Este protocolo descreve a purificação de tubulinas a partir de fontes de pequena/média escala, como células cultivadas ou cérebros de camundongos únicos, usando ciclos de polimerização e despomerização. A tubulina purificada é enriquecida em isótipos específicos ou tem modificações pós-transacionais específicas e pode ser usada em ensaios de reconstituição in vitro para estudar dinâmicas e interações de microtúbulos.
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Artigo de método
Purificação de Tubulin com Modificações Pós-Translacionais Controladas e Isótipos de Fontes Limitadas por Ciclos de Polimerização-Despolimerização
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Um aspecto importante dos estudos do citoesqueleto microtúbulo é a investigação do comportamento microtúbulo em experimentos de reconstituição in vitro. Permitem a análise das propriedades intrínsecas dos microtúbulos, como a dinâmica, e suas interações com proteínas associadas a microtúbulos (MAPs). O "código tubulina" é um conceito emergente que aponta diferentes isótipos de tubulina e várias modificações pós-transacionais (PTMs) como reguladores de propriedades e funções de microtúbulos. Para explorar os mecanismos moleculares do código tubulina, é crucial realizar experimentos de reconstituição in vitro usando tubulina purificada com isótipos específicos e PTMs.
Até hoje, isso foi tecnicamente desafiador como tubulina cerebral, que é amplamente utilizada em experimentos in vitro, abriga muitos PTMs e tem uma composição de isótipo definida. Assim, desenvolvemos este protocolo para purificar tubulina de diferentes fontes e com diferentes composições isótipos e PTMs controlados, utilizando a abordagem clássica dos ciclos de polimerização e despomerização. Em comparação com os métodos existentes baseados na purificação da afinidade, essa abordagem produz tubulina pura e competente para polimerização, uma vez que a tubulina resistente à polimerização ou despomerização é descartada durante as sucessivas etapas de purificação.
Descrevemos a purificação da tubulina das linhas celulares, cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes, e de cérebros de camundongos únicos. O método descreve pela primeira vez a geração de massa celular tanto em configurações de suspensão quanto aderentes, a etapa de lise, seguida pelos sucessivos estágios de purificação da tubulina por ciclos de polimerização-despomerização. Nosso método produz tubulina que pode ser usada em experimentos que abordam o impacto do código tubulina nas propriedades intrínsecas de microtúbulos e interações microtúbulas com proteínas associadas.
Introdução
Os microtúbulos desempenham papéis críticos em muitos processos celulares. Eles dão às células sua forma, constroem fusos meioticos e mitóticos para segregação de cromossomo, e servem como trilhas para o transporte intracelular. Para desempenhar essas diversas funções, os microtúbulos se organizam de diferentes formas. Uma das questões intrigantes no campo é entender os mecanismos moleculares que permitem que os microtúbulos conservados estrutural e evolutivamente se adaptem a essa infinidade de organizações e funções. Um mecanismo potencial é a diversificação de microtúbulos, que é definido pelo conceito conhecido como 'código tubulina'1,....
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Protocolo
O cuidado e o uso dos animais para este estudo foram realizados de acordo com as recomendações da Comunidade Europeia (2010/63/UE). Os procedimentos experimentais foram especificamente aprovados pelo comitê de ética do Institut Curie CEEA-IC #118 (autorização nº 04395.03 dada pela Autoridade Nacional) em conformidade com as diretrizes internacionais.
1. Preparação de reagentes para purificação de tubulina
NOTA: Todos os tampões utilizados para a purificação de tubulina devem conter sais de potássio e não sais de sódio30.
- Prepare 1 L de meio completo: médio águia modificado de Dul....
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Resultados
O principal objetivo deste método é produzir tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades suficientes para realizar experimentos in vitro repetidos com os componentes purificados. Microtúbulos montados a partir deste tubúnel pode ser usado em ensaios de reconstituição baseados na técnica total de microscopia de reflexão interna (TIRF) com microtúbulos dinâmicos ou estáveis, em experimentos testando dinâmicas de microtúbulos, interações com MAPs ou motores moleculares, e geração de força pelos moto.......
