunos inclinados em uma placa de poço ou placa de Petri, com uma abertura voltada para a fonte de luz ultravioleta (UV), para permitir que a luz UV (253,7 nm) ilumine o interior dos andaimes.
    2. Exponha os andaimes eletrospunos à luz UV por 5 minutos.
    3. Vire todos os andaimes e repita a iluminação UV para a outra abertura.
      NOTA: Após esta etapa, só toque no andaime eletroscado quando necessário. Use sempre pinças limpas ou luvas limpas.
    4. Pegue os tubos de vidro das câmaras de cultura de fluxo que são armazenados em 70%, lave os tubos de vidro em água ultrapura, seque e coloque em uma grande placa de Petri fechada.
      NOTA: As etapas a seguir, especialmente as etapas 2.3-2.5, são idealmente realizadas por dois experimentadores.
  3. Monte os andaimes eletrospunes na tubulação de silicone.
    1. Conecte a sutura de 5-0 prolene a uma extremidade da tubulação de silicone, tomando a sutura através de um lado do tubo e para fora do outro, deixando duas suturas esticadas opostas abrangendo a seção transversal do tubo. Faça um pequeno nó em ambos os lados do tubo enquanto comprime o tubo no lócus dos nós e deixe aproximadamente 10 cm de fio em ambos os nós. Faça um terceiro nó no final dos dois fios de 10 cm que sobraram.
      1. Corte a agulha de sutura e todos os fios livres que possam se destacar e danificar o interior do andaime eletrospun. Corte as bordas da tubulação de silicone em uma forma triangular para ajudar a puxar a tubulação de silicone através do andaime eletrospun.
    2. Mergulhe o andaime eletrospun em 30% de etanol (isso serve como etapa extra de descontaminação e auxilia no deslizamento do andaime eletrospun sobre a tubulação de silício) e coloque o andaime eletrospun sobre o fio livre de 10 cm. Experimentador A estica a tubulação de silicone puxando suavemente tanto a tubulação de silicone quanto o nó do fio de sutura de 10 cm, enquanto o experimentador B desliza suavemente o andaime eletrospun sobre a tubulação de silicone usando pinças com uma ponta interna lisa para evitar danos nos andaimes.
    3. Solte lentamente o estiramento na tubulação de silicone, ao mesmo tempo em que suavize simultaneamente o andaime eletroscarado com pinças. Mergulhe o andaime eletrospun na tubulação de silicone em água ultrapura duas vezes.
      NOTA: É possível que ocorra alguma ruga do andaime eletroscado. Esta ruga desaparecerá durante o pré-alongamento aplicado antes de fixar os andaimes nos conduítes de pressão na etapa 2.5.3.
    4. Repita as etapas 2.3.2 e 2.3.3 para os outros andaimes eletrospunos. Dependendo do comprimento da tubulação de silicone, vários andaimes eletrospun podem ser montados na mesma tubulação de silicone.
    5. Quando todos os andaimes eletroscaridos forem montados na tubulação de silicone, corte a tubulação de silicone ao redor dos andaimes, tudo para o mesmo comprimento (5,5 cm); de um lado, perto da extremidade do andaime eletrospun, do outro lado, deixando ~2-3 cm de tubo de silicone livre.
  4. Construa o compartimento inferior da câmara de cultura de fluxo(Figura 1A-B).
    1. Pegue a parte superior do compartimento inferior contendo a saída de fluxo e feche a saída de fluxo com um plugue Luer masculino.
    2. Empurre o conduíte de pressão com furos através do compartimento inferior, e coloque um anel O de silicone ao redor da extremidade inferior do conduíte de pressão para evitar vazamentos. Enrosque a parte inferior do compartimento inferior até a parte superior do compartimento inferior para fixar o conduíte de pressão. Certifique-se de que a ranhura mais baixa do conduíte de pressão esteja aproximadamente 3-5 mm acima da borda da bucha adaptador do compartimento inferior; isso mais tarde vai 'segurar' o nó apertado do fio de sutura, fixando o andaime eletrospun sobre a tubulação de silicone.
      NOTA: Se o conduíte de pressão pode ser facilmente manobrado para cima e para baixo, indica que o compartimento inferior não está bem protegido. Repita o passo 2.4.2 para evitar vazamentos em estágios posteriores(Figura 2D).
  5. Fixar a tubulação de silicone com o andaime eletroscarado no conduíte de pressão.
    1. Puxe o tubo de silicone com o andaime eletrospundo sobre o conduíte de pressão.
    2. Faça um nó com o fio de sutura na extremidade inferior do andaime eletrospun no local da ranhura gravada no conduíte de pressão. Faça um segundo nó no lado oposto para fixar firmemente a tubulação de silicone com o enxerto eletrospun.
      ATENÇÃO: Este é um passo crítico. Certifique-se de que o nó exatamente 'cai' na ranhura gravada do conduíte de pressão para evitar o vazamento da água do reservatório hidráulico para as câmaras de cultura de fluxo. Se não tiver certeza, tente apertar o fio de sutura em várias posições, acima ou abaixo do local esperado da ranhura, para garantir que os nós finais estejam exatamente na ranhura gravada(Figura 2A).
