Summary
Milieu-DNA-tests vereisen een rigoureus ontwerp, testen, optimalisatie en validatie voordat het verzamelen van veldgegevens kan beginnen. Hier presenteren we een protocol om gebruikers door elke stap te nemen bij het ontwerpen van een soortspecifieke, op sondes gebaseerde qPCR-test voor de detectie en kwantificering van dna van een doelsoort uit milieumonsters.
Abstract
Er worden nieuwe, niet-invasieve methoden ontwikkeld voor het opsporen en monitoren van de aanwezigheid van soorten om te helpen bij het beheer van de visserij en het behoud van wilde dieren. Het gebruik van milieu-DNA (eDNA)-monsters voor het detecteren van macrobiota is zo'n groep methoden die snel populair wordt en wordt geïmplementeerd in nationale beheersprogramma's. Hier richten we ons op de ontwikkeling van soortspecifieke gerichte tests voor probe-based kwantitatieve PCR (qPCR) toepassingen. Het gebruik van probe-based qPCR biedt een grotere specificiteit dan alleen mogelijk is met primers. Bovendien kan het vermogen om de hoeveelheid DNA in een monster te kwantificeren nuttig zijn voor ons begrip van de ecologie van eDNA en de interpretatie van eDNA-detectiepatronen in het veld. Bij de ontwikkeling en het testen van deze tests moet zorgvuldig worden nagedacht om de gevoeligheid en specificiteit van het opsporen van de doelsoort uit een milieumonster te waarborgen. In dit protocol zullen we de stappen afbakenen die nodig zijn om sondegebaseerde tests te ontwerpen en te testen voor de detectie van een doelsoort; inclusief het maken van sequentiedatabases, assay-ontwerp, assayselectie en -optimalisatie, testtestprestaties en veldvalidatie. Het volgen van deze stappen zal helpen bij het bereiken van een efficiënte, gevoelige en specifieke test die met vertrouwen kan worden gebruikt. We demonstreren dit proces met onze test ontworpen voor populaties van de mucket(Actinonaias ligamentina),een zoetwatermosselsoort gevonden in de Clinch River, VS.
Introduction
Onderzoekers en managers raken steeds meer geïnteresseerd in het gebruik van milieu-DNA-assays voor soortendetectie. Al drie decennia wordt kwantitatieve of real-time PCR (qPCR/rtPCR ) op tal van gebieden gebruikt voor de sequentiespecifieke detectie en kwantificering van nucleïnezuren1,2. Binnen het relatief nieuwe gebied van eDNA-onderzoek is het gebruik van deze testtesten met een standaardcurve voor het kwantificeren van kopieën van doel-DNA per volume of gewicht van eDNA-monster nu routinepraktijk geworden. Mitochondriale DNA-sequenties zijn over het algemeen gericht op eDNA-assays omdat het mitochondriale genoom in duizenden kopieën per cel aanwezig is, maar assays voor nucleair DNA of RNA-sequenties zijn ook mogelijk. Het is van vitaal belang om te begrijpen dat gepubliceerde testtesten voor eDNA-monsters niet altijd gelijk zijn aan prestaties. De betrouwbaarheid van een test bij het detecteren van alleen het DNA van een doelsoort (d.w.z. specificiteit) en detectie van lage hoeveelheden doel-DNA (d.w.z. gevoeligheid) kan aanzienlijk variëren als gevolg van verschillen in de manier waarop de test is ontworpen, geselecteerd, geoptimaliseerd en getest. Het rapporteren van kwantitatieve maatstaven voor de prestaties van assays werd voorheen grotendeels over het hoofd gezien , maar de laatste tijd komen er normen op om de transparantie in de ontwikkeling van de test te verbeteren3,4,5,6,7,8.
Optimalisatie en rapportage van assay performance aids bij het ontwerpen en interpreteren van eDNA-enquêteresultaten. Testen die kruisen met DNA van niet-doelsoorten kunnen leiden tot vals-positieve detecties, terwijl assays met een slechte gevoeligheid het DNA van de doelsoort mogelijk niet detecteren, zelfs niet wanneer het in het monster aanwezig is (valse negatieven). Inzicht in de gevoeligheid en selectiviteit van de test zal helpen bij het informeren van de bemonsteringsinspanning die nodig is om zeldzame soorten op te sporen. Omdat er veel natuurlijke bronnen van variatie in eDNA zijn, moeten studies controleerbare bronnen van variatie zoveel mogelijk beperken, inclusief het volledig optimaliseren en karakteriseren van de eDNA-test3.
Omstandigheden die direct van invloed zijn op de specificiteit of gevoeligheid van een test, zullen de prestaties van de test veranderen. Dit kan gebeuren onder verschillende laboratoriumomstandigheden (d.w.z. verschillende reagentia, gebruikers, machines, enz.). Daarom moet dit protocol opnieuw worden bezien bij de toepassing van een test onder nieuwe voorwaarden. Zelfs tests die goed in de literatuur worden gekarakteriseerd, moeten worden getest en geoptimaliseerd wanneer ze door een nieuw laboratorium worden gebruikt of wanneer verschillende reagentia worden gebruikt (bijv. mastermixoplossing)5,9. De specificiteit van de test kan veranderen wanneer deze wordt toegepast op een ander geografisch gebied, omdat de test wordt toegepast op monsters uit een nieuwe biotische gemeenschap die niet-doelsoorten kunnen omvatten waarop de test niet is getest, en genetische variatie in de doelsoorten kan optreden. Nogmaals, de test moet opnieuw worden beoordeeld wanneer deze op een nieuwe locatie wordt gebruikt. Veldomstandigheden verschillen van laboratoriumomstandigheden omdat pcr-remmers in het veld vaker in monsters aanwezig zijn. PCR-remmers beïnvloeden direct de versterkingsreactie en beïnvloeden dus de prestaties van de test. Om deze reden is een interne positieve controle vereist bij het ontwikkelen van een eDNA-test.
Ten slotte kunnen omgevingsomstandigheden in het veld de DNA-moleculen van de doelsoort en hun vangst beïnvloeden door DNA-afbraak, transport en retentie. Bovendien variëren verschillende protocollen voor DNA-verzameling en extractie in hun efficiëntie en vermogen om DNA vast te houden. Het is echter belangrijk op te merken dat deze processen van invloed zijn op de detecteerbaarheid van eDNA, maar niet op de prestaties van moleculaire assays. De detecteerbaarheid van DNA van de doelsoort in veldmonsters is dus een functie van zowel de technische prestaties van de qPCR-test als de veldomstandigheden en de verzamel-, opslag- en extractieprotocollen. Bij het gebruik van een goed gekarakteriseerde en goed presterende test kunnen gebruikers vertrouwen hebben in de mogelijkheden van de test; waardoor onderzoekers zich nu kunnen concentreren op het begrijpen van de externe testfactoren (d.w.z. omgevingsvariabelen, verschillen in opname- of extractieprotocollen) die van invloed zijn op eDNA-detectie.
