Um modelo de linfedema de cauda murina

Linfedema é inchaço na extremidade causado por disfunção linfática. O membro afetado aumenta devido ao acúmulo de fluido, adiposo e fibrose¹. Linfedema afeta 250 milhões de pessoas em todo o mundo^2,3,4. Estima-se que 20-40% das pacientes que se submetem ao tratamento de malignidades sólidas, como câncer de mama, melanoma, tumores ginecológicos/urológicos, ou sarcomas, desenvolvem linfedema^2,4,5. A morbidade do linfedema inclui infecções recorrentes, dor e deformidade⁶. Não há cura para esta doença progressiva ao longo da vida. As terapias atuais são variadas por⁷ eficazes e incluem compressão, terapia descongestória completa por fisioterapeutas, procedimentos excisionais e operações microcirúrgicas, incluindo transferência vascularizada de linfonodo e bypass linfovennoso^{7,8,9,10,11,12,13,14}. O tratamento ideal para linfedema ainda não foi descoberto.

O estudo do mecanismo e terapia do linfedema tem sido limitado. Há um início médio de atraso de um ano após a lesão linfática^15,16 e a maioria dos indivíduos que experimentam insulto iatrogênico com radiação e cirurgia não desenvolvem linfedema^4,6,17. Embora grandes modelos animais, incluindo caninos, ovinos e suínos tenham sido descritos^18,19,20, o modelo de cauda de rato tem sido o mais amplamente aplicado por causa da facilidade, custo e reprodução. Os modelos de camundongos para investigar linfedema incluem um modelo de cauda, ablação linfática mediada por difteria e dissecção de linfonodo axilar ou popliteal^{21,22,23,24,25,26}. A maioria dos modelos de cauda utiliza uma excisão focal de pele de espessura total com recorte de canal linfático que é realizado perto da base da cauda²², resultando em inchaço na cauda e características histológicas semelhantes ao linfedema humano^24,27,28,29. No entanto, o modelo padrão de cauda murina normalmente se resolve em apenas 20 dias e é acompanhado por necrose periódica da cauda³⁰. O modelo de cauda do rato linfedema estende um linfedema sustentado para além de 15 semanas, demonstra patência arterial e venosa confirmada e permite avaliação de disfunção linfática funcional.

Um modelo de cauda murina de linfedema permite a avaliação de novas terapêuticas para tratar linfedema. Estratégias baseadas em genes têm sido usadas no modelo de mouse mediado pelos vetores virais^31,32. Também usamos uma nova tecnologia de nanotransfesão de tecido (TNT) para entrega de carga genética à cauda linfática do rato. A TNT facilita a entrega direta e transcutânea de genes usando um chip com nanocanais em um campo elétrico rápido^{focado 33,34,35,36}. O modelo inclui o uso do TNT_2.0 para permitir a entrega de genes focais de potenciais terapêuticas baseadas em genes para o local de lesão linfática da cauda do rato³⁵.

O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa animal da instituição. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Indiana. Os animais foram alojados sob um ciclo claro-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.

