Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.
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Artigo de método
Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos aqui um protocolo de descelularização para coração e pulmões de rato. Produz andaimes estruturais de ECM que podem ser usados para analisar topologia e composição de ECM. Baseia-se em um procedimento microcirúrgico projetado para cateterizar a traqueia e a aorta de um rato eutanizado para perfundir o coração e os pulmões com agentes descelularizantes. O complexo cardiopulmonar descelularizado pode, posteriormente, ser imunossuperado para revelar a localização de proteínas estruturais de ECM. Todo o procedimento pode ser concluído em 4 dias.
Os andaimes ECM resultantes deste protocolo estão livres de distorções dimensionais. A ausência de células permite o exame estrutural das estruturas de ECM até a resolução de submicron em 3D. Este protocolo pode ser aplicado a tecidos saudáveis e doentes de camundongos com até 4 semanas de idade, incluindo modelos de camundongos de fibrose e câncer, abrindo caminho para determinar a remodelação do ECM associada à doença cardiopulmonar.
Introdução
O ECM é uma rede tridimensional feita de proteínas e glicanos que acomoda todas as células em um organismo multicelular, dando aos órgãos sua forma e regulando o comportamento celular ao longo da vida1. A partir da fertilização dos óvulos em diante, as células constroem e remodelam o ECM, e por sua vez são estritamente controladas por ele. O objetivo deste protocolo é abrir uma maneira de analisar e mapear o ECM do rato, já que os camundongos são o organismo modelo mais utilizado na fisiopatologia mamífera.
O desenvolvimento deste método foi impulsionado pela necessidade de caracterizar e isolar o ECM2 nativo associado à metástase. Como os tumores não possuem vascularização anatômica adequada e os camundongos são organismos relativamente pequenos, procedimentos microcirúrgicos foram projetados para cateterizar retrogrademente a aorta, isolando a circulação do vaso principal que leva a um tumor (por exemplo, as veias pulmonares), focando assim o fluxo de reagentes e permitindo a descelularização tumoral. Este método produz andaimes ECM com uma estrutura conservada2 que podem ser imunossuídas e imagens, permitindo o mapeamento da estrutura ECM em detalhes de submicron. Para realizar esse protocolo, é necessário adquirir habilidades cirúrgicas e microcirúrgicas (dissecção, microsutura e cateterismo) que possam representar uma potencial limitação ao seu uso. Para nosso conhecimento, este método representa o estado da arte para análise de imagem de estrutura ecm nativa2,3.
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Protocolo
Todos os procedimentos aqui incluídos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética que regula a medicina experimental na Universidade de Copenhague e concordam com a legislação dinamarquesa e europeia. Para demonstrar este protocolo, usamos camundongos BALB/cJ fêmeas de 8-12 semanas de idade e um rato fêmea MMTV-PyMT de 11 semanas de idade.
NOTA: Evitar a contaminação bacteriana do andaime ECM descelularizado dá o melhor resultado de imagem e permite o armazenamento de amostras a longo prazo. Por isso, é importante manter todos os passos estéreis. Assim, todos os instrumentos e materiais cirúrgicos, incluindo sutura, microssutura, soluções, tubos, conectores Luer e cateteres, devem ser estéreis. As superfícies, incluindo uma bandeja de poliestireno, devem ser desinfetadas com 70% de etanol, e a perfusão deve ser realizada preferencialmente sob uma coifa de fluxo laminar. Todos os procedimentos ocorrem à temperatura ambiente, a menos que seja indicado de outra forma.
1. Microcirurgia pós-morte
- Eutanize o rato usando uma câmara de CO2 .
- Coloque o mouse em uma câmara de 4 L, e comece a encher com 100% de CO2, começando em 0,2 L/min por 2 min, aumentando até atingir um fluxo de 0,8 L/min após 3 min. O rato deve cair inconsciente durante os primeiros 2 minutos, e então a respiração deve cessar (geralmente em torno de 5 minutos, mas o fluxo pode ser mantido conforme necessário). Confirme a morte antes de prosseguir para o próximo passo.