Hier richten we ons specifiek op het verbeteren van technische prestaties door middel van rigoureus ontwerp en optimalisatie. We demonstreren het protocol met behulp van een sonde-gebaseerde test ontwikkeld voor de detectie van een zoetwatermossel, de mucket (Actinonaias ligamentina), uit water bemonsterd in de Clinch River, USA. Onlangs presenteerden Thalinger et al. (2020) richtlijnen voor validatie van gerichte eDNA-assays. Assay ontwerp volgens ons protocol brengt een test naar Thalinger et al.'s niveau 4 plus een extra stap naar niveau 56. Op dit punt zullen de technische prestaties van een test worden geoptimaliseerd en zal deze klaar zijn voor regelmatig gebruik in laboratorium- en veldtoepassingen. Verder gebruik van de test in laboratorium-, mesocosme- en veldexperimenten kan vervolgens vragen beantwoorden over eDNA-detectie en factoren die de detecteerbaarheid beïnvloeden, de laatste stappen voor validatie op niveau 56.
Protocol
1. Genereren van een sequentiedatabase van mitochondriale DNA-sequenties van doel- en niet-doelsoorten van belang
- Definieer de vraag, doelen en het systeem dat wordt aangepakt. Identificeer de doelsoorten voor eDNA-detectie. Identificeer het geografische systeem waarin de test zal worden gebruikt. Maak een lijst van soorten van belang, met inbegrip van de doelsoorten, sympatric (co-voorkomende) soorten binnen dezelfde taxa (meestal orde of familieniveau), en nauw verwante allopatric soorten, die mogelijk niet op dezelfde geografische locatie als het doel (Figuur 1).
OPMERKING: Hier waren de Clinch River populaties van de soort A. ligamentina het doelwit. - Zoek en download sequenties uit meerdere gengebieden voor soorten op de lijst uit stap 1. Sequence databases zoals NCBI (National Center for Biotechnology Information), BOLD (Barcode of Life Database), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) en DDBJ (DNA Data Bank of Japan) kunnen worden gebruikt. NCBI, EMBL en DDBJ delen allemaal sequentie-informatie.
- Zoek met behulp van ncbi's Nucleotide-database naar het doelorganisme (bijv. Actinonaias ligamentina)en het gengebied (bijv. cytochroom c oxidase I (COI) of NADH-dehydrogenase 1 (ND1); Voorbeeld zoekreeks: Actinonaias ligamentina EN ND1)
- Selecteer vervolgens alle reeksen die overeenkomen met de specificaties en selecteer Verzenden naar. Kies Volledige record, Bestands- en downloadindeling als GenBank of FASTA en maak vervolgens Bestand. Deze reeksen worden nu opgeslagen op de computer.
- Herhaal deze stappen voor alle soorten op de lijst die is gedefinieerd in stap 1. Bewaar sequenties voor elk gengebied in een afzonderlijk bestand, omdat deze afzonderlijk worden geanalyseerd.
- Download alle relevante sequenties (of een groot, representatief deel van de sequenties) voor de doelsoorten die in stap 1 zijn geïdentificeerd. Neem indien mogelijk geografische varianten op.
- Herhaal de zoek- en downloadsequenties voor verwante en sympatrische niet-doelsoorten van dezelfde taxonomische groep die in stap 1 zijn geïdentificeerd (bijv. als de doelsoort de mucket (A. ligamentina) downloadsequenties is voor alle andere zoetwatermosselsoorten in de familie Unionidae die voorkomen in het systeem van belang).
- Herhaal de zoekopdracht en download voor nauw verwante maar allopatric (geografisch gescheiden) soorten vermeld in stap 1.1.
OPMERKING: Niet alle soorten (doelen en niet-doelen) zullen beschikbaar zijn in de openbare databases. Vergroot de lokale referentiedatabase door taxonomisch geverifieerde exemplaren van soorten die in eigen beheer van belang zijn te versterken en te sequentiëren. Als u werkt met een soort met een hoge genetische diversiteit binnen de soort of werkt in een geografisch groot gebied waar geografische varianten kunnen worden verwacht, verzamel dan sequenties uit het hele bereik.
2. Assay ontwerp
- Lijn sequenties uit elk gengebied afzonderlijk uit met behulp van uitlijningssoftware die te vinden is in verschillende genetische sequentiebewerkings- en bioinformatische programma's. Doe deze uitlijning voor elk van de verschillende gengebieden.
- Bijvoorbeeld, met behulp van Geneious Prime software (https://www.geneious.com) importeren de gedownloade sequence bestanden in het programma.
- Maak afzonderlijke mappen voor elk gengebied.
- Selecteer alle sequenties in een map die sequenties uit één gengebied bevat.
- Gebruik het gereedschap Meerdere uitlijningen om een nucleotide-uitlijning van de geselecteerde sequenties te maken. Er kunnen verschillende opties zijn voor het type uitlijning, met behulp van de Geneious- of MUSCLE-uitlijningen en standaardparameters werkt goed.
- Kies veelbelovende regio's voor het ontwerp van de test door middel van de visualisatie van uitgelijnde sequentiegegevens. Een regio met veel sequentiegegevens beschikbaar voor de soorten van belang, is zeer uiteenlopend tussen soorten en toont een lage variatie binnen de soort is een goede kandidaat. Dit zal de kans vergroten dat primers en sondes die zijn ontworpen, het doelwit kunnen onderscheiden van niet-doelsoorten, terwijl ook wordt gegarandeerd dat intraspecifieke varianten zich met de test zullen versterken.
- Ontwerp van assay primers en probe.
- Gebruik qPCR assay ontwerpsoftware en volg de instructies. IDT's PrimerQuest Tool (https://www.idtdna.com/) om 5 sets qPCR-assays te ontwerpen, werd hier gebruikt.
- Plak de volgorde die is geselecteerd in stap 2.2 in het invoervak Reeks. Als de uitlijning spaties heeft gemaakt, verwijdert u deze uit de reeks.
- Selecteer qPCR 2 Primers + Probe in de optie Choose Your Design.
- Download de aanbevolen test.
- Kopieer de sequenties van de voorwaartse primer van de eerste test en zoek naar deze primersequentie in de uitlijning die is gemaakt in stap 2.1.4. Als u Geneious Prime gebruikt, gebruikt u het gereedschap Aantekeningen en voorspellen om het primergebied aan de uitlijning toe te voegen. Doe dit voor alle primer- en sondecombinaties (figuur 2).
- Inspecteer deze gebieden van de uitlijning op variatie binnen de doelsoorten en binnen de co-voorkomende soorten.
- Als er intraspecifieke genetische variatie is, zoek dan naar tests waarbij de primers en sonde niet binnen deze regio's vallen.
- Om versterking van niet-doelsoorten te voorkomen, moet u zoeken naar mismatches met niet-doelsoorten. Kies assays met de meeste mismatches voor verdere validatie. Currier et al. (2018) stellen voor om sets te kiezen met ten minste twee van de drie regio's (de twee primers, of een primer en een sonde) met ten minste twee mismatches met alle niet-doelsoorten. Houd er echter rekening mee dat mismatches bij de sonde minder bijdragen aan specificiteit10.
OPMERKING: Verschillen binnen 3 basisparen van het 3'-uiteinde van elke primer verhogen de specificiteit beter dan verschillen aan het 5'-uiteinde van de primers10.
- Houd rekening met de volgende belangrijke parameters bij het ontwerp van de test.