    3. Coloque o grampo da tesoura na extremidade superior do tubo de silicone, e estique a tubulação de silicone para cima (isso vai testar diretamente o primeiro nó, se for possível mover a tubulação de silicone com o andaime eletrospun sobre o conduíte de pressão, não foi bem apertado o suficiente). Com a força de puxar, a tubulação de silicone é pré-esticada. Para garantir que a tubulação de silicone seja consistente entre as diferentes amostras, conecte uma régua ao grampo da tesoura. Puxe o grampo da tesoura para cima até que a extremidade inferior da régua atinja a altura da extremidade inferior do andaime.
      NOTA: É importante manter o pré-alongamento em cada amostra aproximadamente o mesmo (~5%) por dois motivos: (1) se a tubulação de silicone for pré-esticada, resultará em uma expansão mais homogênea ao longo do comprimento da amostra quando pressurizada; (2) o pré-alongamento impactará as propriedades mecânicas do silicone, portanto deve ser o mesmo em todas as amostras para garantir condições iguais de estiramento entre as amostras.
    4. Remova as rugas no andaime eletrospun, puxando suavemente o andaime eletrospun. Novamente, faça dois nós em ambos os lados com um fio de sutura na extremidade superior do andaime na localização da ranhura gravada superior no conduíte de pressão.
    5. Solte o grampo da tesoura e corte o excesso de tubos de silicone com uma faca, deixando 20 a 30% da rosca coberta com tubo de silicone, para evitar vazamentos quando o cone do nariz estiver montado na rosca do parafuso.
      NOTA: Repita as etapas 2.4 e 2.5 para todas as amostras dinâmicas.
    6. Para as amostras de controle estático, fixe o andaime eletrospun montado na tubulação de silicone em conduítes de pressão sem furos. Estes conduítes podem ser mantidos separadamente em um tubo de 15 mL até a semeadura (passo 4) e não precisam ser montados nos compartimentos da câmara de cultura de fluxo.
  6. Descontaminar as câmaras de cultura de fluxo parcialmente construídas com andaime eletrospun expondo-o à luz UV por 10 minutos. Gire as câmaras de cultura de fluxo com andaimes eletrospunos para o outro lado, e repita a exposição à luz UV por 10 minutos.
  7. Enrosque os cones do nariz na rosca do parafuso dos conduítes de pressão com orifícios para as amostras dinâmicas.
    1. Certifique-se de que a extremidade superior da tubulação de silicone se encaixa no cone do nariz para evitar vazamentos em estágios posteriores. Se houver muita tubulação de silicone, corte o excesso de tubos com uma faca.
    2. Coloque as câmaras de cultura de fluxo parcialmente construídas em uma grande placa de Petri, e aponte o cone do nariz em direção à fonte de luz UV. Aplique a iluminação UV por 5 minutos.
  8. Construção completa da câmara de cultura de fluxo com o tubo de vidro e compartimento superior da câmara de cultura de fluxo(Figura 1A-B).
    1. Pré-molhar os andaimes eletrospun mergulhando o conduíte de pressão com a tubulação de silicone e andaime eletrospun em 30% de etanol, seguido por um mergulho na água ultrauso duas vezes.
    2. Coloque o tubo de vidro sobre o conduíte de pressão e empurre suavemente no compartimento inferior e segure-o suavemente.
    3. Pegue o compartimento superior contendo a entrada de fluxo, coloque um anel O de silicone, o alisador de fluxo e a bucha do adaptador na ordem correta(Figura 1A-B),e coloque sobre a extremidade aberta do tubo de vidro e segure-o suavemente.
    4. Enrosque uma tampa luer branca na entrada de fluxo do compartimento superior.
    5. Remova o plugue Luer masculino da saída de fluxo do compartimento inferior e limpe a superfície ao seu redor com um tecido de papel encharcado de etanol.
    6. Coloque uma seringa com 10 mL de água ultrapura na saída de fluxo, abra a tampa branca do Luer no compartimento superior e encha a câmara com água ultrapura. Feche a tampa branca de Luer novamente, remova a seringa, limpe novamente com etanol, e feche a saída de fluxo com um plugue Luer masculino.
      NOTA: Repita as etapas 2.6-2.8 para todas as câmaras de cultura de fluxo.
    7. Para os controles estáticos, adicione 10 mL de água ultrauso aos tubos de 15 mL que seguram as amostras montadas nos conduítes de pressão sem furos.
  9. Coloque todas as câmaras de cultura de fluxo na incubadora. Substitua a água ultrauso por meio de cultura um dia antes da semeadura celular da mesma forma descrita nas etapas 2.8.5 e 2.8.6 (certifique-se de coletar a água ultrapura 'antiga' com um tecido de papel encharcado de etanol colocado diretamente na saída de fluxo).

