Avaliação da reprogramação cardíaca usando análise de imagem de alto conteúdo

Summary

Apresentamos um protocolo para quantificar células semelhantes a cardiomiócitos induzidas (iMCs) diretamente reprogramadas in vitro usando análise de imagem de alto conteúdo. Este método nos permite quantificar a eficiência da reprogramação cardíaca de forma automatizada e visualizar diretamente os iCMs.

Abstract

O objetivo deste protocolo é descrever um método para quantificar células induzidas semelhantes a cardiomiócitos (iMCs), que são diretamente reprogramadas in vitro por uma técnica de reprogramação. A reprogramação cardíaca fornece uma estratégia para gerar novos cardiomiócitos. Ao introduzir fatores de transcrição cardiogênicos centrais em fibroblastos; os fibroblastos podem ser convertidos em iCMs sem transição através do estado de células-tronco pluripotentes. No entanto, a taxa de conversão de fibroblastos em iMCs ainda permanece baixa. Assim, houve inúmeras abordagens adicionais para aumentar a eficiência da reprogramação cardíaca. A maioria desses estudos avaliou a eficiência da reprogramação cardíaca usando citometria de fluxo, ao mesmo tempo em que realizou imunocitoquímica para visualizar iCMs. Assim, pelo menos dois conjuntos separados de experimentos de reprogramação são necessários para demonstrar o sucesso da reprogramação do iCM. Em contraste, a análise automatizada de imagens de alto conteúdo fornecerá quantificação e qualificação da reprogramação do iCM com um número relativamente pequeno de células. Com este método, é possível avaliar diretamente a quantidade e a qualidade dos iCMs com um único experimento de reprogramação. Essa abordagem será capaz de facilitar futuros estudos de reprogramação cardíaca que requerem experimentos de reprogramação em larga escala, como triagem de fatores genéticos ou farmacológicos para aumentar a eficiência da reprogramação. Além disso, a aplicação do protocolo de análise de imagem de alto conteúdo não se limita à reprogramação cardíaca. Pode ser aplicado à reprogramação de outras linhagens celulares, bem como a quaisquer experimentos de imunocoloração que precisem de quantificação e visualização de células imunomarcadas.

Introduction

A reprogramação cardíaca tem sido desenvolvida como uma abordagem alternativa às abordagens mediadas por células-tronco para gerar novos cardiomiócitos. Dado que não faz a transição através do estado de células-tronco, tem um alto potencial para contornar algumas limitações herdadas nas abordagens mediadas por células-tronco. Foi demonstrado que a infecção viral de pelo menos três ou quatro fatores de transcrição cardiogênicos em fibroblastos pode converter fibroblastos em um destino cardíaco, eliminando programas de genes de fibroblastos e reconstruindo redes transcricionais cardiogênicas em fibroblastos^<....

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Vanderbilt University Medical Center.

1. Geração de retrovírus e reprogramação cardíaca in vitro

1. Cultive células Platinum E em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1 μg/mL de puromicina e 10 μg/mL de blasticidina até que a confluência das células Platinum E atinja 70% a 80%.
2. No Dia 1, semeie ~ 0,55 x 10⁶ células (primeiro poço) e ~ 0,18 x 10⁶ células (segundo poço) em dois poços separados de placa de 12 poços com....

Results

Após experimentos de reprogramação, quantificamos iCMs usando análise de imagem de alto conteúdo, conforme descrito acima. Imagens compostas de 36 locais de imagem que foram usados para análise de imagem de alto conteúdo foram mostradas na Figura 1. Os iCMs são definidos como células duplamente positivas (α-actinina⁺Titina-eGFP⁺) nesses experimentos. A análise de imagem de alto conteúdo mostra que ~ 26% das células exibiram ambos os marcadores cardíacos após a transduçã.......

Discussion

Os estudos de reprogramação anteriores avaliaram a eficiência da reprogramação usando citometria de fluxo e demonstraram a qualidade estrutural dos iCMs usando imunocitoquímica em dois experimentos separados. A análise por citometria de fluxo requer um número muito maior de células iniciais, aumentando assim a escala dos experimentos. Em contraste, a análise de imagem de alto conteúdo pode avaliar a qualidade e a quantidade de reprogramação do iCM por um único experimento com um número r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-frango Alexa 488	Thermofisher	A11039
anticorpo anti-GFP	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anticorpo anti-&alfa;-actinina	Sigma	A7811
DAPI solução	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulina-Transferrina-SeleniumG suplemento	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM solução vitamínica	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Dispositivo
Micro XL sistema automatizado de imagem celular	Dispositivo
Solução mínima de aminoácidos essenciais	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
Filtro PES (0,45 µ m)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E células	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Tampão de bloqueio universal	BiogeneX	HK083-50K