- Bepaal de smelt- en gloeitemperaturen van de primers en sonde. Idealiter moet de smelttemperatuur (Tm) van primers tussen 60-64 °C en binnen 2 °C van elkaar liggen, en de Tm van de sonde moet 6-8 graden hoger zijn dan de Tm van de primers. Stel de gloeitemperatuur (Ta) van de qPCR-reactie 5 °C onder de smelttemperatuur in, rond 55-60 °C11.
- Bekijk de GC-inhoud. Kies tussen 35 – 65% GC-inhoud en vermijd regio's met 4 of meer opeenvolgende G's. Het hebben van 1 of 2 Gs of Cs in de 5 laatste basen van het 3' uiteinde van de primer (GC-klem) kan de specificiteit verhogen omdat het de primer zou helpen om een sterkere binding te maken12.
- Zoek naar haarspeld- en dimerstructuren. Test primers en sonde voor voorspelde haarspeldstructuren en dimers met behulp van een oligonucleotide-analyseprogramma (bijv. OligoAnalyzer -IDT13; OligoCalculator14). Deze structuren kunnen leiden tot niet-doelversterking en een lagere efficiëntie. Vermijd assays waarvan wordt voorspeld dat ze deze structuren vormen.
- Bepaal de primerlengte. Streef naar primers tussen 18-25 bases in lengte en sondelengte tussen 20 -25 bases. Langere primers en sondes kunnen een lagere versterkingsefficiëntie hebben.
- Bepaal de ampliconlengte. Het moet tussen ongeveer 100 en 250 basisparen zijn. Dit bereik is over het algemeen kort genoeg voor een hoge PCR-efficiëntie, maar lang genoeg voor eenvoudige verificatie door Sanger-sequencing4,15.
- Ontwerp sondes. Zorg ervoor dat de sondes geen G-basis aan het uiteinde van 5' hebben, omdat dit het signaal van groene en gele kleurstoffen kan dempen11. We ontwierpen dubbel gedoofde sondes, met IDT 3IABkFQ en ZEN quenchers en FAM- of HEX-fluoroforen.
OPMERKING: Bepaal de MGB-sondes: TaqMan MGB -sondes (minor groove binder) worden vaak gebruikt voor eDNA-onderzoeken. Omdat deze sondes echter erg kort zijn, kunnen ze zich binden aan niet-doelen, zelfs met een 2 of 3 basispaar mismatch10. - Bepaal de sonde Tm. De smelttemperatuur van de sonde moet 6-8°C hoger zijn dan de primers. Lagere temperaturen verminderen het bindingssucces van de sonde.
- Bepaal de lengte en locatie van de sonde. De sonde moet tussen de 20 en 25 bp lang zijn en ideaal dicht bij de primerbindingsplaats op dezelfde streng liggen zonder deze te overlappen.
3. Testscreening en optimalisatie
- In silico assay ontwikkeling en testen. Voordat u primersondesets bestelt, moet u de specificiteit (potentiële niet-doelversterking) beoordelen door de primerversterking in silico tetesten.
- Test primers via NCBI's Primer-Blast16 of vergelijkbare programma's die potentiële niet-doelen in de NCBI nt/nr-database kunnen identificeren die met de test kunnen versterken. Als u Primer-Blast pasta primers gebruikt op de Use my own primer box onder Primer parameters. Selecteer in de opties Primer Pair Specificity Checking Parameters nr als database en typ de volgorde van het organisme van belang (bijv. "Unionida" of "Unionoida") in het vak Organisme.
- Ga door met het visueel beoordelen van primer-/probe-sets op uitgelijnde sequentiegegevens.
- Om primers en probes tegelijkertijd in silico te beoordelen, maak je een tekstreeks van de forward primer, 12 N's, de probe, 12 N's en de reverse complement van de reverse primer. Als de sondesequentie zich binnen 12 basisparen van een van de primers bevindt, gebruikt u het aantal N's dat overeenkomt met het aantal basisparen tussen de primer en de sonde.
- Gebruik NCBI's Nucleotide Blast search (Blastn) om te zoeken in de nr database17. Gebruik het tabblad Taxonomie om te zoeken naar niet-doelsoorten met weinig mismatches; deze moeten in het laboratorium worden getest tijdens de optimalisatie van de test.
OPMERKING: Bij silico-tests helpt het niet-specifieke tests uit te sluiten, maar potentieel specifieke tests moeten empirisch (in vitro) worden getest, omdat niet alle soorten sequenties in de genetische databases hebben en primer en sondes zich nog steeds kunnen binden aan niet-doelen, zelfs als dit door de software onwaarschijnlijk wordt geacht.
- Kies drie tot vijf primer/probe combinaties om te testen in het laboratorium.
- Bestel primers, sondes en een synthetische DNA-standaard, evenals extra M13-tailed primers voor amplicon sequencing.
- Bestel synthetische oligonucleotide primers en probes bij een bedrijf dat oligo's maakt. Sondes zijn gelabeld met een fluorescerende kleurstof en een quencher. Verschillende fluoroforen moeten worden geselecteerd voor testtesten die moeten worden gemul veelvoudig. Controleer uw qPCR-instrument op een lijst van welke fluoroforen het instrument kan detecteren.
- Ontwerp en bestel M13-tailed primers voor verificatie van qPCR-detecties met Sanger-sequencing door de M13 Forward (-20) -reeks, GTA AAA CGA CGG CCA GT, toe te voegen aan het 5'-uiteinde van de forward primer, en de M13 Reverse (-27) sequence, CAG GAA ACA GCT ATG AC, aan het 5' uiteinde van de reverse primer.
- De synthetische DNA-standaard bevat de doelsequentie (inclusief de primergebieden) bij een bekende concentratie in kopieën/μL. Kwantificeer onbekende monsters op basis van een curve gemaakt door bekende concentraties van deze standaard (d.w.z. de standaardcurve). Koop de synthetische standaard van hetzelfde bedrijf dat de primers en sonde produceert. Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor resuspensie en opslag. Verdun normen in TE-buffer met een tRNA-drager met plasticgoed met lage retentie om hydrolyse en binding aan oppervlakken te verminderen.
OPMERKING: Als de standaardcurve niet goed presteert (slechte PCR-efficiëntie, zie stap 3.4.2), probeer dan de norm opnieuw op te schorten in water of Tris-HCl. - Schors primers en sondes in nucleasevrij water, Tris-HCl of TE-buffer in handige concentraties voor testgebruik. Over het algemeen verdun de werkvoorraden 20 keer in de mastermix om de geoptimaliseerde eindtestconcentratie te bereiken. Bewaar gesuspendeerde oligo's bij een constante -20 °C wanneer ze niet in gebruik zijn.
- In vitro (in het laboratorium) testen optimalisatie en testen. Verwerp assays die een slechte efficiëntie hebben, cross-react zijn met co-voorkomende soorten of een slechte gevoeligheid hebben18. Neem het gebruik van een interne positieve controle (IPC) op tijdens de ontwikkeling van de test en bij het uitvoeren van daadwerkelijke monsters.