[O protocolo pode ser pausado aqui]

3. Preparativos para a configuração da bomba de fluxo

NOTA: Realize o passo 3 em um gabinete de fluxo laminar.

  1. Colete todos os materiais de configuração da bomba e prepare-se para uso.
    NOTA: Os experimentadores são encaminhados ao protocolo do fabricante para uma descrição detalhada da configuração da bomba, das unidades fluidas e da tubulação média através das válvulas da unidade fluidica.
    1. Coloque a bomba em 200 mbar de capacidade.
    2. Enrosque os porta-reservatórios de 60 mL para as unidades fluidas.
    3. Limpe os filtros de ar de borracha reutilizáveis com um tecido de papel encharcado de etanol, certifique-se de que o filtro de ar permaneça seco.
  2. Coloque os reservatórios de 60 mL nos porta-reservatórios e coloque o tubo médio padrão através das válvulas da unidade fluidica. Conecte a tubulação média com um diâmetro interno maior com acotradores de fechadura Luer femininos em um laço fechado.
  3. Fixar a tubulação média com um clipe de mangueira, diretamente abaixo dos reservatórios.
  4. Encha os reservatórios com 25 mL de cultura média por reservatório de 60 mL. Solte o clipe da mangueira e deixe o meio entrar na tubulação.
  5. Feche os reservatórios médios com os filtros de ar de borracha e coloque a configuração da bomba de fluxo na incubadora até o passo 4.

4. Semeadura celular usando fibrina como portador de célula

NOTA: Realize o passo 4 em um gabinete de fluxo laminar.

  1. Prepare o gel de fibrina para a etapa de semeadura celular. Para obter detalhes, consulte Mol et al.67 Para o gel de fibrina, a solução de fibrinogênio deve ter uma concentração final de 10 mg/mL (correto para a pureza do estoque de proteínas), e a solução de trombina deve ter uma concentração final de 10 U/mL.
    1. Descongele fibrinogen para RT, antes de pesar ~50 mg (o suficiente para 10 amostras) em um recipiente plástico com uma tampa vermelha.
    2. Adicione meio de cultura celular para preparar a solução fibrinogênio (a uma concentração de 10 mg/mL, correto para a pureza do estoque de proteínas). Misture bem e filtro para esterilizar a solução de fibrinogênio com um filtro de seringa de 0,2 μm em um tubo estéril de 15 mL. Mantenha a solução de fibrinogênio filtrada no gelo.
      NOTA: Evite preparar a solução fibrinogênio com muito tempo de antecedência, caso contrário, o fibrinogênio pode coagular espontaneamente.
    3. Descongele a trombina e faça uma solução de trombina (a uma concentração de 10 U/mL) em meio de cultura celular e coloque no gelo. Prepare a solução de trombbina 20 μL + células por amostra. Para n=10 amostras, são necessários 200 μL; portanto, prepare a solução de trombina de 250 μL para explicar possíveis erros de pipetação.
  2. Coletar e contar as células dos frascos de cultura. Misture as células na razão e quantidade desejadas (1,2 × 106 monócitos e 0,6 × 106 miofibroblasts por andaime). Certifique-se de que há células suficientes para amostras n+1 para corrigir erros de pipetação. Centrifugar a 350 × g por 10 min na RT. Remova o supernatante.
  3. Faça uma mistura das células suspensas e trombina.
    1. Para cada amostra, utilize 20 μL da solução de trombina. Para n=10 amostras, adicione 200 trombina μL à pelota celular e misture. Meça o volume da suspensão celular (células + trombina), e calcule como dividir uniformemente todos os 10 andaimes (por exemplo, se a suspensão da trombina + célula tiver um volume de 260 μL, cada amostra eletrospun receberá 260 amostras de μL/10 = 26 μL de trombbina + suspensão celular).
    2. Como a semeadura dos andaimes é realizada em duas etapas, prepare dois tubos de microfuça de 1,5 mL que conterão metade da suspensão celular para cada andaime (no cálculo do exemplo da etapa anterior: prepare dois tubos com 13 μL de trombina + suspensão celular). Coloque no gelo.
      NOTA: As etapas a seguir, especialmente a etapa 4.4, são realizadas idealmente por dois experimentadores.
  4. Seque os andaimes eletroscarados pré-molhados com vácuo para preparar a semeadura celular.
    1. Conecte uma tubulação pasteur de vidro ao sistema de vácuo do gabinete de fluxo laminar e coloque em um tubo vazio de 50 mL para armazenamento temporário estéril.
    2. Pegue as câmaras de cultura de fluxo da incubadora, remova o plugue Luer masculino da saída de fluxo e remova o meio depois de abrir a tampa branca de Luer e coloque um tecido de papel encharcado de etanol na frente da saída de fluxo.
    3. Tire o compartimento superior e o tubo de vidro, e coloque em uma placa de Petri estéril para armazenamento temporário.
    4. Coloque o tubo pasteur de vácuo no andaime eletrospun e remova o máximo possível de meios.
      ATENÇÃO: A vácuo seque o andaime eletrospune muito suavemente. Em vez de um movimento linear de ida e volta sobre o andaime, coloque o tubo de vácuo em vários locais. Fixar a tubulação de vácuo em cima da tubulação do Pasteur entre os dedos para melhor controle.
    5. Misture a solução fibrinogênio em uma relação 1:1 com a suspensão da trombina + celular (por exemplo, misture 13 μL de fibrinogênio com 13 μL de trombina + suspensão celular). Para garantir que a fibrina polimerize no andaime e não no tubo de microfuge, encobre o fibrinogênio, gire a roda pipeta para o "volume extra" da suspensão da célula thrombin + e encobre uma vez no tubo de microfuge com suspensão celular para misturar.
    6. Gotear diretamente a solução sobre toda a extensão do andaime eletrospun. É aconselhável que o Experimentador A goteja a mistura de fibrina, enquanto o experimentador B segura o compartimento inferior com o andaime eletrospun montado no conduíte de pressão.
    7. Depois que a fibrina com as células é pingada sobre o andaime eletrospun, o Experimentador B move lentamente o andaime, da esquerda para a direita e para cima e para baixo, para dividir ainda mais as células uniformemente sobre o andaime.
    8. Repita o passo 4.4.5 - 4.4.7 do outro lado do andaime eletrospun.
    9. Monte a câmara de cultura de fluxo novamente colocando cuidadosamente o tubo de vidro (evite a aderência de fibrina e coagulação para o lado interno do tubo de vidro) e empurre para trás o compartimento superior da câmara de cultura de fluxo. Coloque diretamente a construção semeada sem qualquer solução salina tamponada de fosfato ou meio (PBS) na câmara de cultura de fluxo na incubadora.
    10. Repetição de passos 4.4.1-4.4.9 para todas as amostras dinâmicas. Para as amostras estáticas montadas em conduítes de pressão sem furos, a semente de acordo com as etapas 4.4.1-4.4.8, e coloque em um tubo de 15 mL depois.
    11. Deixe a fibrina polimerizar por 60 minutos na incubadora.

