Este protocolo descreve um sistema de cultura de impressão magnética tridimensional (3D) que permite a dissecção da remodelação do tecido adiposo branco (WAT) induzida por um meio condicionado de células cancerígenas. O uso de um sistema de cultura 3D de adipócitos UCP1+ que expressam uma proteína fluorescente verde (GFP) permite o estudo de adipócitos bege que contribuem para a remodelação do tecido adiposo.
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Artigo de método
Cultura tridimensional de adipócitos como modelo para estudar a remodelação do tecido adiposo branco induzida por caquexia
Neste artigo
Resumo
Resumo
A caquexia do câncer (CC) apresenta-se como uma síndrome com múltiplas manifestações, causando um acentuado desequilíbrio metabólico de múltiplos órgãos. Recentemente, foi proposto que a perda caquética seja estimulada por vários mediadores inflamatórios, que podem perturbar a fisiologia integrativa dos tecidos adiposos e outros tecidos, como o cérebro e o músculo. Nesse cenário, o tumor pode sobreviver às custas do hospedeiro. Em pesquisas clínicas recentes, a intensidade da depleção dos diferentes depósitos de gordura tem sido negativamente correlacionada com o resultado de sobrevida do paciente. Estudos também mostraram que vários distúrbios metabólicos podem alterar a remodelação do tecido adiposo branco (TAB), especialmente nos estágios iniciais do desenvolvimento da caquexia. A disfunção do WAT resultante da remodelação do tecido é um contribuinte para a caquexia geral, com as principais modificações no WAT consistindo em alterações morfofuncionais, aumento da lipólise dos adipócitos, acúmulo de células imunes, redução da adipogênese, alterações na população de células progenitoras e aumento de "nichos" contendo células bege / brite.
Para estudar as várias facetas da remodelação do WAT induzida por caquexia, particularmente as alterações das células progenitoras e a remodelação bege, a cultura bidimensional (2D) tem sido a primeira opção para estudos in vitro. No entanto, essa abordagem não resume adequadamente a complexidade do WATT. Ensaios aprimorados para a reconstrução do TA funcional ex vivo ajudam na compreensão das interações fisiológicas entre as distintas populações celulares. Este protocolo descreve um eficiente sistema de cultura de tecidos de impressão tridimensional (3D) baseado em nanopartículas magnéticas. O protocolo é otimizado para investigar o remodelamento do WAT induzido por fatores induzidos por caquexia (CIFs). Os resultados mostram que uma cultura 3D é uma ferramenta apropriada para estudar a modelagem WAT ex vivo e pode ser útil para telas funcionais para identificar moléculas bioativas para aplicações individuais de populações de células adiposas e auxiliar na descoberta de terapia anticaquética celular baseada em WAT.
Introdução
Os organismos vivos são compostos de células em microambientes 3D com interação célula-célula e célula-matriz e elaboram dinâmicas de transporte de nutrientes e células 1,2. No entanto, a maior parte do conhecimento fundamental adquirido em biologia celular foi gerado usando cultura de células monocamada (2D). Embora a cultura 2D possa responder a algumas das questões mecanicistas, essa abordagem recapitula inadequadamente o ambiente natural em que as células residem e pode ser incompatível com a previsão de uma resposta complexa a medicamentos1. Além disso, as células sentem seu ambiente físico por meio da mecanotransdução. De fato, as forças mecânicas são traduzidas em sinais bioquímicos que, em última análise, influenciam os padrões de expressão gênica e o destino da célula. Nas últimas décadas, a cultura de tecidos 3D surgiu como uma nova ferramenta in vitro que pode mimetizar o microambiente in vivo com maior fidelidade. Isso pode evitar algumas armadilhas mecanicistas geradas por abordagens 2D in vitro3.
A caquexia do câncer (CC) é definida como uma síndrome com múltiplas manifestações, causando um desequilíbrio metabólico acentuado de múltiplos órgãos. Durante o desenvolvimento da caquexia, o WAT sofre inúmeras alterações morfológicas, resultando em aumento da lipólise dos adipócitos, acúmulo de células imunes, redução da adipogênese, alterações na população de células progenitoras e aumento de "nichos" contendo células bege/brite (remodelação bege)4. No entanto, recapitular o mecanismo pelo qual a caquexia afeta o remodelamento do WAT usando modelos in vitro apresenta um desafio técnico significativo. De fato, alguns estudos que tentaram investigar a comunicação tumor/tecido usaram cultura de células in vitro (2D) em monocamada, contornando a complexidade do microambiente 3D do WAT.
Embora várias abordagens experimentais gerem cultura 3D, três métodos de montagem diferentes são preferidos para produzir adiposferoides: levitação magnética ou impressão5, gota suspensa6 e sistemas de andaime Matrigel7. Apesar de serem apropriados para adiposferoides, esses sistemas apresentam vantagens e desvantagens e devem ser escolhidos de acordo com as características de cada desenho experimental. Com base nas limitações mencionadas acima, o método de impressão magnética foi usado para gerar culturas de células 3D5. Este método usa um conjunto de nanopartículas magnéticas que consiste em nanopartículas de ouro e óxido de ferro, tornando o método de impressão adequado para a maioria dos tipos de células. Aqui, culturas de células 3D foram usadas para induzir a adipogênese e CIFs foram usados para reproduzir a condição ambiental do CC.