- Zoek eerst de optimale temperatuur- en primer/sondeconcentratiewaarden voor de test. Zodra deze parameters zijn geoptimaliseerd voor PCR-efficiëntie (stap 3.4.2), kruisreactiviteit (stap 3.4.3) en gevoeligheid (stap 3.4.4), gaat u verder met het testen van de test met een multiplexed IPC (stap 3.4.5).
- Test de optimale gloeitemperatuur (Ta) voor primer en sondes met behulp van een PCR-temperatuurgradiënt gecentreerd 5° C onder de voorspelde gemiddelde primer Tm.
- Test optimale primer- en sondeconcentraties. Meestal worden 200 nM-, 400 nM- en 800 nM-primerconcentraties en 75 nM-, 125 nM- en 200 nM-sondeconcentraties getest.
- Maak een standaardcurve en bepaal de efficiëntie en het lineaire bereik. Test ten minste zes 10-voudige verdunningen van een synthetische DNA-norm die de doelsequentie bevat, bij ongeveer 100 kopieën/reactie op 105 kopieën/reactie (figuur 3A).
- Gebruik de qPCR-software om de Cq-waarde (drempel voor cyclus bij kwantificering) van elke norm op de y-as en de logbasis 10 van de initiële standaardconcentratie in kopieën/reactie op de x-as te plotten. De qPCR-software moet automatisch een lineaire regressie uitvoeren (figuur 3B).
- Bereken het rendement van de helling van de regressie, E = -1 + 10(-1/helling). Als de helling bijvoorbeeld -3,4 is, is E= -1 + 10(0,29) = 0,97 of 97%. Controleer ook de r2-waarden die aangeven hoe goed de standaard repliceert die op de curve passen. De qPCR-software moet dit ook automatisch berekenen (figuur 3B). Streef naar efficiëntiewaarden van 100% (±10%) en r2 waarden van ≥0,989,15,19,20,21,22.
- Inspecteer de standaardcurve visueel op bias, dat wil gezegd afwijkingen van de regressie in een consistente richting of op slechte standaardcurveprestaties zoals gemeten door efficiëntie en r2-waarden (figuur 3C en 3D).
- Specificiteit: Beoordeel kruisreactiviteit met niet-doelsoorten om de kans op valse positieven te verminderen. Wanneer eDNA-detecties kunnen leiden tot dure beheersbeslissingen, controleert u positieve detecties door amplicon-sequencing.
- Niet-doelwitten: Voer de test uit tegen genomische DNA-extracties van taxonomisch geverifieerde specimens van verwante soorten en van geografisch gelijktijdig voorkomende soorten; met de hoogste prioriteit om te testen op nauw verwante, gelijktijdig voorkomende soorten. Gebruik vergelijkbare totale DNA-concentraties voor zowel doel- als niet-doelmonsters. De gekozen concentratie moet versterking opleveren van doelsoortenmonsters in de buurt van het midden van het lineaire bereik van de standaardcurve. Versterking mag alleen worden waargenomen bij de doelsoorten.
- Als niet-doelversterking wordt waargenomen, reinigt en sequencet u het product om de identiteit ervan te verifiëren. Het is niet ongewoon om besmetting van de doelsoort in weefselmonsters van niet-doelsoorten waar te nemen, dus alle versterkingen in dit stadium moeten worden geverifieerd door middel van sequencing. Reamplifyeer gereinigde amplicons van specificiteitstests met behulp van de M13 tailed primers en sequence met M13 primers.
- Breng in het post-PCR-laboratorium de qPCR-producten over die moeten worden gesequenced naar verse buizen. Verwijder restprimers en reactiecomponenten met een reinigingskit (bijv. MinElute PCR Purification Kit).
- Maak 1:100 verdunningen van de elutions en versterk 1 μL van elk gedurende 30 cycli in een 50 μL PCR-reactie met de M13 tailed primers en een high-fidelity polymerase (bijv. Phusion High-Fidelity DNA Polymerase).
- Voer 10 μL van elke reactie uit op een 1% agarose gel om te controleren op een enkele band van de verwachte grootte. Als er geen band wordt waargenomen, verhoog dan het aantal cycli of de hoeveelheid monster. Als meerdere banden worden waargenomen, zuivert gel de band van de verwachte grootte.
- Verwijder restprimers en reactiecomponenten met een clean-up kit zoals hierboven en meet de DNA-concentraties van de elutions.
- Stel sequencingreacties in met de M13 primers volgens de instructies van de sequencing faciliteit.
OPMERKING: Open nooit versterkte monsters in het qPCR-laboratorium. Bereid monsters voor op sequencing in een laboratorium gewijd aan post-PCR-monsters.
- Gevoeligheid: Gevoeligheid beïnvloedt de kans op valse negatieven of het niet detecteren van het DNA van de doelsoort wanneer het aanwezig is. Beoordeel de detectiegrens (LOD) en de kwantificeringsgrens (LOQ) voor elke test. Ten slotte moet u een interne positieve controle (IPC) opnemen om de PCR-remming van monsters te beoordelen. Multiplex en test deze IPC-test met de ontworpen test om ervoor te zorgen dat de twee tests elkaar niet storen.
- LOD: Maak zes 4-voudige seriële verdunningen van de synthetische DNA-standaard, met 8-24 duplo's per standaardverdunning (figuur 4). Bereken de laagste beginconcentratie met 95% detectie. LOD- en LOQ-plots kunnen worden gegenereerd met een LOD/LOQ-rekenmachine R-script5.
OPMERKING: Gegevens onder de LOD mogen niet worden gecensureerd. Vanwege de specificiteit van PCR is er geen ondergrens voor echte positieven. De LOD is de hoogste concentratie waaronder valse negatieven kunnen worden verwacht. - LOQ: Bereken uit dezelfde verdunningsreeks de laagste initiële DNA-standaardconcentratie die kan worden gekwantificeerd met een variatiecoëfficiënt (CV) van minder dan 35%.
OPMERKING: LOD en LOQ moeten in kopieën/reactie worden gerapporteerd. Bij gebruik van een gevalideerde test en veldmonsters die onder de LOQ worden versterkt, moeten de resultaten worden gerapporteerd als % detecties in plaats van eDNA-concentraties, omdat de exacte concentratie niet met vertrouwen kan worden gemeten5.
- LOD: Maak zes 4-voudige seriële verdunningen van de synthetische DNA-standaard, met 8-24 duplo's per standaardverdunning (figuur 4). Bereken de laagste beginconcentratie met 95% detectie. LOD- en LOQ-plots kunnen worden gegenereerd met een LOD/LOQ-rekenmachine R-script5.
- Gebruik een interne positieve controle (IPC) om te testen op PCR-remming. Remming kan leiden tot een afname van de gevoeligheid en valse negatieven. Test het vermogen van de IPC-test om te worden gemul veelvoudig met de doeltest.
- Een IPC-test kan worden gemul veelvoudig met de doeltest met behulp van een sonde met een andere reporterkleurstof dan de doeltest. Deze IPC-test bestaat uit een korte synthetische DNA-sequentie van een soort die geen verband houdt met de doel taxa, opgenomen in de qPCR-mastermix bij een lage concentratie van ongeveer 102 kopieën/reactie, samen met primer en sondes die het detecteren. Deze lagere concentratie is noodzakelijk om concurrentie met de streefvolgorde voor polymerase en nucleotiden23te voorkomen .