[O protocolo pode ser pausado aqui por 30-60 min.]

  1. Após a polimerização, preencha as câmaras de cultura de fluxo (amostras dinâmicas) ou os tubos de 15 mL (amostras estáticas) com médio.

5. Acoplamento dos sistemas bioreatores e da bomba de fluxo antes de iniciar o experimento

NOTA: Execute as etapas 5.1-5.3 em um gabinete de fluxo laminar.

  1. Leve a bandeja que carrega as câmaras de cultura de fluxo e as unidades fluidas com reservatórios médios preenchidos e tubos médios conectados dentro dos armários de fluxo laminar.
  2. Posicione as câmaras de cultura de fluxo na base bioreatorial para os grupos experimentais carregados com estiramento cíclico e com cargas hemodinâmicas combinadas(Figura 1E).
    1. Incline a câmara de cultura de fluxo de cabeça para baixo, e encha o conduíte de pressão de baixo com água ultrapura usando uma seringa com tubos finos (este pode ser de qualquer tipo, desde que seja flexível e fino, neste experimento, um fio interno de 10 cm de comprimento e 0,15 mm de diâmetro interno foi anexado à agulha).
    2. Coloque a tubulação fina dentro do conduíte de pressão, e enquanto o conduíte de pressão estiver cheio de água ultrauso, empurrando gradualmente a água para fora da seringa, puxe o fio para fora do conduíte de pressão simultaneamente, para garantir que não haja bolhas de ar dentro do conduíte de pressão.
    3. Coloque a câmara de cultura de fluxo em um dos oito fios de parafuso na base bioreatorial. Coloque um anel O de silicone entre a base do bioreator e o conector Luer branco para evitar possíveis vazamentos e aperte o conector Luer branco do compartimento inferior.
    4. Repita as etapas 5.2.2 e 5.2.3 para todas as amostras ciclicamente esticadas.
  3. Conecte as câmaras de cultura de fluxo para todos os grupos experimentais, exceto o controle estático, ao sistema de bomba de fluxo.
    1. Coloque um clipe de mangueira na tubulação média. Remova a tampa branca de Luer cobrindo a entrada de fluxo do compartimento superior da câmara de cultura de fluxo. Remova o acoplador Luer feminino da tubulação média e conecte a tubulação média de um lado com a entrada de fluxo no compartimento superior, e o outro lado da tubulação média com saída de fluxo no compartimento inferior.
    2. Repita o passo 5.3.1 para todas as câmaras de cultura de fluxo. Neste ponto, o bioreator e as câmaras de cultura de fluxo estão preenchidos com médio e conectado aos sistemas de fluxo.
    3. Para as amostras de controle estático, coloque as amostras verticalmente em um frasco de cultura celular com tampa de filtro usando o grampo da tesoura. Encha o frasco de cultura celular com meio e coloque na incubadora.
  4. Transfira a configuração completa do gabinete de fluxo laminar para a incubadora e conecte as unidades fluidas ao tubo de pressão de ar e ao cabo elétrico.
  5. Inicie o software e inicie as bombas de fluxo. Inicie o fluxo médio para as amostras um a um.
    1. Verifique se as válvulas da unidade fluidica estão clicando.
    2. Remova o grampo da mangueira da tubulação média.
    3. Inicie a bomba de fluxo com 100 mbar e 10 s de tempo de comutação.
    4. Verifique cuidadosamente a direção de fluxo para possíveis vazamentos ou bolhas de ar. Qualquer bolha de ar aprisionada pode ser removida virando a câmara de cultura de fluxo de cabeça para baixo.
      NOTA: Certifique-se de que os níveis médios nos reservatórios médios estejam equilibrados, para evitar a sucção do ar no sistema e bolhas de ar nas câmaras de cultura de fluxo, e para não permitir que os reservatórios sequem(Figura 2C).
    5. Repita o passo 5.5 para todas as unidades fluidas um a um.
  6. Inicialize a bomba de tensão.
    1. Conecte a bomba pneumática acionada através da entrada de ar no cilindro pneumático ao ar comprimido. Conecte a saída de ar inferior com a tubulação azul para saída de ar(Figura 1F).
    2. Abra o software LabVIEW, execute o script LabVIEW e o sistema de aplicação de pressão de ar comprimido, conforme descrito por Van Kelle et al.68, digite deslocamento e frequência (comece com baixa frequência de 0,2 Hz). Pare a bomba quando o fole de Teflon estiver no seu nível mais baixo.
    3. Coloque o sensor de pressão na entrada do sensor de pressão no reservatório hidráulico.
  7. Altere as configurações da bomba para as configurações desejadas (para 1,5 Pa, use 150 mbar, 10 s tempo de comutação).
  8. Inicie a bomba de tensão e aplique a configuração preferida (por exemplo, 0,5 Hz, 1,05 de estiramento).