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Protocolo
1. Incubação de células 2D com nanopartículas magnéticas
- Cultive culturas 2D aderentes a ~ 70% de confluência usando procedimentos padrão de cultura de células.
- Prepare o conjunto de nanopartículas magnéticas. Retire da geladeira e deixe aquecer até a temperatura ambiente (20-25 °C) por cerca de 15 min1.
- Meio misto: Adicione as nanopartículas magnéticas diretamente a 12 mL de meio em placas de cultura de células de 100 mm. Suspenda e ressuspenda o meio algumas vezes para obter uma distribuição homogênea das nanopartículas.
NOTA: O meio parecerá escuro por causa da cor marrom do óxido de ferro. Recomenda-se uma concentração de 2,5 μL/cm2 da área de cultura. - Lave a placa de cultura 2D de 100 mm três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Adicionar 12 ml do meio misto do passo 1.3 às placas de cultura de células de 100 mm. Incubar as placas durante a noite em uma incubadora (37 °C, 5% CO2) para permitir a fixação das nanopartículas magnéticas às células
2. Criação de culturas 3D com montagem de esferóides em placas de 96 poços
- Após a incubação durante a noite, lave as células para remover qualquer meio residual e nanopartículas magnéticas não aderidas, agitando suavemente as placas com 3 x 10 mL de PBS.
- Aspire o PBS da placa de Petri e separe as células por incubação com solução de ácido tripsina-etilenodiamina tetracético (EDTA) a 0,25% por 2-5 min a 37 ° C.
- Enquanto espera que as células se desprendam, desinfete os acionamentos magnéticos com etanol a 70%1.
- Depois que as células se separarem, adicione meio contendo soro a 4x o volume da solução de tripsina-EDTA para neutralizar o efeito da tripsina e, em seguida, transfira a suspensão para um tubo cônico.
- Centrifugar a suspensão a 500 × g durante 10 min. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não tocar no pellet.
NOTA: Após a centrifugação, as células devem parecer marrons e as suspensões celulares em meio devem parecer mais escuras do que o normal. As células devem aparecer salpicadas com as nanopartículas1. - Conte as células em suspensão e calcule o volume de volumes médios necessários para criar culturas 3D. Para adiposferóides, use 5.000 a 10.000 células em 150 μL em placas de 96 poços.
- Usando um kit de bioimpressão de 96 poços, coloque uma placa de 96 poços repelente de células na parte superior do Spheroid Drive.
- Pipetar 150 μL de suspensão de células em cada poço da placa de 96 poços e fechar a placa para permitir que as células se agreguem no fundo na forma de um ímã.
- Deixe a placa na unidade esferóide na incubadora por 1-2 h para produzir um esferóide competente.
NOTA: Essas culturas devem parecer densas e marrons e devem ser impressas na placa (Figura S1). A Figura S2 apresenta um fluxo de trabalho resumido das principais etapas da impressão magnética 3D da montagem de esferóides em placas de 96 poços.
3. Indução de adipogênese branca
- Preparar meios de manutenção e indução8; Prepare o meio de indução antes de cada uso.
- Prepare um meio de manutenção contendo 5 μg / mL de insulina (estoque de 10 mg / mL armazenado a 4 ° C por uma semana) e 0,5 μM de rosiglitazona (estoque de 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)).
- Prepare o meio de indução contendo 125 μM de indometacina de um estoque de 0,125 M em etanol, 2 μg / mL de dexametasona de um estoque de 2 mg / mL em etanol, 0,5 mM de isobutil-1-metilxantina (IBMX) de um estoque de 0,25 M em DMSO e 0,5 μM de rosiglitazona de um estoque de 10 mM em DMSO.
NOTA: Aqueça a indometacina a 60 °C para dissolver.
- Após 24-48 h de impressão de esferóides, substitua o meio completo regular pelo meio de indução (dia 0).
- Após 48 h (dia 2), substitua o meio de indução pelo meio de manutenção.
- Troque o meio a cada 3-5 dias até que as células estejam totalmente diferenciadas.
NOTA: Geralmente, após 7-8 dias de estimulação com o meio de indução, as células se diferenciam em células de gordura maduras e são preenchidas com gotículas de óleo que podem ser vistas nas bordas dos adiposferóides.
4. Produção de meio condicionado de carcinoma de pulmão de Lewis (LLC-CM)
- Sementes de células de carcinoma de pulmão de Lewis (LL/2) em placas de cultura de células de 100 mm em meio de crescimento a uma densidade de 6000 células/cm2.
NOTA: O meio de crescimento contém meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina. - Após 2 dias, substitua o meio em cada placa por meio de crescimento fresco.