1. Interrupção cirúrgica de linfáticos da cauda do rato

1. Use camundongos C57BL/6 de oito semanas de idade de distribuição igualitária de gênero.
2. Coloque um rato sob anestesia geral em uma câmara de indução com isoflurane de 3-4% em 100% de oxigênio seguido de sedação de manutenção em 1-3% durante o procedimento.
3. Administre 0,5 mg/kg de liberação sustentada (RS) de buprenorfina subcutânea para o controle da dor.
   NOTA: Medicamentos analgésicos adicionais administrados após a operação: Carprofen uma vez a cada 24 h por pelo menos 48 h e Bupivacaína uma vez após a incisão foi feita ou antes de fechar a incisão, aplicada pingando nas bordas da pele (dura até 4 - 6 h).
4. Posicione o rato dorsalmente e prepare a cauda com 70% de álcool isopropílico.
5. Meça o diâmetro da cauda antes do procedimento em incrementos de 5 mm a partir da base da cauda usando uma pinça. Estas medidas serão usadas para calcular o volume usando a equação do cone truncado³⁷.
6. Marque uma excisão circunferencial de 3 mm na cauda a 20 mm da base.
7. Realize uma meticulosa excisão de pele de 3 mm de espessura total com uma lâmina cirúrgica estéril (tamanho 15), deixando toda a vasculatura subjacente intacta sob ampliação microscópica cirúrgica. Incisar a marca circunferencial superior (20 mm da base da cauda) primeiro através da dermis seguido por uma incisão de espessura total circunferencial 3 mm distlal à primeira incisão.
   1. Faça uma incisão vertical de espessura total perpendicular para conectar as duas incisões. Use uma picape fina dentada para agarrar uma borda de ponta e use microscissores para dissecar cuidadosamente profundamente dentro do plano avascular para a derme e superficial para a veia adventitia.
8. Injete 0,1 mL de isosulfan azul (1%) subcutâneamente proximal à ponta da cauda.
9. Identifique os dois canais linfáticos adjacentes às veias laterais da cauda sob o microscópio cirúrgico. Os linfáticos aparecerão azuis por causa da injeção de isosulfan. Transecte os linfáticos usando tesoura microcirúrgica reta. Use a tesoura para dissecar cuidadosamente um plano entre a veia lateral e o linfático. Em seguida, passe a ponta de uma lâmina de tesoura entre o vaso linfático e a veia lateral e feche as lâminas para transectar o vaso linfático.
10. Vista a ferida da cauda com um curativo transparente estéril. Verifique as incisões pós-operatórias diariamente para garantir que elas não estejam infectadas ou sangrando e forneça cuidados com feridas por 2 semanas.
11. Abrigar os animais de forma singly para evitar qualquer lesão adicional na cauda e para evitar que os animais mordam uns aos outros, o que levaria a complicações cirúrgicas.

2. Avaliação vascular da cauda com imagem de contraste de manchas de laser

1. Anestesiar o mouse como na etapa 1.2.
2. Para usar imagens de contraste de manchas laser para visualizar a vascularidade da cauda, ajuste a largura para 0,8 cm, altura a 1,8 cm, densidade de ponto para alta, taxa de quadros para 44 imagens/segundo, tempo para 30 segundos e foto colorida para 1 por 10 segundos.
3. Avalie a perfusão venosa e arterial para patência. Qualitativamente, a continuidade do fluxo deve ser visualizada.

3. Avaliação linfática funcional com angiografia a laser infravermelha próxima

1. Anestesiar o animal como na etapa 1.2
2. Reconstitua o verde indocitanina (ICG) (25 mg/10 mL) e administre 0,1 mL subcutâneamente na cauda do rato distal perto da ponta.
3. Apague as luzes do quarto. Coloque angiografia a laser quase infravermelha na configuração de buffering seguida de captura ao vivo.

4. Entrega focal de carga de ácido nucleico para cauda de rato usando TNT

1. Anestesiar o animal como no passo 1.2.
2. Esfoliar a cauda do rato usando creme de esfoliação de pele tópico.
3. Mergulhe a cauda do mouse na solução de colagenase (10 mg/mL) a 37 °C por 5 minutos.
4. Carregue DNA no reservatório de chip TNT_2.0 ³⁵.
5. Coloque o dispositivo de chip de silicone TNT_2.0 sobre o local focal desejado de entrega na cauda com nanonegubras em contato com a cauda.
6. Coloque uma sonda elétrica positiva no reservatório. Conecte a sonda negativa a uma agulha de 30 G e insira a agulha subcutânea na cauda ao local de entrega.
7. Aplique estimulação elétrica de pulso de onda quadrada (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

