Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.
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Artigo de método
Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos aqui um protocolo de descelularização para coração e pulmões de rato. Produz andaimes estruturais de ECM que podem ser usados para analisar topologia e composição de ECM. Baseia-se em um procedimento microcirúrgico projetado para cateterizar a traqueia e a aorta de um rato eutanizado para perfundir o coração e os pulmões com agentes descelularizantes. O complexo cardiopulmonar descelularizado pode, posteriormente, ser imunossuperado para revelar a localização de proteínas estruturais de ECM. Todo o procedimento pode ser concluído em 4 dias.
Os andaimes ECM resultantes deste protocolo estão livres de distorções dimensionais. A ausência de células permite o exame estrutural das estruturas de ECM até a resolução de submicron em 3D. Este protocolo pode ser aplicado a tecidos saudáveis e doentes de camundongos com até 4 semanas de idade, incluindo modelos de camundongos de fibrose e câncer, abrindo caminho para determinar a remodelação do ECM associada à doença cardiopulmonar.
Introdução
O ECM é uma rede tridimensional feita de proteínas e glicanos que acomoda todas as células em um organismo multicelular, dando aos órgãos sua forma e regulando o comportamento celular ao longo da vida1. A partir da fertilização dos óvulos em diante, as células constroem e remodelam o ECM, e por sua vez são estritamente controladas por ele. O objetivo deste protocolo é abrir uma maneira de analisar e mapear o ECM do rato, já que os camundongos são o organismo modelo mais utilizado na fisiopatologia mamífera.
O desenvolvimento deste método foi impulsionado pela necessidade de caracterizar e isolar o E....
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Protocolo
Todos os procedimentos aqui incluídos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética que regula a medicina experimental na Universidade de Copenhague e concordam com a legislação dinamarquesa e europeia. Para demonstrar este protocolo, usamos camundongos BALB/cJ fêmeas de 8-12 semanas de idade e um rato fêmea MMTV-PyMT de 11 semanas de idade.
NOTA: Evitar a contaminação bacteriana do andaime ECM descelularizado dá o melhor resultado de imagem e permite o armazenamento de amostras a longo prazo. Por isso, é importante manter todos os passos estéreis. Assim, todos os instrumentos e materiais cirúrgicos, incluindo sutura, microssutura, soluç....
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Resultados
Descelularização cardiopulmonar
Após a conclusão do protocolo com sucesso, o coração e os pulmões, bem como o tecido anexo, como o arco aórtico, estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de hematoxilina-eosina (Figura 1) dos andaimes ECM mostrando a remoção dos núcleos comparando com o tecido nativo. Estes andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insolúvel está
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Discussão
Técnicas de descelularização baseadas na agitação tecidual alteram a estrutura do ECM, tornando-as inadequadas para análise da estrutura do ECM4. A descelularização da perfusão, utilizando uma rota anatômica como a aorta da traqueia, permite chegar ao leito capilar, ou alvéolo terminal, e facilita a entrega de agentes descelularizantes em todo o órgão. O uso de detergentes zwitterionic, aniônicos e não iônicos para descelularizar tecidos é relatado4,5,6, no entanto, sulfato de dodecílio de sódio (.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos à Profª Ivana Novak e à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); bolsa de doutorado da Fundação Lundbeck (R286-2018-621; MR); o Conselho Sueco de Pesquisa (2017-03389; MDL); a Sociedade Sueca de Câncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; MDL); Ajuda ao câncer alemão (Deutsche Krebshilfe; RR); e a Sociedade Dinamarquesa de Câncer (R204-A12454; RR).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 sutura, agulha de seção triangular (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-sutura (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson pinça | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson pinça com dentes | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Porta-microagulhas Castroviejo | Ferramentas de Belas Ciências | nº 12061-01 | |
| CO2 câmara de ventilação para eutanásia de camundongo | |||
| Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Bandeja descartável de poliestireno (~30 &vezes; 50 cm) | |||
| Microscópio de dissecção (Greenough, com pescoço de ganso de dois braços) | Leica | S6 D | |
| Microespátula de ponta dupla | Ferramentas de Belas Ciências | 10091-12 | |
| Micropinças Dumont (duas) | Ferramentas de Ciências Finas | 11252-20 | |
| Micropinça Dumont com 45° pontas (duas) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Máquinas de cortar cabelo | Oster | 76998-320-051 | |
| Porta-agulha Halsey (com mandíbulas de carboneto de tungstênio) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Cateter intravenoso de calibre 24 (Insyte) | BD | 381512 | |
| Cateter intravenoso de calibre 26 (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Tesoura Mayo (corte duro, reto) | Ferramentas de Ciência Fina | 14110-15 | |
| Microfórceps com pontas aneladas (duas) | Aesculap | FM571R | |
| Tesoura de micro-mola (Vannas, curvada) | Ferramentas de Ciência Fina | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Agulhas (calibre 27; Microlance) | BD | 21018 | |
| Toalha de papel (estéril) ou guardanapo cirúrgico | |||
| Tesoura serrilhada (CeramaCut, reta) | Ferramentas de Ciência Fina | 14958-09 | |
| Espátula (Freer-Yasargil) | Seringas Aesculap | OL166R | |
| (1 mL; Seringas | de 3021001 | Plastipak)BD | |
| (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tesoura de tendão (Walton) | Ferramentas de ciências finas | 14077-09 | |
| < forte > IMUNOCOLORAÇÃO < / forte > | |||
| Alexa Fluor 488 burro anti-cobaia IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-coelho IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA (albumina bovina fração V, grau padrão, liofilizado) | Serva | 11930.03 | |
| Anticorpo policlonal de colágeno IV (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Hospedeiro: |
| coelho PBS (pH 7,4, 10&vezes;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Anfitrião: anticorpo |
| policlonal de periostina de cabra (um gentil presente de Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Hospedeiro: porquinho-da-índia | ||
| Bisturi descartável com lâmina nº 11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Soro (soro de burro normal) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Detectores (detector híbrido (Leica, modelo HyD S) e tubos fotomultiplicadores (PMTs; ) | Leica | ||
| Fonte de luz fluorescente | Leica | EL6000 | |
| Microscópio (microscópio multifóton invertido) | Leica | SP5-X MP | |
| Objetiva (azul lambda, 20 vezes;, abertura numérica de 0,70 (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Duas fotos Ti– laser de safira (Spectra-physics, modelo Mai Tai DeepSee) | |||
| Laser de luz branca (WLL) | Leica | ||
| DESCELULARIZAÇÃO | |||
| 70% Etanol (álcool absoluto 99,9%); o álcool absoluto deve ser ajustado para 70% (vol/vol) usando água deionizada | Ameixa | 1680766 | |
| Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro) | Conexões | para tubulação Merck ZIQ7000T0 | |
| (1/8 polegada) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10&vezes;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| (com 12 canais) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Tubo de silicone (com 2 mm de diâmetro interno e 4 mm de diâmetro externo) | Ole Dich | 31399 | |
| Azida de Sódio | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Desoxicolato de Sódio (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Dodecil Sulfato | Sódio Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H& E COLORAÇÃO | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Etanol | Ameixa | 201446-5L | |
| Etanol absoluto | Ameixa | 201152-1L | |
| Lamínulas (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Criomoldes Intermediários (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX meio de montagem | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solução alcoólica 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Lâmina de micrótomo de penas de aço inoxidável,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) | Thermofisher | ||
| Mayers hematoxilina | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT composto | VWR | 361603E | |
| Scanner de slides (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
Referências
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extrace....
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Reimpressões e permissões