6. Executar experimento por vários dias; Monitoramento de tesoura e alongamento durante a cultura e substituição média

  1. Calcule o WSS na parede do andaime.
    1. Registo a magnitude do fluxo a cada dois dias (consulte o manual do fabricante da bomba de fluxo para obter detalhes). Em suma, observe a variação dos níveis líquidos (em mL) nos reservatórios médios entre a comutação do reservatório da unidade fluida para 10 s. Realizar pelo menos cinco medições, calcular o valor médio e multiplicar por 6 para obter a taxa de fluxo Q em mL/min.
    2. O fluxo é descrito por um fluxo poiseuille através de um canal anular. Assumindo o meio cultural como um fluido newtoniano, calcule o WSS na parede do andaime, r1, pela Equação 1.
      figure-protocol-1 (1)
      onde o WSS τw na parede do andaime (r1; aqui r1 = 1,7 mm), resultante de um fluxo de estado constante, é determinado pela pressão aplicada p e pelo raio interno do tubo de vidro r2 (aqui r2 = 2,3 mm). O gradiente de pressão na direção axial é considerado uniforme entre a entrada de fluxo e a saída de fluxo e é dado pela Equação 2 (Figura 1J).
      figure-protocol-2 (2)
      com μ a viscosidade dinâmica (aqui a viscosidade média foi assumida constante, μ = 0,7 × 10-3 Pa∙s a 37 °C) e Q a taxa de fluxo aplicada.
  2. Monitore o trecho aplicado nos andaimes a cada dois dias.
    1. Coloque um fundo escuro atrás da câmara de cultura de fluxo para aumentar o contraste entre o andaime e o fundo. Posicione as lâmpadas led, apontando para o andaime, para ajudar na visualização do andaime.
    2. Tire fotos de lapso de tempo do andaime em uma frequência de 30 Hz para 6 s (ou seja, 3 ciclos de estiramento) com uma câmera de alta velocidade.
      NOTA: Uma menor frequência de gravação pode ser suficiente se a câmera permitir. No entanto, a frequência minimamente necessária não foi determinada.
    3. Determine manualmente o diâmetro mínimo e máximo do andaime das imagens.
    4. Calcule o diâmetro externo mínimo e máximo do andaime eletrospun para calcular os trechos máximos de acordo com a Equação 3.
      figure-protocol-3 (3)
      onde o estiramento circunferencial (λφ) é dado pela razão entre o diâmetro externo do andaime, d1, e seu diâmetro inicial, d0.
  3. Corrija para evaporação média e atualize o meio três vezes por semana.
    1. Pare e desvinpe os cabos dos sistemas de fluxo e da bomba de tensão.
    2. Coloque os clipes da mangueira na tubulação média.
    3. Determine quanto médio evaporado com base nas marcas de indicadores de volume nos reservatórios médios.
    4. Transfira a bandeja com o bioreator e as unidades fluidas para o gabinete de fluxo laminar.
    5. Remover os filtros de ar de borracha dos reservatórios médios; adicionar água ultrapura autoclavada para compensar o volume evaporado de meio. Feche os reservatórios médios novamente e conecte-se novamente à bomba para misturar o meio com a água ultrauso.
    6. Repetição de passos 6.3.1-6.3.5. Remova os filtros de ar de borracha novamente, retire 25 mL de meio de cultura e gire a 300 × g por 5 min no RT.
      1. Colete 1,5 mL de supernascimento e armazene a -30 °C para análise de perfis secretos (para análise com ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA)).
      2. Colete o volume desejado de supernasce para estudos de sinalização paracrina, utilizando o supernascido como meiocondicionado 43.
    7. Adicione 25 mL de médio fresco aos reservatórios médios.
    8. Coloque os filtros de ar de borracha de volta nos reservatórios médios.
    9. Coloque a configuração completa de volta na incubadora; conectar todos os cabos e tubos de ar à bomba e à bomba de tensão. Solte os clipes da mangueira e repita as etapas 5.4-5.8.
  4. Verifique se as contas de secagem de sílica nas garrafas de secagem conectadas à bomba estão úmidas (aparência branca) e substitua por contas de sílica seca, se necessário (aparência laranja).