A técnica para o modelo de cauda do rato para linfedema sustentado é mostrada na Figura 1. A figura exibe a anatomia relevante do modelo de cauda do rato. A Figura 2 demonstra o inchaço progressivo e o linfedema persistente sustentado na cauda do rato após a indução de linfedema. O volume da cauda do rato, calculado pela equação do cone truncado, atinge picos na semana 4 e planaltos para a semana 6 seguido de melhora gradual que é mantida para a semana 15. O volume da cauda pode ser utilizado como variável de desfecho para avaliar o efeito de intervenções terapêuticas para linfedema no modelo. Na Figura 3,pode-se observar uma mancha laser de alta resolução para avaliação da patência da vasculatura traseira. Isso adiciona rigor ao modelo para garantir que o welling seja secundário à disfunção linfática em vez de lesão venosa. O efeito das intervenções pode, então, potencialmente se traduzir em tratamento de linfedema com maior confiança. A Figura 4 mostra uma avaliação linfática funcional realizada através de linfografia a laser infravermelha próxima. Esta variável de desfecho adicional permite um efeito linfático funcional das intervenções. A Figura 5 demonstra a entrega focal de carga genética transcutânea no local cirúrgico utilizando tecnologia de nanotransfesão tecidual (TNT2.0). A TNT2.0 facilita o atendimento de terapêuticas baseadas em genes candidatos em potencial neste modelo de linfedema.

Figura 1: Modelo de cauda de rato para linfedema sustentado. (A) Uma excisão de pele de espessura total de 3 mm de largura é realizada em uma cauda murina 20 mm da base sob o micrcópio cirúrgico. É preciso cuidado para preservar a vasculatura. (B) Um esquema da seção transversal da cauda do rato. DV=veia dorsal, LV=veias laterais, artéria caudal A=ventral, cv=vértebra caudal, T=tendão e músculo, setas amarelas mostram os linfáticos. (C) Após a administração do azul isosulfan na ponta da cauda para localização dos linfáticos, os linfáticos (seta amarela) exibem a cor azul. Os linfáticos são interrompidos preservando as veias laterais adjacentes (seta branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Inchaço progressivo do modelo de linfedema da cauda do camundongo. (A) Após a excisão da pele de espessura total e transeção linfática, a cauda do rato apresenta inchaço progressivo que é sustentado ao longo de 15 semanas. O suporte denota 20 mm da base da cauda até o início da excisão cirúrgica de espessura total da pele. (B-C) Quantificação da alteração no volume da cauda ao longo de 15 semanas representados como(B) gráficos de barras, cada ponto representando um animal, n=15, ou como (C) gráfico de linha. Dados representados como ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem de contraste de manchas de laser de alta resolução para confirmar a perfusão da cauda do rato no modelo de cauda do rato linfedema. A mancha laser é usada para avaliar a vasculatura da cauda do rato no pós-operatório para validar o inchaço da etiologia linfática e minimizar a necrose da cauda. (A) Uma cauda de rato com veias laterais feridas (seta preta) detectada por mancha laser. (B) Veia traseira lateral intacta (seta preta) pós-linfedema detectada por mancha laser. (n=5) resolução 0,02 mm; A barra codificada por cores indica perfusão (azul: baixo, vermelho: alto) medido em unidades relativas arbitrárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Avaliação da função linfática utilizando linfórica a laser quase infravermelha no modelo de cauda do rato. O verde indocyanina (ICG) injetado na ponta da cauda do rato localizado para os linfáticos. No pré-operatório, os linfáticos estão intactos ao longo da cauda do rato. No pós-operatório, não há trânsito de ICG além do local cirúrgico, confirmando que o inchaço é causado por disfunção linfática. A seta amarela indica a base da cauda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Entrega focal de carga genética utilizando tecnologia de nanotransfesão tecidual (TNT). (A) Ilustração da entrega da TNT. (B) Os plasmídeos são carregados no reservatório TNT2.0. As sondas elétricas positivas e negativas são anexadas e uma breve estimulação elétrica de pulso de onda quadrada é fornecida (pulsos de 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA), facilitando transfecção focal, não viral e transcutânea. (C) Eficiência da entrega de carga genética utilizando TNT2.0 como observado através de fluoresceína amidita (FAM) rotulada entrega de DNA para a cauda murina. As caudas do rato foram seccionadas dois dias após o tratamento da TNT e avaliadas através de microscopia de fluorescência. Linhas pontilhadas brancas indicam o epitélio da pele da cauda murina. As setas brancas indicam o DNA rotulado pela FAM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse concorrentes.