A inserção co-translacional em nanodiscos pré-formados torna possível estudar proteínas de membrana sintetizadas livres de células em ambientes lipídicos definidos sem contato com detergentes. Este protocolo descreve a preparação de componentes essenciais do sistema e os parâmetros críticos para melhorar a eficiência da expressão e a qualidade da amostra.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Inserção Co-Translacional de Proteínas de Membrana em Nanodiscos Pré-Formados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os sistemas de expressão livre de células permitem o design personalizado de ambientes de reação para suportar o dobramento funcional de proteínas complexas até mesmo, como proteínas de membrana. Os procedimentos experimentais para a inserção co-translacional e dobramento de proteínas de membrana em membranas pré-formadas e definidas fornecidas como nanodiscos são demonstrados. O protocolo é completamente livre de detergente e pode gerar miligramas de amostras purificadas dentro de um dia. As amostras de proteína/nanodisco de membrana resultantes podem ser usadas para uma variedade de estudos funcionais e aplicações estruturais, como cristalização, ressonância magnética nuclear ou microscopia eletrônica. A preparação de componentes-chave básicos, como lisatos livres de células, nanodiscos com membranas projetadas, soluções de estoque críticas, bem como a montagem de reações de expressão livre de células de dois compartimentos é descrita. Como os requisitos de dobramento das proteínas de membrana podem ser altamente diversos, um dos principais focos deste protocolo é a modulação de parâmetros e etapas de reação importantes para a qualidade da amostra, como compostos críticos básicos de reação, composição de membrana de nanodiscos, ambiente redox e chaperona ou design de modelo de DNA. Todo o processo é demonstrado com a síntese de proteorhodopsina e um receptor acoplado à proteína G.
Introdução
As proteínas de membrana (MPs) são alvos desafiadores em estudos de produção de proteínas devido à sua insolubilidade em ambientes aquosos. As plataformas convencionais de produção de MP compreendem sistemas baseados em células, como E. coli, levedura ou células eucarióticas. As MPs recombinantes sintetizadas são extraídas das membranas celulares ou redobradas dos corpos de inclusão1. Após a solubilização do detergente, os MPs podem ser transferidos para ambientes de membrana adequados por protocolos de reconstituição in vitro estabelecidos. Além de vesículas e lipossomas, a reconstituição de MP em membranas planares na forma de nanodi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparação do lisado S30
- Dia 1: Retire as células das reservas de glicerol numa placa de ágar LB e incube a 37 °C durante a noite.
- Dia 2: Inocular 200 mL de meio LB com as células da placa de ágar e incubar a 37 °C por 12-14 h.
- Dia 3: Inocular 10 L de meio YPTG estéril (extrato de levedura de 10 g/L, 16 g/L de triptona, NaCl de 5 g/L, glicose de 19,8 g/L, 4,4 mM KH 2 PO 4, 8 mM K2HPO4) temperado a 37 °C em reator tanque agitado de 15 L com 100 mL de pré-cultura (1:100). Cultivar a 37 °C, 500 rpm e alta aeração (~ 3 volumes de ar por minuto). ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O impacto dos compostos de reação de ajuste fino no rendimento final ou na qualidade dos MPs sintetizados é exemplificado. Uma abordagem de rotina frequente é ajustar a concentração ideal de Mg2+ em reações de FC pela expressão de proteína fluorescente verde (GFP) como um monitor conveniente da eficiência do sistema. Como exemplo, a GFP foi sintetizada a partir de um vetor pET-21a(+) em concentrações de Mg 2+ entre 14 e24 mM (Figura 2). A análise SDS-PAGE identificou a .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A configuração e as estratégias para otimizar a expressão da FC e a inserção co-translacional de MPs funcionais em nanodiscos são descritas. O equipamento necessário compreende um biorreator, um dispositivo de prensa francês ou similar, um leitor UV/VIS e de fluorescência, vasos de reação CF adequados para uma configuração de dois compartimentos e uma incubadora com temperatura controlada. Outros equipamentos padrão são centrífugas para a colheita de células de E. coli, bem como centrífugas de mesa que atingem p.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à bolsa BE1911/8-1 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), ao projeto GLUE da LOEWE e ao centro de pesquisa colaborativa Transport and Communication across Membranes (SFB807) pelo apoio financeiro.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sódio) (DMPG) | Avanti Polar Lipids (EUA) | 840445P | |
| 1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) | Avanti Polar Lipids (EUA) | 850345C | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (sal de sódio) (DOPC) | Avanti Polar Lipids (EUA) | 850375C | |
