Purificação de Tubulin com Modificações Pós-Translacionais Controladas e Isótipos de Fontes Limitadas por Ciclos de Polimerização-Despolimerização

Resumo

Este protocolo descreve a purificação de tubulinas a partir de fontes de pequena/média escala, como células cultivadas ou cérebros de camundongos únicos, usando ciclos de polimerização e despomerização. A tubulina purificada é enriquecida em isótipos específicos ou tem modificações pós-transacionais específicas e pode ser usada em ensaios de reconstituição in vitro para estudar dinâmicas e interações de microtúbulos.

Resumo

Um aspecto importante dos estudos do citoesqueleto microtúbulo é a investigação do comportamento microtúbulo em experimentos de reconstituição in vitro. Permitem a análise das propriedades intrínsecas dos microtúbulos, como a dinâmica, e suas interações com proteínas associadas a microtúbulos (MAPs). O "código tubulina" é um conceito emergente que aponta diferentes isótipos de tubulina e várias modificações pós-transacionais (PTMs) como reguladores de propriedades e funções de microtúbulos. Para explorar os mecanismos moleculares do código tubulina, é crucial realizar experimentos de reconstituição in vitro usando tubulina purificada com isótipos específicos e PTMs.

Até hoje, isso foi tecnicamente desafiador como tubulina cerebral, que é amplamente utilizada em experimentos in vitro, abriga muitos PTMs e tem uma composição de isótipo definida. Assim, desenvolvemos este protocolo para purificar tubulina de diferentes fontes e com diferentes composições isótipos e PTMs controlados, utilizando a abordagem clássica dos ciclos de polimerização e despomerização. Em comparação com os métodos existentes baseados na purificação da afinidade, essa abordagem produz tubulina pura e competente para polimerização, uma vez que a tubulina resistente à polimerização ou despomerização é descartada durante as sucessivas etapas de purificação.

Descrevemos a purificação da tubulina das linhas celulares, cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes, e de cérebros de camundongos únicos. O método descreve pela primeira vez a geração de massa celular tanto em configurações de suspensão quanto aderentes, a etapa de lise, seguida pelos sucessivos estágios de purificação da tubulina por ciclos de polimerização-despomerização. Nosso método produz tubulina que pode ser usada em experimentos que abordam o impacto do código tubulina nas propriedades intrínsecas de microtúbulos e interações microtúbulas com proteínas associadas.

Introdução

Os microtúbulos desempenham papéis críticos em muitos processos celulares. Eles dão às células sua forma, constroem fusos meioticos e mitóticos para segregação de cromossomo, e servem como trilhas para o transporte intracelular. Para desempenhar essas diversas funções, os microtúbulos se organizam de diferentes formas. Uma das questões intrigantes no campo é entender os mecanismos moleculares que permitem que os microtúbulos conservados estrutural e evolutivamente se adaptem a essa infinidade de organizações e funções. Um mecanismo potencial é a diversificação de microtúbulos, que é definido pelo conceito conhecido como 'código tubulina'^1,....

Protocolo

O cuidado e o uso dos animais para este estudo foram realizados de acordo com as recomendações da Comunidade Europeia (2010/63/UE). Os procedimentos experimentais foram especificamente aprovados pelo comitê de ética do Institut Curie CEEA-IC #118 (autorização nº 04395.03 dada pela Autoridade Nacional) em conformidade com as diretrizes internacionais.

1. Preparação de reagentes para purificação de tubulina

NOTA: Todos os tampões utilizados para a purificação de tubulina devem conter sais de potássio e não sais de sódio³⁰.

1. Prepare 1 L de meio completo: médio águia modificado de Dul....

Resultados

O principal objetivo deste método é produzir tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades suficientes para realizar experimentos in vitro repetidos com os componentes purificados. Microtúbulos montados a partir deste tubúnel pode ser usado em ensaios de reconstituição baseados na técnica total de microscopia de reflexão interna (TIRF) com microtúbulos dinâmicos ou estáveis, em experimentos testando dinâmicas de microtúbulos, interações com MAPs ou motores moleculares, e geração de força pelos moto.......