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Discussão
O método descrito aqui fornece uma plataforma para gerar rapidamente tubulina de alta qualidade e competente para montagem em quantidades médias-grandes de linhas celulares e cérebros de camundongos únicos. Baseia-se no protocolo padrão-ouro da purificação de tubulinas de cérebros bovinos usados no campo por muitos anos16,17. Uma vantagem particular da abordagem é o uso de culturas de suspensão das células HeLa S3, que, uma vez estabelecidas, produzem grandes qua.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo ANR-10-IDEX-0001-02, o LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 e o Institut de convergência Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ é apoiado pelo Institut Curie, a Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) concede ANR-12-BSV2-0007 e ANR-17-CE13-0021, o Institut National du Cancer (INCA) concede 2014-PL BIO-11-ICR-1, e a Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) concede de desconto deQ20170336756. O MMM é apoiado pela fondation vaincre Alzheimer grant FR-16055p, e pela França Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. A JAS foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 6757....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| vasos de cultura de células de 1-L | Techne F7610 | Usado para culturas giratórias. Nunca mexa as garrafas giratórias vazias. Quando os frascos giratórios estiverem na incubadora de cultura de células, mantenha sempre as válvulas laterais dos frascos giratórios ligeiramente abertas para facilitar o equilíbrio do meio com a incubadora' s atmosfera. Após o uso, encha os frascos giratórios imediatamente com água da torneira para evitar o ressecamento das células restantes nas paredes do frasco. Lave as garrafas com água desionizada, adicione 200 ml de água desionizada e autoclave. Sob um capuz de cultura de células estéril, remova a água e deixe as garrafas secarem completamente, ainda sob o capô, por várias horas. Nunca use detergentes para limpar os frascos giratórios, pois qualquer vestígio do detergente pode ser prejudicial para as células. | |
| Tubos de 1,5 e 2 ml Tubos | |||
| de fundo redondo de 14 ml Placas | |||
| de cultura estéreis de 15 cm de diâmetro | |||
| Tubos de tampa de rosca de 15 ml | |||
| Sigma | #M3148 | 2-mercaptoetanol é tóxico e deve ser usado sob o capô. | |
| Fluoreto de 4-(2-aminoetil)-benzenossulfonil | Sigma | ||
| 40% de acrilamida | Bio-Rad | #161-0140 | |
| de 5, 10 ml e 20 ml | |||
| Pipetas estéreis de 5 ml, 10 ml, 25 ml Tubos | |||
| com tampa de rosca de 50 ml Persulfato | |||
| de amônio (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anticorpo anti-alfa-tubulina, 12G10 | Desenvolvido por J. Frankel e M. Nelson, obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank, desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa | diluição: 1/500 | |
| Anticorpo anti-glutamilado tubulina, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | diluição: 1/20.000 |
| Aprotinina | Sigma | ||
| Balance (0.1 – 10 g) | |||
| Garrafas de polipropileno Beckman de 1 l | Para coletar culturas spinner | ||
| Centrífuga | Para coletar culturas spinners | ||
| Agitador biológico | Techne MCS-104L | Instalado na incubadora de cultura de células (para culturas giratórias), 25 rpm para células Hela S3 e HEK 293 | |
| Bis N,N'-Metileno-Bis-Acrilamida | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Liquidificador IKA Ultra-Turrax® | Para lisar o tecido cerebral, use uma sonda de 5 mm, com a máquina ajustada na potência 6 ou 7. Misture o tecido cerebral 2-3 vezes por 15 s no gelo. | ||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma | ||
| Azul de bromofenol | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxipeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentração: 1.7 U/µ l |
| Capuz | |||
| de células Incubadora de cultura de células ajustada a 37° C, 5% de CO2 | |||