7. Experimento final, coleta de amostras e limpeza e armazenamento de equipamentos

  1. No último dia do experimento, corrija para evaporação média conforme descrito nas etapas 6.3.1-6.3.5, e colher as amostras um por um.
    1. Para colher as amostras um por um, a bomba de fluxo e a bomba de tensão precisam ser pausadas várias vezes. Coloque um clipe de mangueira em tubos médios. Pare temporariamente a bomba de fluxo e a bomba de tensão. Desconectar uma câmara de cultura de fluxo da base bioreatorial; substituir por uma tampa luer branca na base bioreatorial. Leve a câmara de cultura de fluxo e a unidade fluida para o armário de fluxo laminar. Inicie a bomba de fluxo e a bomba de tensão novamente para aplicar a carga hemodinâmica nas outras amostras até a colheita.
    2. Recolher meio dos reservatórios médios para análise de produção de citocinas paracrinas via ELISA.
  2. Unidades de fluxo de decouple e construção tubular de colheita. Seção de acordo com o esquema de corte desejado. As partes da construção podem ser armazenadas a 4 °C (após fixação de 15 min em formaldeído de 3,7% e 3 x 5 min de lavagem em PBS) ou -30 °C (após o congelamento de snap em nitrogênio líquido) até uma análise mais aprofundada.
  3. Limpe os componentes do bioreator e da bomba. Além disso, o método de limpeza aconselhado por item é mencionado na Tabela de Materiais.
    1. Limpe os filtros de ar de borracha com 70% de etanol. Tenha muito cuidado para não umedecer o filtro interno!
    2. Colete todos os componentes separados: tubos médios, reservatórios médios, tubos de vidro, plugues Luer masculinos e fechaduras Luer femininas, tampas luer brancas, conduítes de pressão, cones de nariz, anéis O de silicone, buchas adaptadores, alisadores de fluxo (excluindo bombas, unidades fluidas, filtros de ar de borracha, base bioreator) e enxágüe em água da torneira corrente.
    3. Coloque O/N em 0,1% de dodecylsulfato de sódio em água desionizada.
      NOTA: Não use água ultrauso, pois as peças podem enferrujar.
    4. Enxágüe com água da torneira e sabão de lavagem de louça.
    5. Imersão em água desionizada, seguida de 70% de etanol duas vezes, seguida por água deionizada.
    6. Coloque todos os materiais separadamente em tecidos de papel e deixe-os secar. Use ar pressionado para secar tubos.
    7. Limpe todos os materiais não autoclaváveis com um tecido de papel embebido em 70% de etanol. Isso inclui o filtro de ar de borracha (tenha em mente que o filtro de ar deve permanecer seco) e a base bioreatorial (teflon bellow e cilindro pneumático).
    8. Autoclave os componentes da câmara fluida (incluindo o anel O de silicone), o tubo médio, os reservatórios médios (sem o filtro de ar de borracha), os plugues Luer masculinos e os acoaladores Luer femininos, tampas brancas luer, clipes de mangueira e equipamentos padrão (por exemplo, pinças, tesouras de fixação)
    9. Para uso conveniente durante os próximos experimentos, combine os componentes separados para uma câmara fluida completa em uma caixa autoclavável.
  4. Remova a água do reservatório hidráulico. Limpo com 70% de etanol, seguido de água deionizada. Deixe secar. Refilia com água desinionizada e algumas gotas de desinfetante que preserva o banho de água.
  5. Armazene os tubos de vidro para a câmara de cultura de fluxo em 70% de etanol.
  6. Coloque as contas úmidas de secagem de sílica (aparência branca) no forno O/N a 120 °C para deixá-las secar (aparência laranja) e armazene em um frasco de ar apertado.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este bioreator foi desenvolvido para estudar os efeitos individuais e combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico no crescimento do tecido vascular e remodelação em andaimes biomateriais 3D. O desenho do bioreator permite a cultivo de até oito construções vasculares sob várias condições de carregamento(Figura 1A). As construções vasculares são posicionadas em uma câmara de cultura de fluxo (Figura 1B) na qual tanto o trecho circunferencial qu...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O bioreator descrito aqui permite a avaliação sistemática das contribuições do indivíduo e efeitos combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e regeneração tecidual em andaimes tubulares resorbáveis. Essa abordagem também permite que uma grande variedade de análises sejam realizadas em construções vasculares, conforme exemplificado na seção de resultados representativos. Esses resultados mostram o impacto característico dos diferentes regimes de carregamento hemodinâmico (ou seja, difer...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo é apoiado financeiramente pela ZonMw como parte do programa LSH 2Treat (436001003) e da Dutch Kidney Foundation (14a2d507). N.A.K. reconhece o apoio do Conselho Europeu de Pesquisa (851960). Agradecemos o Programa de Gravitação "Regeneração Impulsionada por Materiais", financiado pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (024.003.013).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dulbecco avançado' s modificado EagleMedium (aDMEM)Gibco12491-015meio de cultura celular para fibroblastos