| 1,2 dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) (sal de sódio) (DOPG) | Avanti Polar Lipids (EUA) | 840475C | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) | Avanti Polar Lipids (EUA) | 850457C | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sódio) (POPG) | Avanti Polar Lipids (EUA) | 840034C | |
| 2-Amino-2-(hidroximetil)- propan-1,3-diol (Tris) | Carl Roth (Alemanha) | 4855 | |
| 2-Mercaptoetanol | Carl Roth (Alemanha) | 4227 | |
| 2-Propanol | Carl Roth (Alemanha) | 9781 | |
| [3H]-dihidroalprenolol Cloridrato | Radiolabeled Chemicals (EUA) | ART0134 | |
| Acetil fosfato lítio sal de potássio (ACP) | Merck ( Alemanha) | 1409 | |
| Adenosina 5'-trifosfato (ATP) | Sigma Aldrich (Alemanha) | A9251 | |
| Cloridrato de Alprenolol | Merck (Alemanha) | A0360000 | |
| Material da coluna de cromatografia de troca aniônica: Q-sepharose® | Sigma-Aldrich (Alemanha) | Q1126 | |
| Autoclave Tipo GE 446EC-1 | Gettinge (Alemanha) | ||
| Biorreator Tipo 884 124/1 | B.Braun (Alemanha) | ||
| Centrífuga | Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Alemanha); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Alemanha); Mikro 22 R; Hettich (Alemanha) | ||
| Ácido cólico | Carl Roth (Alemanha) | 8137 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Carl Roth (Alemanha) | 3862 | |
| Balões de cultura Balões defletores de 500 ml, frascos defletores de 2 l | Schott Duran (Alemanha) | ||
| Citidina 5'-trifosfato dissódico sal | Sigma-Aldrich (Alemanha) | C1506 | |
| D-glicose monohidratada | Carl Roth (Alemanha) | 6780 | |
| Di-potássiohidrogenofosfato trihidratado | Carl Roth (Alemanha) | 6878 | |
| Tubo de diálise SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14 kD MWCO Tubulação RC padrão | Fisher Scientific (Alemanha) | 8700152 | |
| Dithiothreit | Carl Roth (Alemanha) | 6908 | |
| Etanol | Carl Roth (Alemanha) | K928 | |
| Ácido folínico hidrato de sal de cálcio | Sigma-Aldrich (Alemanha) | 47612 | |
| Disruptor de célula de pressão francês | SLM; Amico Instruments (EUA) | ||
| Glicerol | Carl Roth (Alemanha) | 3783 | |
| Guanosina 5'-trifosfato dissódico sal (GTP) | Sigma-Aldrich (Alemanha) | G8877 | |
| Ácido clorídrico | Carl Roth (Alemanha) | K025 | |
| Coluna IMAC: HiTrap IMAC HP 5 mL | GE Life Sciences (Alemanha) | GE17-5248 | |
| Imidazol | Carl Roth (Alemanha) | 3899 | |
| Isopropil-β-D-tiogalactopiranóside (IPTG) | Carl Roth (Alemanha) | 2316 | |
| Canamicina | Carl Roth (Alemanha) | T832 | |
| L-Alanina | Carl Roth (Alemanha) | 3076.1 | |
| L-Arginina | Carl Roth (Alemanha) | 6908 | |
| L-Asparagina | Carl Roth (Alemanha) | HN23 | |
| Ácido L-Aspártico | Carl Roth (Alemanha) | T202 | |
| L-Cisteína | Carl Roth (Alemanha) | T203 | |
| Ácido L-Glutâmico | Carl Roth (Alemanha) | 3774 | |
| L-Glutamina | Carl Roth (Alemanha) | 3772 | |
| L-Glicina | Carl Roth (Alemanha) | 3187 | |
| L-Histidina | Carl Roth (Alemanha) | 3852 | |
| L-Isoleucina | Carl Roth (Alemanha) | 3922 | |
| L-Leucina | Carl Roth (Alemanha) | 1699 | |
| L-Lisina | Carl Roth (Alemanha) | 4207 | |
| L-Metionina | Carl Roth (Alemanha) | 9359 | |
| L-Prolina | Carl Roth (Alemanha) | 1713 | |
| L-Fenilalanina | Carl Roth (Alemanha) | 1709 | |
| L-Serina | Carl Roth (Alemanha) | 4682 | |
| L-Treonina | Carl Roth (Alemanha) | 1738 | |
| L-Triptofano | Carl Roth (Alemanha) | 7700 | |
| L-Tirosina | Carl Roth (Alemanha) | T207 | |
| MD100 unidades de diálise | Scienova (Alemanha) | 40077 | |
| N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanossulfônico (HEPES) | Carl Roth (Alemanha) | 6763 | |
| n-dodecilfosfocolina | Antrace (EUA) | F308S | |
| Câmara PAGE: Mini-Protean Tetra Cell | Biorad (Alemanha) | ||
| Sistema de fundição em gel PAGE: Mini Protean Handcast systems | Biorad (Alemanha) | ||
| Fonte de alimentação em gel PAGE: Power Pac 3000 | Biorad (Alemanha) | ||
| Triptona/peptona de caseína | Carl Roth (Alemanha) | 6681 | |
| Bomba peristáltica: ip-12 | Ismatec (Alemanha) | ||
| Sal monopotássico de pirouvato de fosfoenol | Sigma Aldrich (Alemanha) | 860077 | |
| Dihidrogenofosfato de potássio | Carl Roth (Alemanha) | P018 | |
| Acetato de potássio | Carl Roth (Alemanha) | 4986 | |
| Cloreto de potássio | Carl Roth (Alemanha) | 6781 | |
| Piruvato quinase | Roche (Alemanha) | 10109045001 | |
| Contador de cintilação: Hidex 300 SL | Hidex (Finlândia) | ||
| Pellets SDS | Carl Roth (Alemanha) | 8029 | |
| Azida de sódio | Sigma-Aldrich (Alemanha) | K305 | |
| Cloreto de sódio | Carl Roth (Alemanha) | P029 | |
| Espectrofotômetro Nanodrop | Peqlab (Alemanha) | ||
| Espectrofotômetro/leitor de fluorescência Spark® | Tecan (Suíça) | ||
| tRNA (E. coli) | Roche (Alemanha) | 10109550001 | |
| Ultra sonificator | Labsonic U, B. Braun (Alemanha) | ||
| Uridina 5'-trifosfato trissódico sal (UTP) | Sigma-Aldrich (Alemanha) | U6625 | |
| Y-30 antiespumante | Sigma-Aldrich (Alemanha) | A6457 | |
| Extrato de levedura | Carl Roth (Alemanha) | 2904 |
Referências
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Ritchie, T. K., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