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO pode aumentar a permeabilidade celular e cutânea de outros compostos. Evite o contato e use proteção para a pele e os olhos. |
| Meio DMEM | Tecnologias de Vida | #41965062 | |
| TDT, DL-Ditiotreitol | Sigma | ||
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | ||
| Etanol absoluto | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Sigma | ||
| prensa de célula de pressão francesa | Thermo electron corporation | #FA-078A | com uma célula #FA-032; para lisar grandes quantidades de células. Defina na proporção média e a pressão manométrica de 1.000 psi (corresponde a 3.000 psi dentro da câmara de interrupção). |
| Glicerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glicina | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | ||
| Bloco de aquecimento | Stuart | ||
| células Hela | ATCC® CCL-2™ | ||
| Células Hela S3 | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Ácido clorídrico (HCl) | VWR | # 20252.290 | |
| Microscópio invertido | Com fluorescência, se a transfecção celular for verificada | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | Para colecionar culturas giratórias | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH é corrosivo e causa queimaduras; use proteção para os olhos e a pele. |
| L-Glutamina | Tecnologias de Vida | #25030123 | |
| Centrífuga de laboratório para tubos de 50 ml | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptina | Sigma | #L2884 | |
| Nitrogênio líquido | |||
| Micro-pipetas p2.5, p10, p20, p100, p200 e p1000 e pontas | |||
| Micropilões | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Tecido cerebral de camundongo | Os cuidados e o uso de animais para este estudo foram realizados de acordo com as recomendações da Comunidade Europeia (2010/63/UE). Os procedimentos experimentais foram especificamente aprovados pelo comitê de ética do Institut Curie CEEA-IC #118 (autorização nº 04395.03 dada pela Autoridade Nacional) em conformidade com as diretrizes internacionais. | ||
| Agulhas 18G X 1 ½ ” (1,2 x 38 milímetros | Agulhas Terumo | #18G | |
| 20G X 1 ½ ” (0,9 x 38 milímetros | Agulhas Terumo | #20G | |
| 21G X 4 ¾ ” (0,8 x 120 milímetros | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Tecnologias de Vida | #14190169 | |
| Penicilina-estreptomicina | Tecnologias de Vida | #15140130 | |
| medidor | |||
| Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF) | Sigma | #P7626 | pó de PMSF é perigoso. Use proteção para a pele e os olhos ao preparar soluções de PMSF. |
| PIPES | Sigma | ||
| Rotores Pipeta-boy | |||
| Beckman | 70.1 Ti; TLA-100.3; e equipamento de eletroforese TLA 55 | ||
| SDS-PAGE | Bio-Rad | ||
| SDS, Dodecil sulfato de sódio | VWR | #442444H | Para preparar o tampão Laemmeli |
| SDS, Dodecil sulfato de sódio | Sigma | #L5750 | Para preparar géis 'TUB' SDS-PAGE |
| Sonicator | Branson | # 101-148-070 | Usado para lisar células cultivadas como culturas aderentes. Use sonda de 6.5 mm de diâmetro, ajuste o sonicador em " Controle de saída" 1, " Ciclo de trabalho" 10% e tempo dependendo do tipo de célula utilizada. |
| Centrífuga de mesa para tubos de 1,5 ml | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetrametiletilenodiamina | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | ||
| Base Trizma (Tris) | Sigma | ||
| tripsina | Life Technologies | #15090046 | |
| Rotores de ultracentrífuga | Rotores TLA-55, TLA-100.3 e 70.1 Ti ajustados | em 4° C ou 30 graus C com base na necessidade do experimento | |
| Tubos de ultracentrífuga | Beckman | #357448 | para uso com rotor TLA-55 |
| Tubos de ultracentrífuga | Beckman | #349622 | de rotor TLA-100.3 |
| Beckman | #355631 | para uso com rotor de 70,1 Ti | |
| Ultracentrífugas | Beckman | Optima L80-XP (ou equivalente) e Optima MAX-XP (ou equivalente) | Ajustadas em 4° C ou 30 graus C com base na necessidade do experimento |
| de vórtice | |||
| Banho de água equipado com flutuadores ou suportes | Ajustado em 30° C |
Referências
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M.
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Reimpressões e permissões