- Vergelijk de Cq-waarde van de IPC-sjabloon van het voorbeeld met die van de IPC-sjabloon in het besturingselement Geen sjabloon. In dit geen sjabloonbesturingselement (NTC) is de enige DNA-invoer die van de IPC-sjabloon. De IPC-sjabloon in deze reactie moet worden versterkt zoals verwacht. Als de IPC-sjabloon in een monster wordt versterkt bij 2 of meer cycli die verschillen van die van de IPC-sjabloon in de NTC, wordt het eDNA-monster geremd. Monsters die wel remming vertonen, kunnen 1:10 worden verdund en opnieuw worden getest. Als een monster geremd blijft, moet dat monster uit de analyse worden verwijderd.
- Zoek eerst de optimale temperatuur- en primer/sondeconcentratiewaarden voor de test. Zodra deze parameters zijn geoptimaliseerd voor PCR-efficiëntie (stap 3.4.2), kruisreactiviteit (stap 3.4.3) en gevoeligheid (stap 3.4.4), gaat u verder met het testen van de test met een multiplexed IPC (stap 3.4.5).
- Ontwikkeling en testen van in situ testen
- In het laboratorium: Als toegang tot het organisme in het laboratorium en sympatric soorten beschikbaar is; watermonsters nemen uit verblijven met deze soorten, de monsters verwerken en de test testen aan de hand van deze eDNA-monsters. Volg producten zoals hierboven om de versterking van het beoogde doel te controleren met behulp van de M13 tailed primers.
- In het veld:
- Identificeer plaatsen waarvan bekend is dat het doelorganisme voorkomt en waarvan niet bekend is dat het voorkomt. Het verdient de voorkeur om een zekere mate van overvloed te hebben op elke locatie waar de doelsoort voorkomt.
- Bepaal welke monstervolumes en monsterafnamemethoden (bijv. filtratie, centrifugeren, enz.) worden gebruikt.
- Neem op elke locatie een lege of negatieve controle op, dit is schoon water dat naar de veldlocatie is gebracht en vervolgens is verzameld en voorbereid met dezelfde veldapparatuur en protocollen die worden gebruikt voor eDNA-bemonstering24. Het doel van de veld blank is om verontreiniging van de bemonsteringsapparatuur en het velduitrusting die naar de locatie worden gebracht, op te sporen. Neem het veld leeg voordat u veldwatermonsters verwerkt.
- Neem meerdere watermonsters per locatie, bij voorkeur 3 monsters per locatie.
- Terug in het laboratorium, verwerken en extraheren van monsters.
- Voer de test uit met behulp van een plaat die is ingesteld op vergelijkbaar met figuur 5A en vergelijk de eDNA-concentratie en detectiefrequentie met bekende locatieverschillen in voorkomen en overvloed. Bevestig alle detecties door24 , 25te sequentiëren .
OPMERKING: Het bovenstaande zou een test valideren via niveau 4 van Thalinger et al.'s (2020) schaal6 (optimalisatie van de technische prestaties van de test) en beginnen met het verzamelen van gegevens die niveau 5-testvalidatie ondersteunen. Niveau 5 omvat waarschijnlijkheidsmodellering en gebruik van de test voor eDNA-ecologiestudies. We zijn van mening dat dit buiten het bereik van de basisontwikkeling van assay valt, maar we moedigen deze toepassingen van laboratorium- en veldonderzoeken aan om het ontwerp van de test en de interpretatie van gegevens te verbeteren.
Representative Results
Bij het ontwerpen van een soortspecifieke qPCR-test voor de mucket (A. ligamentina) werden beschikbare sequenties van alle Unionidae-soorten in de Clinch-rivier gedownload. Nauw verwante soorten zoals Lampsilis siliquoidea werden ook opgenomen in de referentiedatabase, hoewel ze niet in dezelfde rivier worden aangetroffen. Niet alle soorten in het riviersysteem van belang werden gevonden in GenBank, dus extra soorten werden in eigen huis gesequenced. Sequenties werden uitgelijnd met behulp van Geneious software en Primer Quest (IDT) software werd gebruikt om meerdere assays te ontwerpen. Aan de uitlijning voor visuele beoordeling zijn vijf sets primers en sondes toegevoegd (figuur 2). Vervolgens werden ze in silico getest met Primer-Blast, waarna ze werden besteld voor verdere tests in vitro. In het laboratorium werden alle tests getest met behulp van DNA-extracties van 27 beschikbare soorten om de specificiteit te verifiëren. Eén test (A.lig.1) versterkte met succes alleen de doelsoorten (tabel 1; Tabel 2). Deze test ging verder voor verdere tests van testefficiëntie, LOD en LOQ. Het heeft een amplicon lengte van 121 basisparen. Tabel 3 toont de volgorde die wordt gebruikt voor de synthetische DNA-standaard A. ligamentina. Figuur 3A en figuur 3B tonen de resultaten van een succesvolle test met een goede efficiëntie en r2-waarden. Figuur 3C en figuur 3D laten een test zien waarvan de standaardcurve een slechte efficiëntie heeft; deze test werd weggegooid. De LOD en LOQ voor de geselecteerde test (A.lig.1) bleken beide 5,00 kopieën/reactie te zijn volgens de discrete methode beschreven in Klymus et al5. De IPC die werd gemul veelvoudig met de test (Tabellen 3-6) had geen invloed op de standaardcurve van de A. ligamentina-assay. De IPC die we gebruiken is een fragment van de muis HemT transcript. Deze test is vooraf ontworpen door IDT voor een andere toepassing, maar we hebben het gebruik ervan als IPC voor de eDNA-toepassingen van ons lab aangepast.
Een succesvolle qPCR-uitvoering moet voldoen aan bepaalde criteria voor elke prestatiemaatstaf (d.w.z. standaardcurveversterking, genomische DNA-positieve controle, geen sjablooncontrole en interne positieve controle). De doeltestnormen moeten exponentiële versterkingscurven hebben. Deze krommen moeten een eindpuntplateau bereiken als ze voldoende cycli mogen lopen. Dit is indicatief voor het volledig consumeren van de fluorescerende sonde tijdens de reactie en het bereiken van een maximale limiet. Latere versterkingsnormen bereiken mogelijk geen plateau in 40 cycli. De positieve controles (genomisch DNA en IPC) moeten hetzelfde patroon hebben. Onbekenden kunnen al dan niet versterken, maar versterking bij onbekenden moet ook een exponentieel patroon en een eindpuntplateau hebben (figuur 5).
In een kwaliteits qPCR versterken de standaardverdunningen bij gelijkmatig verdeelde Cq van ongeveer elke 3,3 cycli voor elk 10-voudig concentratieverschil. Elke replica van een standaardverdunning versterkt op een strak gegroepeerde manier met bijna dezelfde Cq (vertegenwoordigd door de r2-waarden). Alle standaardverdunningen moeten worden versterkt (figuur 3A). In een slechte qPCR kunnen normen een niet-exponentiële vorm vertonen, ongelijke variatie in Cq-waarden tussen verdunningen, niet tot een eindpuntplateau komen of sommige verdunningen helemaal niet versterken (figuur 3D).