Discussão

O método descrito aqui fornece uma plataforma para gerar rapidamente tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades médias-grandes de linhas celulares e cérebros de camundongos únicos. Baseia-se no protocolo padrão-ouro da purificação de tubulinas de cérebros bovinos usados no campo por muitos anos^16,17. Uma vantagem particular da abordagem é o uso de culturas de suspensão das células HeLa S3, que, uma vez estabelecidas, produzem grandes qua.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1  M MgCl2	Sigma	#M1028
vasos de cultura de células de 1-L	Techne F7610		Usado para culturas giratórias. Nunca mexa as garrafas giratórias vazias. Quando os frascos giratórios estiverem na incubadora de cultura de células, mantenha sempre as válvulas laterais dos frascos giratórios ligeiramente abertas para facilitar o equilíbrio do meio com a incubadora' s atmosfera. Após o uso, encha os frascos giratórios imediatamente com água da torneira para evitar o ressecamento das células restantes nas paredes do frasco. Lave as garrafas com água desionizada, adicione 200 ml de água desionizada e autoclave. Sob um capuz de cultura de células estéril, remova a água e deixe as garrafas secarem completamente, ainda sob o capô, por várias horas. Nunca use detergentes para limpar os frascos giratórios, pois qualquer vestígio do detergente pode ser prejudicial para as células.
Tubos de 1,5 e 2 ml Tubos
de fundo redondo de 14 ml Placas
			de cultura estéreis de 15 cm de diâmetro
Tubos de tampa de rosca de 15 ml
	Sigma	#M3148	2-mercaptoetanol é tóxico e deve ser usado sob o capô.
Fluoreto de 4-(2-aminoetil)-benzenossulfonil	Sigma
40% de acrilamida	Bio-Rad	#161-0140
			de 5, 10 ml e 20 ml
Pipetas estéreis de 5 ml, 10 ml, 25 ml Tubos
com tampa de rosca de 50 ml Persulfato
de amônio (APS)	Sigma	#A3678
Anticorpo anti-alfa-tubulina, 12G10	Desenvolvido por J. Frankel e M. Nelson, obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank, desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa		diluição: 1/500
Anticorpo anti-glutamilado tubulina, GT335	AdipoGen	#AG-20B-0020	diluição: 1/20.000
Aprotinina	Sigma
Balance (0.1 – 10 g)
Garrafas de polipropileno Beckman de 1 l			Para coletar culturas spinner
Centrífuga			Para coletar culturas spinners
Agitador biológico	Techne MCS-104L		Instalado na incubadora de cultura de células (para culturas giratórias), 25 rpm para células Hela S3 e HEK 293
Bis N,N'-Metileno-Bis-Acrilamida	Bio-Rad	#161-0201
Liquidificador IKA Ultra-Turrax®			Para lisar o tecido cerebral, use uma sonda de 5 mm, com a máquina ajustada na potência 6 ou 7. Misture o tecido cerebral 2-3 vezes por 15 s no gelo.
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma
Azul de bromofenol	Sigma	#1.08122
Carboxipeptidase A (CPA)	Sigma	#C9268	Concentração: 1.7  U/µ l
Capuz
de células Incubadora de cultura de células ajustada a 37° C, 5% de CO2
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	#D8418	DMSO pode aumentar a permeabilidade celular e cutânea de outros compostos. Evite o contato e use proteção para a pele e os olhos.
Meio DMEM	Tecnologias de Vida	#41965062
TDT, DL-Ditiotreitol	Sigma
EDTA	Euromedex	#EU0007-C
EGTA	Sigma