NOTA: As células LL/2 contêm uma mistura heterogênea de células aderentes (maior número) e flutuantes. - Após 2 dias (dia 4), colher o meio condicionado e limpá-lo de células e detritos por centrifugação (500 × g, 10 min).
- Congelar alíquotas do meio condicionado em azoto líquido para utilização posterior.
NOTA: Para tratar esferoides com o meio condicionado, use uma combinação de 75% de meio de crescimento fresco e 25% de meio condicionado LLC.
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Resultados
Adiposferoides de cultura 3D de células da fração vascular estromal (SVF)
As culturas 3D e 2D confluentes foram montadas com o mesmo número de células SVF da mesma preparação WAT inguinal de camundongo (Figura 1A, Figura 1B) e submetidas ao mesmo protocolo experimental para comparar o marcador de expressão gênica. Os esferoides estimulados com meio de indução expandiram-se ao longo do tempo.
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Discussão
Este protocolo configura um sistema de cultura de células 3D para estudar a diferenciação de adipócitos em adiposferóides derivados de células SVF primárias de WAT. Comparado à cultura aderente 2D convencional, este sistema 3D facilita a remodelação de AT, que se assemelha muito às condições in vivo. Nos últimos anos, estudos mostraram que a cultura de células em 3D produz morfologia celular e sinalização distintas em comparação com um sistema de cultura 2D3. A mo...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH DK117161, DK117163 para SRF e P30-DK-046200 para o Núcleo de Biologia Adiposa e Metabolismo de Nutrientes do Boston Nutrition and Obesity Research Center, e pelos Processos Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP): 2018/20905-1 e CNPq 311319/2018-1 para MLBJr.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) | I-5879 | |
| Kit de bioimpressão de 96 poços | Greiner preto (Monroe, NC, EUA) | 655841 | Cultura de células |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Coelho IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-606-152 | Coloração de imunofluorescência, secundária, 1:400 in TBS com 0,1% de microplaca de cultura de células Tween-20 |
| , 96 POÇOS, PS, FUNDO F, µ TRANSPARENTE, PRETO, CELLSTAR, SUPERFÍCIE REPELENTE DE CÉLULAS, TAMPA, ESTÉRIL, 8 PÇS./SACO | Greiner (Monroe, NC, EUA) | 655976 | Cultura celular |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) | D-1756 | Cultura celular |
| DMEM | Corning (Manassas, VA, EUA) | 10-017-CV | Cultura celular |
| Soro bovino fetal (Tova) | Gemini Bio (West Sacramento, CA) | 100-500 | Cultura celular |
| Indometacina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) | I-7378 | Cultura de células |
| Insulina | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) | I0516 | Cultura de células |
| LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642) | Coleção de cultura de tipo americano (Manassas, VA, EUA) | CRL-1642 | Linha celular de carcinoma de pulmão de Lewis |
| NanoShuttle-PL | Greiner (Monroe, NC, EUA) | 657843 | Cultura de células |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | ThermoFisher (Waltham, MA, USA) | R37606 | Coloração de imunofluorescência, seguindo as instruções do fabricante |
| Caneta estreptocócica | Corning (Manassas, VA, EUA) | 30-002-CI | Cultura de células |
| Perilipina-1 (D1D8) XP Tecnologia de sinalização de células mAb de coelho | (Danvers, MA, EUA) | 9349 | Coloração de imunofluorescência, primária, 1:1000 em TBS com 0,1% Tween-20 |
| Rosiglitazona | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) | R-2408 | Cultura de células |
| Tripsina-EDTA, 0,05% | Corning (Manassas, VA, EUA) | 25-052-CI | Cultura |
| de célulasPrimers de PCR de transcrição reversa | |||
| Primer | Forward | Reverse< | |
| em>Adipoq | GTTCCCAATGTACCCATTCGC | TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG | |
| em>Col4a1 | TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT | ACCCTTGCTCGCCTTTGACT | |
| em>Cyclophilin a | ATGGCACTGGCGGCAGGTCC | TTGCCATTCCTGGACCCAAA | |
| Fabp4 | TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG | TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA | |
| em>Fn1 | GCTTCCCCAACTGGTTACCCT | GGGTTGGTGATGAAGGGT | |
| Pgc1a | GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG | GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG | |
| em>Ucp1 | TCCTAGGGACCATCACCC | AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC | |
| strong>Genotipagem do camundongo | |||
| Nome do primer | Descrição | Sequência | |
| Cre F | Generic Cre forward | GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC | |
| Cre R | Generic Cre reverse | GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT | |
| oIMR7318 | mT/mG forward | CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT | |
| oIMR7319 | mT/mG wild type reverse | CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA | |
| oIMR7320 | mT/mG mutante reverso | TCA ATG GGG GGG GGT CGT T | |
| WH336 | UCP1 mutante para a frente | CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC | |
| WH337 | UCP1 mutante reverso | GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG | |
| WH338 | UCP1 tipo selvagem para a frente | GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT | |
| WH339 | UCP1 tipo selvagem reverso | GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C |
Referências
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Reimpressões e permissões