De belangrijke parameters voor een standaardcurve zijn efficiëntie, r2,helling en y-intercept. Efficiëntie moet dalen tussen 90%-110% met ideale waarden in de buurt van 100% en r2 waarden moeten hoger zijn dan 0,98 met ideale resultaten die 1,015,22naderen . Hellingswaarden moeten tussen -3,2 en -3,5 zijn met ideale resultaten in de buurt van -3,322. De y-intercept waarden moeten tussen een Cq van 34-41 vallen met ideale resultaten met een Cq van 37,0. De y-intercept is de voorspelde Cq van een reactie met 1 kopie van de doelsequentie, de kleinste eenheid die in één qPCR kan worden gemeten. Onbekenden met CQ's groter dan de y-interceptie zullen waarschijnlijk geremd worden. Het uitvoeren van meer dan 40 cycli PCR kan nodig zijn om het doelwit te detecteren in geval van remming of een inefficiënte primerset, maar kwantificering is onder deze omstandigheden niet mogelijk en aanvullende negatieve controles zonder de doelsequentie, maar met totaal DNA vergelijkbaar met de onbekenden, moeten worden uitgevoerd om versterking uit niet-specifieke bronnen uit te sluiten.
De interne positieve controle (IPC)-versterking in onbekende monsters moet worden vergeleken met de resultaten van de negatieve templatecontrole-IPC, aangezien er geen concurrentie is voor reagentia en er geen remmers aanwezig zijn. Onbekenden met een IPC met een Cq van 2 cycli of hoger dan de gemiddelde Cq-waarde van de NTC, of die niet versterken, moeten als geremd worden beschouwd. Als er geen remmers in de monsters aanwezig zijn, moet alle IPC-versterking een strakke groepering in het plot hebben met Cq-waarden in de buurt van hetzelfde als de NTC (figuur 6).
Ten slotte vond in situ testen van de test plaats. Twintig watermonsters uit de Clinch-rivier en drie veldmonsters werden tussen 25 en 26 september 2019 gefilterd binnen 500 meter van een mosselbed waarvan bekend is dat het A. ligamentina heeft. Per bemonsteringslocatie werden ongeveer vier watermonsters van 1 L gefilterd. Locatieplaatsen op de bodem van het mosselbed in de beek, de bodem van het mosselbed bij de kust, 100 m stroomafwaarts van het bed in de beek, 500 m stroomafwaarts van het bed in de beek en 500 m stroomafwaarts van het bed bij de kust (figuur 7). Terug in het laboratorium werd elk filter doormidden gesneden en werd DNA uit slechts de helft van een filter gehaald. De resterende filterhelft voor elk monster werd opgeslagen in een vriezer van -80 °C. Monsters werden vervolgens uitgevoerd met behulp van de A.lig.1-test die is gemul veelvoudig met de IPC. Van de 23 monsters bleken er vijf geremd te zijn. Deze monsters werden verdund 1:10 en verdunningen werden opnieuw uitgevoerd. Negentien van de 20 veldmonsters versterkt met behulp van de ontworpen test. Van deze 19 monsters lagen er vijf boven de LOD en LOQ van de test van 5 kopieën/reactie; dit betekent dat de meeste monsters een eDNA-detectie hadden, maar op een niveau waar waarschijnlijk vals-negatieve resultaten zullen optreden en dat de test het kopienummer voor die 14 monsters niet met vertrouwen kon kwantificeren. Niettemin repliceert 75 tot 100% van de vier biologische locaties versterkt op elke bemonsteringslocatie. Twee van de drie veld blanks waren negatief, terwijl een veld blank toonde versterking, met de nadruk op het belang van schone techniek in het veld.
Figuur 1: Workflow voor mitochondriale DNA-sequentie database constructie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Sequentie uitlijningen voor Clinch rivier mossel soorten met prospectieve primers en sondes voor de Actinonaias ligamentina ND1 test. Voorwaartse primers in donkergroen, sonde in rood en omgekeerde primer in lichtgroen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Standaardcurve en lineaire regressievoorbeelden. A. Voorbeeld van een aanvaardbare standaardcurve afgeleid van de versterking van drie repliceert elk van de zes standaardverdunningen. Een 10-voudige standaardverdunningsreeks met de hoogste concentratie van de norm aan de linkerkant, met afnemende concentraties naar rechts. De horizontale lijn die alle sporen overschrijdt, is de drempel voor cyclus bij kwantificering (Cq). Waar elk spoor deze drempel overschrijdt, wordt de Cq bepaald. B. Lineaire regressie gemaakt van de standaard repliceert van figuur 3A. Replica's van de standaardverdunningen worden in cirkels uitgezet en de onbekenden (monsters) worden uitgezet met x's. Het rendement is 98,9%, r2 nadert 1,0 en een helling van -3,349. C. Voorbeeld van een slechte standaardcurve afgeleid van de versterking van drie repliceert elk van de zes standaardverdunningen. D. Een lineaire regressie die de standaardcurve voor de standaard vormt, repliceert versterkt in voorbeeld 3C. Let op de slechte efficiëntie en r2-waarden. Merk ook op dat slechts 4 van de 6 normen zijn versterkt. Als na herhaalde runs de standaardcurve niet verbetert, kan het probleem zijn met een slechte primer / sondeset die het doel-DNA niet versterkt zoals verwacht, in welk geval deze test niet moet worden overwogen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van plaatopstellingen voor LOD- en LOQ-standaard qPCR-uitvoeringen. De normen die in de curve worden gebruikt, zijn in blauw, de standaardconcentratie neemt af van donker naar lichtblauw. DNA-positieve controle in groen en geen sjablooncontrole (NTC) in geel. Experimentele standaardconcentraties in grijs met 24 duplo's voor elke standaardverdunning. De verdunningsreeks werd geplateerd over twee platen (A, B), elk met een standaardcurve, positieve controle en NTC. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Plaatopstelling en versterkingssporen van een qPCR-uitvoering. A. Plaatopstelling, normen weergegeven in blauwe, donkerdere kleur die de hoogste concentratie van de norm aangeven. DNA-positieve controle in groen, geen sjablooncontroles in geel (NTC), monsterdoelen in grijs. B. Versterkingssporen van een qPCR-uitvoering. Normen weergegeven in blauw, DNA-positieve controle in groen, geen sjablooncontroles in geel en onbekenden in rood. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Versterkingssporen voor de Interne Positieve Controle (IPC). IPC-sporen voor alle onbekende monsters in magenta en de IPC van de no template controls (NTC's) die in oranje met driehoeken worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Kaart met de eDNA-verzamelplaatsen van een mosselbed in de Clinch River langs de grens tussen Virginia en Tennessee. Monsters werden verzameld in Wallens Bend aan de onderkant van het bed, 100 m stroomafwaarts van het bed en 500 m stroomafwaarts van het bed. Sites werden verzameld in het midden van de beek (in stroom) of ongeveer 1 - 2 meter van de kustlijn (kust). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| bestanddeel | naam | Reeks 5' – 3' | Fluorescerend label | |
| Voorwaartse primer | A.lig.1-f | CCCTCATCACGTACCTCTTAATC | ||
| Omgekeerde primer | A.lig.1-r | GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA | ||
| sonde | A.lig.1 sonde | TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT | Fam. | |
Tabel 1: De ontworpen Actinonaias ligamentina qPCR-test (A.lig.1) inclusief sequenties voor de voor- en achteruitprimers en de sonde.