- Raspe o tórax, o abdômen e a parte de trás do rato com o cortador de cabelo e desinfete com 70% de etanol. A depilação reduz consideravelmente o número de artefatos devido à presença de cabelos em amostras para análise de imagem ou bioquímica.
- Fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus dentes e traseiros, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia.
- O uso de uma tesoura de padrão reto mayo estabelece o acesso cirúrgico com uma incisão cutânea que vai da região submandibular até o abdômen inferior e disseco subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.
- Usando tesoura microcirúrgica, corte os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica.
- Usando uma tesoura de padrão reto, corte o esterno ao longo das incisões anteriores e, em seguida, complete uma esterno cortando o esterno ao longo de seu eixo longo, em seguida, eleve e fixe ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
- Usando micro-fórceps de ponta redonda (ou micro-fórceps Dumont), extirpo o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. Isso revelará as principais naves.
- Usando o cautery, cauterize a veia cava descendente e, usando uma tesoura de padrão reto, corte o esôfago.
- Usando micro-fórceps afiados, separe as veias braquiocefálicas e as braquiocefálicas, deixaram as artérias subcláusicas comuns e esquerda do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização.
- Utilizando suporte de micropeça, micro-fórceps afiados e pontos de sutura 9-0 acima do surgimento do braquiocefálico, deixado carótida comum e artérias subclávias esquerdas.
- Cauterize as veias braquiocefálicas.
- Separe as glândulas salivares submandibulares ao longo da linha média para expor os músculos do pescoço e a traqueia. Separe os músculos para expor o ligamento cricothiroide. Usando micro-tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento.
- Introduza um cateter de 27 G na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esque no brônquio (ou seja, até que a resistência ao cateter seja atendida, depois retire 3 mm). Tenha cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura 6-0, coloque 3 pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.
- Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica. A aorta descendente corre anteriormente até a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna. Desmonte a metade inferior.
- Cateterize retrógradamente a aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Com sutura 9-0, coloque 4 pontos ao redor da aorta, começando 5 mm abaixo da ponta do cateter.
2. Descelularização
- Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores Luer. Perfuuse com água deionizada a 200 μL/min por 15 min. Mantenha essa taxa de fluxo durante a descelularização.
- Mude o agente de perfusão para 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC) diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.
- Mude o agente de perfusão para sulfato de dodecyl de sódio de 0,1% de sódio (SDS) diluído em água desionizada e perfuuse por 8 horas.
- Perfume com água desionizada durante a noite para lavar SDS e DOC por 24 horas.
- Ressecize o coração e os pulmões descelularizados, seccionando seus acessórios ao tórax usando uma tesoura curvada e armazenar em um tubo criogênico estéril com água desionizada com penicilina-estreptomicina de 1% (v/v) e 0,3 μM de azida de sódio a 4 °C. Os andaimes ECM podem ser armazenados por pelo menos por pelo menos 12 semanas1. Se o andaime for usado para análise bioquímica (por exemplo, espectrometria de massa), estote o congelamento em nitrogênio líquido.
3. Imunostaining
- Planeje a imagem: determinar anticorpos primários (ou anticorpos) e a combinação de anticorpos secundários fluorescentes conjugados para combinar uns com os outros e para se encaixar nas linhas laser do microscópio de fluorescência.
- Bloqueie a amostra imergindo-a em um criobotube contendo 6% (v/v) soro de burro - 3% (w/v) albumina de soro bovino (BSA) durante a noite.
- Incubar com anticorpos primários (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
- Lave 5 vezes por 1h cada vez em 0,05% entre 20 em PBS (PBST).