Aqua StabilJulabo8940012prevenir o crescimento de microrganismos em reservatório biorreator-hidráulico
Fibrinogênio bovinoSigmaF8630para preparar gel de fibrinogênio para semear as células no andaime eletrofiado
Trombina bovinaSigmaT4648para preparar o gel de fibrinogênio para semear as células no andaime eletrofiado
CentrífugaEppendorf5804para girar as células e o meio condicionado
Pinça tesoura - "pinça kelly"AlmedicP-422prenda o tubo de silicone e aplique pré-estiramento no andaime para que o andaime possa ser suturado na ranhura gravada (autoclave na etapa 1, etapa 7)
Incubadoras de cultura de células de CO2SanyoMCO-170AIC-PEpara cultura de células
Reservatório de ar comprimidoFestoCRVZS-5suavizando as flutuações da pressão do ar e criando atrasos de tempo para o acúmulo de pressão
Script Matlab personalizado para calcular os trechos máximosMatlabR2017. O Mathworks, Natick, MAcalcula o diâmetro externo mínimo e máximo do andaime eletrofiado Placa de
aquisição de dadosNational InstrumentsBNC-2090processamento de dados entre o sistema amplificador e o computador
EtanolVWRVWRK4096-9005para manter condições de trabalho estéreis
Soro fetal de bezerro bovino (FBS)Greiner758087suplemento de meio de cultura de células; suplemento de soro
Compartimentos da câmara de cultura de fluxo, consistindo em um conduíte de pressão com ranhuras gravadas e pequenos orifícios para aplicar pressão no tubo de silicone, uma rosca de parafuso, cone de nariz, compartimento superior com entrada de fluxo e saída de fluxo do compartimento inferior, bucha adaptadoraFeito sob medida, Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Tecnologia de Eindhovenn.a.flow(autoclave na etapa 1, etapa 7)
O assistentede vidro Pasteur pipetHE40567002aplica vácuo no andaime eletrofiado (autoclave na etapa 1)
Tubos de vidro da câmara de cultura de fluxoCuston feito, equipamento e Centro de protótipos, Universidade de Tecnologia de Eindhovenn.a.parteda câmara de cultura de fluxo (limpar e armazenar em etanol a 70%, nas etapas 1 e 7)
GlutaMaxGibco35050061suplemento de aminoácidos do meio de cultura de células, minimiza o acúmulo de amônia
Câmera de alta velocidadeMotionScopeM-5monitorar o alongamento durante a cultura; fotografias de lapso de tempo dos andaimes são capturadas a uma frequência de 30 Hz por 6 segundos (ou seja, 3 ciclos de estiramento)
Lente de câmera de alta velocidade - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lenteNikonJAA616ABpara monitorar o alongamento durante a cultura; fotografias de lapso de tempo dos andaimes são capturadas a uma frequência de 30 Hz por 6 segundos (ou seja, 3 ciclos de estiramento)
Clipe de mangueiraibidi GmbH10821bloco de fluxo médio (autoclave na etapa 1, etapa 7)
Reservatório hidráulico com 8 roscas para 8 câmaras de cultura de fluxoFeito sob medida, Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Tecnologia de Eindhovenn.a.paraaplicar pressão nas construções montadas em silicone (limpe o exterior com um lenço de papel com 70% de etanol, enxágue o reservatório com 70% de etanol seguido de demi água, nas etapas 1 e 7)
Sistema de bomba Ibidi (8x) incluindo bomba ibidi, software PumpControl, unidade fluídica, conjunto de perfusão (tubo médio), tubulação de pressão de ar, garrafas de secagem com esferas de sílica laranjaibidi GmbH10902configurado usado para controlar o fluxo nas câmaras de cultura de fluxo. Nota 1: as bombas ibidi foram modificadas pelo fabricante para permitir uma capacidade de 200 mbar. Nota 2: pode ser substituído por sistema de bomba de outro fabricante, desde que possam ser aplicados os mesmos regimes de vazão.
Facas (lâminas estéreis nº 10, embalagem de folha individual) e cabo de bisturi (aço inoxidável, embalado individualmente)Swann Morton0301; 0933para cortar o tubo de silicone no tamanho correto para o andaime e para cortar o material de sutura
Software LabVIEWNational Instrumentsversão 2018para controlar o estiramento aplicado aos andaimes
Gabinete de biossegurança de fluxo laminar com luz UVLabconco302310001para garantir condições de trabalho estéreis. O UV é usado para descontaminar tudo o que não pode ser autoclavado, ou tocado após a autoclavagem
Grandes e pequenas placas de PetriGreiner664-160para condições de trabalho estéreis
Ácido L-ascórbico 2-fosfato (vitamina C)SigmaA8960, importante para a produção de colágeno
Fonte fria de luz LED KL2500ZeissSchott AGpara auxiliar na visualização do lapso de tempo dos andaimes durante o monitoramento das
travas e conectores Luer (fêmea e macho) de estiramento, tampas luer brancasibidi GmbHvários, consulte (https://ibidi.com/26-flow-accessories)para fechar ou conectar partes do biorreator e da bomba ibidi (autoclave na etapa 1, etapa 7)