| soort | Versterkte | In de Clinch rivier |
| 1. Ligamentina van Actinonaias | ja | ja |
| 2. Pectorosa van Actinonaias | Nee | ja |
| 3. Amblema plicata | Nee | ja |
| 4. Corbicula spp. | Nee | ja |
| 5. Monodonta van Cumberlandia | Nee | ja |
| 6. Tuberculata van Cyclonaias | Nee | ja |
| 7. Cyprogenia stegaria | Nee | ja |
| 8. Dilatata van Elliptio | Nee | ja |
| 9. Epioblasma Brevidens | Nee | ja |
| 10. Capsaeformis van Epioblasma | Nee | ja |
| 11. Epioblasma florentina aureola | Nee | ja |
| 12. Epioblasma triquetra | Nee | ja |
| 13. Fusconaia cor | Nee | ja |
| 14. Subrotunda van Fusconaia | Nee | ja |
| 15. Lampenilis ovata | Nee | ja |
| 16. Lampsilis siliquoidea | Nee | Nee |
| 17. Costata van Lasmigona | Nee | ja |
| 18. Rimosus van Lemiox | Nee | ja |
| 19. Lexingtonia dolabelloides | Nee | ja |
| 20. Conradicus van Medionidus | Nee | ja |
| 21. Cyphyus van Plethobasus | Nee | ja |
| 22. Pleurobema plenum | Nee | ja |
| 23. Fasciolaris van Ptychobranchus | Nee | ja |
| 24. Subtentus van Ptychobranchus | Nee | ja |
| 25. Pustulosa van Quadrula | Nee | ja |
| 26. Strophitus undulatus | Nee | ja |
| 27. De iris van Villosa | Nee | ja |
Tabel 2: Een lijst van soorten die worden gebruikt voor de in-vitro specificiteitstests van de A.lig.1-test. De test versterkte genomisch DNA van het doelwit (Actinonaias ligamentina) en versterkte geen van de niet-doelsoorten.
| bestanddeel | Reeks 5'-3' | ||||
| Actinonaias ligementina standaard | CCCTCATCACGTAC CTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA | ||||
| AAGCCCTCGGGT ACTTTCAAATCCGAAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC | |||||
| CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT | |||||
| CAAACTACCTACCCTTCATCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGCACTTAGACTTT | |||||
| GACAATTATTTCCATCCTTTATANTATCATCCCAAATANTTTTTGGTATGCTCCTATTCT | |||||
| TGTGTATCTCCTCCCTAGCTGTTTATACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA | |||||
| AATATGCCCTTTTAGGAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA | |||||
| TAAC | |||||
| IPC-sjabloon (Hem-T) | CTACATAAGTAACACCTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCTCTCAGACGCT | ||||
| GTATGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCGGCTGCTCTATGTTCTCAAGGACTGCAC | |||||
Tabel 3: Volgorde (5'-3') van de Actinonaias ligamentina-standaard en het IPC-sjabloon (Hem-T) dat voor deze test wordt gebruikt. De volgorde voor de voorwaartse en omgekeerde primers is vet en cursief en die van de sonde wordt onderstreept.
| bestanddeel | naam | Reeks 5' – 3' | Fluorescerend label | |
| Voorwaartse primer | Hemt-F | TCTGAGTGTCCCTCGAATCT | ||
| Omgekeerde primer | HemT-R | GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC | ||
| sonde | HemT-P | TGACAGTCTCCTTTCGTGTGAACATTCG | Cy5 | |
Tabel 4: De interne positieve controle (IPC) test inclusief sequenties voor de voorwaartse en omgekeerde primers en de sonde.
| Volume per monster (μL) | bestanddeel |
| 10 | Milieu Master Mix |
| 1 | 20uM A. lig.1 F/R mix |
| 1 | 2.5uM A. lig.1 sonde |
| 1 | 5uM IPC primer mix (HemT-F/R) |
| 0.75 | 2.5uM IPC sonde (HemT-P) |
| 1.5 | 1 X 103 concentratie van de IPC-template |
| 2.75 | H20 |
| 2 | monster |
| 20 | Totaal volume |
Tabel 5: De PCR-mix die wordt gebruikt voor de A.lig.1-test, gemulderd met de IPC-test.
| stap | Temperatuur (°C ) | Tijd | |
| 1 | Eerste denature | 95 | 10 min |
| 2 | Denature | 95 | 15 seconden |
| 3 | Annealing | 60 | 1 minuut |
| 4 | Ga naar stap 2, herhaal 39x |
Tabel 6: Reactievoorwaarden voor de A.lig.1-test.
Discussion
Zoals bij elke studie is het definiëren van de vraag die moet worden aangepakt de eerste stap en het ontwerp van de eDNA-test hangt af van de reikwijdte van de studie26. Als het doel van het onderzoek of onderzoek bijvoorbeeld is om een of enkele soorten te detecteren, is een gerichte test op basis van sondes het beste. Als het echter doel is om een grotere suite of assemblage van soorten te beoordelen, zijn metafosecoding-assays met hoge doorvoer beter geschikt. Zodra is bepaald welke aanpak moet worden gevolgd, wordt een pilotstudie aanbevolen, inclusief het ontwerp, het testen en de optimalisatie van tests24. Assay ontwerp begint met een lijst van soorten zoals beschreven in Figuur 1. Deze lijst zal de basis vormen om te begrijpen hoe goed een test presteert in termen van specificiteit en het geografische bereik waarop het kan worden toegepast6,10. Het wordt aangemoedigd om de test voor een specifiek geografisch gebied te ontwerpen, zodat de ontwerper een test op kruisreactiviteit ten opzichte van andere soorten in dat gebied beter kan testen, en zich bewust te zijn van de beperkingen die dit heeft op het uitbreiden van een test naar andere gebieden waar een doelsoort kan voorkomen24. Zodra de lijst is voltooid, kunnen sequenties worden gedownload van openbare genetische databases. Aangezien deze databanken onvolledig zijn27, moet men zoveel mogelijk soorten op de lijst in eigen huis sequencen om de lokale referentiedatabase van sequenties te voltooien die zullen worden gebruikt bij het ontwerpen van de test. Geef prioriteit aan co-optredende nauw verwante soorten, omdat dit de meest waarschijnlijke niet-doelen zijn die zullen versterken. Focussen op alle soorten binnen hetzelfde geslacht of dezelfde familie als de doelsoort is een goede plek om te beginnen. Vergelijkingen met nauw verwante soorten zullen helpen bij het identificeren van sequentiegebieden die uniek zijn voor de doelsoort. Dit kan helpen om te informeren hoe de test op andere systemen of locaties kan presteren. Mitochondriale regio's zijn de gebruikelijke keuze voor de ontwikkeling van assays, omdat meer sequentie-informatie van een grotere verscheidenheid aan soorten beschikbaar is bij mitochondriale genen die zijn gebruikt in barcode van levensprojecten, en omdat mitochondriaal DNA aanwezig is in een veel grotere concentratie in kopieën / cel dan nucleair DNA24,28,29. Meerdere genregio's moeten worden beoordeeld voor verdere testontwikkeling, aangezien de sequentiedekking varieert tussen taxa in de databases van genetische opslagplaatsen. Nadat deze lokale database met referentiesequenties is gemaakt, wordt een combinatie van handmatige visualisatie van uitgelijnde sequentiegegevens en computersoftwareprogramma's gebruikt om de primer/ probe-tests te ontwerpen. Men moet niet strikt vertrouwen op software om te bepalen welke tests moeten worden getest. Het is belangrijk om visueel te controleren op uitlijningen waar de primers en sondes op de doelen en niet-doelen zitten om een beter begrip te krijgen van hoe ze in een PCR kunnen handelen. Ten slotte omvat de testscreening en optimalisatie drie niveaus (in silico, in vitro en in situ)6,7,24,25. In silico zijn ontwerp en testen belangrijk voor het produceren van een korte lijst van tests met een goede kans op succes, maar empirische (in vitro) testen is cruciaal voor het selecteren van de test met de beste werkelijke prestaties. In vitro optimalisatie en testen van tests omvatten het meten van de reactie-efficiëntie en het definiëren