- Incubar a amostra com anticorpo secundário fluorescente conjugado (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
- Lave 5 vezes por 1 hora em 0,05% (PBST). Aguarde 1h entre cada lavagem.
- Adicione água deionizada e armazene a 4 °C de distância da luz direta. Neste ponto, o andaime está pronto para a imagem.
4. Imagem
- Coloque a amostra em um prato com fundo de vidro e umidize-a com duas gotículas de solução de armazenamento (PBS ou água deionizada).
- Prepare o objetivo. Recomendamos o uso de um objetivo de imersão em água.
- Inspecione a amostra usando luz de fluorescência.
- Mude para controle de computador. Ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimentos de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para z-stack e comece a aquisição. Recomendamos o uso de excitação a laser multifotônio para aumentar a penetração tecidual e minimizar a dispersão de luz, branqueamento e danos teciduais.
5. Mancha de hematoxilina-eosina
- Exciso 1 lobo pulmonar de um rato eutanizado.
- Coloque em um criomold de 10 mm x 10 mm x 5 mm e cubra-o com aproximadamente 500 μL de composto OCT.
- Congele em gelo seco (-70 °C) e mantenha a amostra a essa temperatura.
- Exciso um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado de acordo com a etapa 2.5.
- Coloque em um criomold com a maior área de superfície para baixo e cubra-a com composto OCT conforme especificado na etapa 5.2.
- Congele em gelo seco (-70°C) e mantenha a amostra a essa temperatura até que seja necessário. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas.
- Seção blocos de tecido congelado a -20 °C em um criostat com 5 μm de espessura e coloque seções em lâminas de vidro adesivos e armazene a -80 °C.
- Leve os slides à temperatura ambiente até que o ar seque (aproximadamente 20 min).
- Logo mergulhe no PBS e fixe imergindo os slides em 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos. Lave uma vez na PBS por 5 minutos, depois duas em água destilada por 5 minutos.
- Mergulhe na solução de hematoxilina de Mayer por 10 minutos. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
- Lave em um frasco de Coplin sob água destilada por 10 minutos.
- Mergulhe na solução de eosin por 7 min. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
- Queda de 50% de etanol para remover o excesso de Eosin e desidratar em pouco tempo em 70% de etanol, e em 96% e 100% etanol por 30 segundos. Mergulhe em xileno várias vezes.
- Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque uma mancha de tampa de vidro.
- Deixe os slides secar durante a noite sob um capô químico.
- Digitalize slides em um scanner de slides.
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Resultados
Descelularização cardiopulmonar
Após a conclusão do protocolo com sucesso, o coração e os pulmões, bem como o tecido anexo, como o arco aórtico, estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de hematoxilina-eosina (Figura 1) dos andaimes ECM mostrando a remoção dos núcleos comparando com o tecido nativo. Estes andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insolúvel está
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Discussão
Técnicas de descelularização baseadas na agitação tecidual alteram a estrutura do ECM, tornando-as inadequadas para análise da estrutura do ECM4. A descelularização da perfusão, utilizando uma rota anatômica como a aorta da traqueia, permite chegar ao leito capilar, ou alvéolo terminal, e facilita a entrega de agentes descelularizantes em todo o órgão. O uso de detergentes zwitterionic, aniônicos e não iônicos para descelularizar tecidos é relatado4,5,6, no entanto, sulfato de dodecílio de sódio (...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos à Profª Ivana Novak e à Dra. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); bolsa de doutorado da Fundação Lundbeck (R286-2018-621; MR); o Conselho Sueco de Pesquisa (2017-03389; MDL); a Sociedade Sueca de Câncer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; MDL); Ajuda ao câncer alemão (Deutsche Krebshilfe; RR); e a Sociedade Dinamarquesa de Câncer (R204-A12454; RR).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 sutura, agulha de seção triangular (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-sutura (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson pinça | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson pinça com dentes | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Porta-microagulhas Castroviejo | Ferramentas de Belas Ciências | nº 12061-01 | |