Amplificador de medição (PICAS)PEEKEL instruments B.V.n.a.paraamplificar o sinal do sensor de pressão e feedback para o reservatório médio LabView
(seringas grandes de 60 mL) e suportes de reservatórioibidi GmbH10974reservatório médio (autoclave na etapa 1, etapa 7)
Tubo médio com 4,25 mm de diâmetro externo e 1 mm de diâmetro internoBorracha BV1805Para permitir uma vazão maior, é utilizado o tubo médio IBIDI com diâmetro maior. Nota: a parte da tubulação média guiada através das válvulas da unidade fluídica é a mesma que a tubulação média ibidi padrão
SoftwareIdtvision2.15.00do estúdio do movimento para fazer as imagens de alta velocidade do lapso de tempo para a monitoração do estiramento
Agulha (19G)BD Microlance301700junto com a tubulação flexível fina usada para encher o reservatório hidráulico com a água ultrapura sem adicionar bolhas de ar
Adson2429218para manusear a agulha da sutura de nylon através do tubo de silicone (autoclave na etapa 1, etapa 7)
Lenços de papelKleenex38044001para limpeza do equipamento com etanol a 70%
ParafilmSigmaP7793-1EAsolução rápida se ocorrer vazamento
Penicilina/estreptomicina (P/S)LonzaDE17-602Esuplemento de meio de cultura de células; prevenir bactérias contaminação
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)SigmaP4417-100TABpara etapas de armazenamento e lavagem (autoclave na etapa 1)
Recipientes de plástico (60 mL) com tampas de rosca vermelhasGreiner206202para preparar a solução de fibrinogênio
Cilindro pneumáticoFestoAEVC-20-10-I-Ppara acionar o fole de Teflon (limpar com um lenço de papel com etanol a 70% nas etapas 1 e 7)
Andaimes tubulares de policaprolactona bisurea (PCL-BU) (diâmetro interno de 3 mm, 200 µ m espessura da parede, 20 mm de comprimento)SyMO-Chem, Eindhoven, Holandan.a.produzido usando eletrofiação a partir de soluções de polímero de clorofórmio (Sigma; 372978) a 15% (p / p). Consulte Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) para obter mais detalhes
Conduíte de pressão sem furos (para controle estático)Feito sob medida, Departamento de Engenharia Biomédica, Eindhoven University of Technologyn.a.paramontar tubos eletrofiados em tubos de silício (autoclave na etapa 1, etapa 7)
Sensor de pressão e transdutorBDTC-XX e P 10 EZa pressão do ar que vai para a bomba acionada pneumática é aumentada até atingir a pressão definida
Válvula de controle de pressão de ar proporcional e sensor de pressãoFestoMPPES-3-1/8-2-010, 159596fornece ar comprimido para a bomba acionada pneumática
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)GibcoA1049101meio de cultura de células para monócitos/macrófagos
Tubos Eppendorf de trava segura (1,5 mL)Eppendorf30120086múltiplas aplicações (autoclave na etapa 1)
Solução de dodecil sulfato de sódio 20%Sigma5030Usado para limpar materiais, a uma concentração de 0,1%.   
O-rings de siliconeTechnirub1250Spara evitar vazamentos (autoclave na etapa 1, etapa 7)
Tubulação de silicone (diâmetro externo de 2,8 mm, espessura de parede de 400 um)Borracha BV1805para montar os tubos eletrofiados nos conduítes de pressão (autoclave na etapa 1)
Tubo estéril (15 mL)Falcon352095múltiplas aplicações
Sutura, prolene 5-0 com agulhade ponta cônica pré-anexadaEthicon, Johnson & Fiodesutura Johnson EH7404H Prolene 5-0 (75 cm de comprimento, agulha de ponta cônica TF, 1/2 círculo, comprimento da agulha de 13 mm)
Seringa (24 mL)B. Braun Melsungen AG2057932para adicionar a água ou meio ultrapuro ao reservatório hidráulico ou câmara de cultura de fluxo
Filtro de seringa (0,2 µ m)Satorius17597-Kpara filtrar a solução de fibrinogênio
Balão de cultura de células T150 com tampa de filtroNunc178983para desgaseificar meio de cultura
T75 Balão de cultura de células com tampa de filtroNunc156499para cultivar amostras de controle estático
Fole de teflonFeito sob medida, Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Tecnologia de Eindhovenn.a.para carregar o reservatório hidráulico (limpe o exterior com um lenço de papel com 70% de etanol nas etapas 1 e 7)
Bandeja (aço inoxidável)PolarWare15-248para facilitar o transporte das câmaras de cultura fluídica e do biorreator da incubadora para o gabinete de fluxo laminar e vice-versa (limpe com um lenço de papel com 70% de etanol antes e depois do uso)
PinçasWironit4910manuseio estéril de peças individuais (autoclave nas etapas 1 e 7)
Água ultrapuraStakpureOmniapure UV 18200002para corrigir a evaporação média, misturada com aqua stabil misturada e usada como fluido hidráulico. (autoclave de água ultrapura na etapa 1)
Luz UVPhilipsTUV 30W/G30 T8para descontaminação de enxertos e peças de biorreatores antes da semeadura
compartimentos da câmara de cultura Suplemento de meio de cultura de células

Referências

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