van de gevoeligheid en specificiteit van de test. Grenzen van detectie en kwantificering zijn twee parameters die vaak over het hoofd worden gezien bij de ontwikkeling van de test, maar belangrijk zijn voor de interpretatie van gegevens. Door meerdere replica's van de standaardcurves voor een test uit te voeren, kunnen LOD en LOQ eenvoudig worden gemeten1,5,30. Weinig studies bespreken resultaten met betrekking tot de LOD of LOQ van de assay, maar Sengupta et al. (2019) nemen de LOD en LOQ van hun assay op in hun gegevensinterpretatie en afbeeldingen voor een duidelijker begrip van hun resultaten31. Interne positieve controles moeten ook worden gemul veelvoudig in de ontworpen test. Zonder tests op PCR-remming in de monsters kunnen valse negatieven optreden24,32. We stellen het gebruik van een multiplexed IPC-test voor met de doeltest als de gemakkelijkste methode voor PCR-remmingstests23. Ten slotte is het in situ testen van de test van in het veld en in het laboratorium verzamelde monsters noodzakelijk om ervoor te zorgen dat doelversterking plaatsvindt in milieumonsters24.
Er bestaan beperkingen voor het gebruik van soortspecifieke, op sondes gebaseerde qPCR-tests met eDNA-monsters. Het ontwerp van meerdere tests voor tests kan bijvoorbeeld worden beperkt door de beschikbaarheid van de reeks en er kunnen compromissen nodig zijn over aspecten van de testprestaties. Deze keuzes moeten worden geleid door de doelstellingen van het onderzoek en moeten worden gerapporteerd met de resultaten26. Als het doel bijvoorbeeld detectie van een zeldzame soort is en er weinig positieven worden verwacht, kan een test met onvolmaakte specificiteit (d.w.z. versterking van niet-doelsoorten) worden gebruikt als alle detecties worden geverifieerd door middel van sequencing. Als het doel is om het geografische bereik van een soort te bewaken en eDNA-concentratiegegevens niet nodig zijn, kan een test met onvolmaakte efficiëntie worden gebruikt en gegevens alleen worden gerapporteerd als procentuele detectie. Bovendien kan men, tenzij alle potentiële specifieke kenmerken in het laboratorium worden getest, wat zelden mogelijk is, niet met absolute zekerheid de ware specificiteit van een test kennen. De test is bijvoorbeeld ontworpen en getest op verschillende zoetwatermosselsoorten in de Clinch-rivier. Om deze test in een ander riviersysteem te gebruiken, zouden we het moeten testen op een reeks soorten op de nieuwe locatie. Genetische variatie binnen de soort of populatie die niet wordt getest tijdens de ontwikkeling van de test kan ook van invloed zijn op de specificiteit. Ten slotte, zelfs als is geverifieerd dat een test hoge technische prestaties heeft; omstandigheden veranderen bij het werken in het veld. Niet-assay-gerelateerde omstandigheden zoals waterstroom, pH en diergedrag kunnen de detecteerbaarheid van eDNA veranderen, net als het gebruik van verschillende eDNA-verzamel- en extractieprotocollen. Het gebruik van assays die zijn geoptimaliseerd en goed beschreven, zal helpen het begrip van de invloed van dergelijke parameters op eDNA-detectie te vergemakkelijken.
Het gebied van eDNA rijpt verder dan het stadium van verkennende analyse tot toenemende standaardisatie van methoden en technieken. Deze ontwikkelingen zullen ons begrip van eDNA-technieken, -vaardigheden en -beperkingen verbeteren. Het optimalisatieproces dat we hierboven schetsen, verbetert de gevoeligheid, specificiteit en reproduceerbaarheid van een test. Het uiteindelijke doel van deze verfijning en standaardisatie van eDNA-methoden is om de mogelijkheden van onderzoekers te verbeteren om conclusies te getrokken op basis van eDNA-gegevens en het vertrouwen van eindgebruikers en stake-holder in resultaten te vergroten.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling. De financieringssponsors hadden geen rol in de opzet van de studie; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; in het schrijven van het manuscript; of in het besluit om de resultaten te publiceren.
Acknowledgments
We danken Alvi Wadud en Trudi Frost die hebben geholpen bij de ontwikkeling en het testen van primers. Financiering voor het in deze studie gerapporteerde assay-ontwerp werd verstrekt door het Department of Defense Strategic Environmental Research and Development Program (RC19-1156). Elk gebruik van handels-, product- of bedrijfsnamen is alleen voor beschrijvende doeleinden en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid. Gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd, zijn beschikbaar als een USGS-gegevensrelease https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | - | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
References
- Kubista, M., et al.
- Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology. 10, 5 (1992).
- Mauvisseau, Q., et al. Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches. Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).
- Hernandez, C., et al. 60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada. Environmental DNA. , (2020).
- Klymus, K. E., et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays. Environmental DNA. , (2019).
- Thalinger, B., et al. A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring. bioRxiv. , (2020).
- Helbing, C. C., Hobbs, J. Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring. CSA Group. , (2019).
- Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management. Trends in Ecology & Evolution. , (2020).
- Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).
- Prediger, E. How to design primers and probes for PCR and qPCR. IDT. , Available from: http://www.idtdna.cco/pages/education/decoded/article/designing-pcr-primers-and-probes (2020).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).
- Owczarzy, R., et al. IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 163-169 (2008).
- Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research. 35, Web Server issue 43-46 (2007).
- Taylor, S. C., et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 5279. , ed Bio-Rad (2020).
- Bio-Rad. Bio-Rad Vol. 6894. , Bio-Rad (2020).
- Eurogentec. Eurogentec. Vol. 0708-V2. , ed Eurogentec (2020).
- Bustin, S., Huggett, J.
- Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
- Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
- Guan, X., et al. Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America. Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).
- Mosher, B. A., et al. Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners. Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).
- Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences. Cladistics. 28, 6 (2012).
- Rees, H. C., et al. REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).
- Evans, N. T., Lamberti, G. A. Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool. Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Sengupta, M. E., et al. Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).
- Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix. Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).