Etanol absoluto	Fisher Chemical	#E/0650DF/15
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma
prensa de célula de pressão francesa	Thermo electron corporation	#FA-078A	com uma célula #FA-032; para lisar grandes quantidades de células. Defina na proporção média e a pressão manométrica de 1.000 psi (corresponde a 3.000 psi dentro da câmara de interrupção).
Glicerol	VWR Chemicals	#24388.295
Glicina	Sigma	#G8898
GTP	Sigma
Bloco de aquecimento	Stuart
células Hela		ATCC® CCL-2™
Células Hela S3	ATCC	ATCC® CCL-2.2™
Ácido clorídrico (HCl)	VWR	# 20252.290
Microscópio invertido			Com fluorescência, se a transfecção celular for verificada
Isopropanol	VWR	#20842.298
jetPEI	Polyplus	#101
JLA-8.1000 rotor			Para colecionar culturas giratórias
KOH	Sigma	#P1767	KOH é corrosivo e causa queimaduras; use proteção para os olhos e a pele.
L-Glutamina	Tecnologias de Vida	#25030123
Centrífuga de laboratório para tubos de 50 ml	Sigma	4-16 K
Leupeptina	Sigma	#L2884
Nitrogênio líquido
Micro-pipetas p2.5, p10, p20, p100, p200 e p1000 e pontas
Micropilões	Eppendorf	#0030 120.973
Tecido cerebral de camundongo			Os cuidados e o uso de animais para este estudo foram realizados de acordo com as recomendações da Comunidade Europeia (2010/63/UE). Os procedimentos experimentais foram especificamente aprovados pelo comitê de ética do Institut Curie CEEA-IC #118 (autorização nº 04395.03 dada pela Autoridade Nacional) em conformidade com as diretrizes internacionais.
Agulhas 18G X 1 ½ ” (1,2 x 38 milímetros	Agulhas Terumo	#18G
20G X 1 ½ ” (0,9 x 38 milímetros	Agulhas Terumo	#20G
21G X 4 ¾ ” (0,8 x 120 milímetros	B.Braun	#466 5643
Parafilm
PBS	Tecnologias de Vida	#14190169
Penicilina-estreptomicina	Tecnologias de Vida	#15140130
medidor
Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)	Sigma	#P7626	pó de PMSF é perigoso. Use proteção para a pele e os olhos ao preparar soluções de PMSF.
PIPES	Sigma
Rotores Pipeta-boy
Beckman	70.1 Ti; TLA-100.3; e equipamento de eletroforese TLA 55
SDS-PAGE	Bio-Rad
SDS, Dodecil sulfato de sódio	VWR	#442444H	Para preparar o tampão Laemmeli
SDS, Dodecil sulfato de sódio	Sigma	#L5750	Para preparar géis 'TUB' SDS-PAGE
Sonicator	Branson	# 101-148-070	Usado para lisar células cultivadas como culturas aderentes. Use sonda de 6.5 mm de diâmetro, ajuste o sonicador em " Controle de saída" 1, " Ciclo de trabalho" 10% e tempo dependendo do tipo de célula utilizada.
Centrífuga de mesa para tubos de 1,5 ml	Eppendorf	5417R
TEMED, N, N, N′, N′-Tetrametiletilenodiamina	Sigma	#9281
Trichostatin A (TSA)	Sigma	#T8552
Triton X-100	Sigma
Base Trizma (Tris)	Sigma
tripsina	Life Technologies	#15090046
Rotores de ultracentrífuga		Rotores TLA-55, TLA-100.3 e 70.1 Ti ajustados	em 4° C ou 30 graus C com base na necessidade do experimento
Tubos de ultracentrífuga	Beckman	#357448	para uso com rotor TLA-55
Tubos de ultracentrífuga	Beckman	#349622	de rotor TLA-100.3
	Beckman	#355631	para uso com rotor de 70,1 Ti
Ultracentrífugas	Beckman	Optima L80-XP (ou equivalente) e Optima MAX-XP (ou equivalente)	Ajustadas em 4° C ou 30 graus C com base na necessidade do experimento
			de vórtice
Banho de água equipado com flutuadores ou suportes			Ajustado em 30° C