| CO2 câmara de ventilação para eutanásia de camundongo | |||
| Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Bandeja descartável de poliestireno (~30 &vezes; 50 cm) | |||
| Microscópio de dissecção (Greenough, com pescoço de ganso de dois braços) | Leica | S6 D | |
| Microespátula de ponta dupla | Ferramentas de Belas Ciências | 10091-12 | |
| Micropinças Dumont (duas) | Ferramentas de Ciências Finas | 11252-20 | |
| Micropinça Dumont com 45° pontas (duas) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Máquinas de cortar cabelo | Oster | 76998-320-051 | |
| Porta-agulha Halsey (com mandíbulas de carboneto de tungstênio) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Cateter intravenoso de calibre 24 (Insyte) | BD | 381512 | |
| Cateter intravenoso de calibre 26 (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Tesoura Mayo (corte duro, reto) | Ferramentas de Ciência Fina | 14110-15 | |
| Microfórceps com pontas aneladas (duas) | Aesculap | FM571R | |
| Tesoura de micro-mola (Vannas, curvada) | Ferramentas de Ciência Fina | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Agulhas (calibre 27; Microlance) | BD | 21018 | |
| Toalha de papel (estéril) ou guardanapo cirúrgico | |||
| Tesoura serrilhada (CeramaCut, reta) | Ferramentas de Ciência Fina | 14958-09 | |
| Espátula (Freer-Yasargil) | Seringas Aesculap | OL166R | |
| (1 mL; Seringas | de 3021001 | Plastipak)BD | |
| (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tesoura de tendão (Walton) | Ferramentas de ciências finas | 14077-09 | |
| < forte > IMUNOCOLORAÇÃO < / forte > | |||
| Alexa Fluor 488 burro anti-cobaia IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-coelho IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA (albumina bovina fração V, grau padrão, liofilizado) | Serva | 11930.03 | |
| Anticorpo policlonal de colágeno IV (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Hospedeiro: |
| coelho PBS (pH 7,4, 10&vezes;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Anfitrião: anticorpo |
| policlonal de periostina de cabra (um gentil presente de Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Hospedeiro: porquinho-da-índia | ||
| Bisturi descartável com lâmina nº 11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Soro (soro de burro normal) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Detectores (detector híbrido (Leica, modelo HyD S) e tubos fotomultiplicadores (PMTs; ) | Leica | ||
| Fonte de luz fluorescente | Leica | EL6000 | |
| Microscópio (microscópio multifóton invertido) | Leica | SP5-X MP | |
| Objetiva (azul lambda, 20 vezes;, abertura numérica de 0,70 (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Duas fotos Ti– laser de safira (Spectra-physics, modelo Mai Tai DeepSee) | |||
| Laser de luz branca (WLL) | Leica | ||
| DESCELULARIZAÇÃO | |||
| 70% Etanol (álcool absoluto 99,9%); o álcool absoluto deve ser ajustado para 70% (vol/vol) usando água deionizada | Ameixa | 1680766 | |
| Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro) | Conexões | para tubulação Merck ZIQ7000T0 | |
| (1/8 polegada) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10&vezes;, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| (com 12 canais) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Tubo de silicone (com 2 mm de diâmetro interno e 4 mm de diâmetro externo) | Ole Dich | 31399 | |
| Azida de Sódio | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Desoxicolato de Sódio (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Dodecil Sulfato | Sódio Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H& E COLORAÇÃO | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Etanol | Ameixa | 201446-5L | |
| Etanol absoluto | Ameixa | 201152-1L | |
| Lamínulas (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Criomoldes Intermediários (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX meio de montagem | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solução alcoólica 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Lâmina de micrótomo de penas de aço inoxidável,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) | Thermofisher | ||
| Mayers hematoxilina | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT composto | VWR | 361603E | |
| Scanner de slides (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
Referências
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
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Reimpressões e permissões
