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Artigo de método

Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior

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DOI:

10.3791/61861

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4 de junho de 2021

 ,  ,  , 
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método para usar a dosimetria radical inline e uma fonte de luz plasmática para realizar a pegada de proteína de oxidação flash. Este método substitui o perigoso laser UV para simplificar e melhorar a reprodutibilidade da oxidação fotoquímica rápida de estudos proteicos.

Resumo

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica emergente e promissora de análise estrutural de ordem superior que fornece informações sobre mudanças na estrutura proteica, interações proteína-proteína ou interações proteína-ligand. O HRPF utiliza radicais hidroxil(▪OH) para rotular irreversivelmente a superfície acessível de solvente de uma proteína. A complexidade inerente, o custo e a natureza perigosa do desempenho do HRPF limitaram substancialmente a adoção ampla na biopharma. Esses fatores incluem: 1) o uso de lasers complicados, perigosos e caros que exigem precauções substanciais de segurança; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos. Esta publicação fornece um protocolo para o funcionamento de um sistema HRPF sem laser. Este sistema HRPF sem laser utiliza uma tecnologia de oxidação de flash de fonte de luz de plasma de alta energia e alta pressão com dosimetria radical em linha. A fonte de luz plasmática é mais segura, fácil de usar e mais eficiente na geração de radicais hidroxílicos do que os sistemas HRPF baseados em laser, e o dosímetro radical em linha aumenta a reprodutibilidade dos estudos. Combinado, o sistema HRPF sem laser aborda e supera as deficiências e limitações mencionadas das técnicas baseadas em laser.

Introdução

A conformação proteica e a estrutura de ordem superior associada (HOS) são os principais determinantes da função biológica adequada e do comportamento aberrante1. O mesmo se aplica aos biofarmacêuticos, cuja estrutura e atividade funcional dependem de vários aspectos de sua produção e ambiente. A mudança biofarmacêutica no HOS tem sido associada a reações adversas de medicamentos (ADR) atribuídas à farmacologia indesejável e à resposta imunológica do paciente2,3. O aparecimento de ADRs alertou a indústria biofarmacêutica para o papel crítico que o HOS proteico desempenha na segurança e eficácia da bioterapêutica, e eles estabeleceram a necessidade de novas e melhoradas análises hos4.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica promissora para acompanhar a mudança no HOS proteico. O HRPF envolve a rotulagem irreversível do exterior de uma proteína com ▪OH seguido de análise de espectrometria de massa (MS) para identificar a superfície acessível solvente da proteína5,6,7. O HRPF tem sido usado com sucesso para detectar defeitos na proteína HOS e sua função8,9, caracterizar o HOS de anticorpos monoclonais (mAb)10,11,12,13, determinar a vinculação Kd de um ligante14, e muito mais15,16,17,18,19. Um método comum para gerar o ▪OH para HRPF é a Oxidação Fotoquímica Rápida de Proteínas (FPOP), que emprega lasers UV rápidos e de alta energia para produzir ▪OH a partir da fotolise de H2O2. Em sua maioria, o FPOP usa lasers excimer caros que empregam gás perigoso (KrF) que exigem salvaguardas substanciais para evitar lesões respiratórias e oculares20. Para evitar riscos de inalação, outros usaram lasers de alumínio de neodímio quadruplicado (Nd:YAG)lasers 21, que elimina o uso de gás tóxico, mas ainda são caros, exigem uma experiência operacional significativa e exigem extensos controles de luz desviadas para proteger os usuários contra lesões oculares.

Embora informações amplas possam ser obtidas por meio do HRPF, a ampla adoção na biopharma não foi atendida. Duas barreiras para a adoção limitada do HRPF incluem: 1) o uso de lasers perigosos e caros que exigem precauções de segurança substanciais20; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos22. Para suplantar o uso de laser, uma unidade de fotolise flash de plasma de alta velocidade e alta energia foi desenvolvida para realizar o FPOP com segurança de forma fácil. Para melhorar a irreprodutividade dos experimentos do HRPF, a dosimetria radical em tempo real é implementada.

A prática do HRPF tem sido limitada pela irreprodutividade atribuída à limpeza de fundo de ▪OH22. Embora ▪OH sejam excelentes sondas de topografia proteica, elas também reagem com muitos constituintes encontrados nas preparações, tornando necessário medir a concentração efetiva de radicais disponíveis para oxidar uma proteína alvo. Variações na preparação de tampão, concentração de peróxido de hidrogênio, propriedades de ligante ou fotolise podem resultar em diferenças de oxidação entre o controle e grupos experimentais que criam ambiguidade em estudos diferenciais de HOS. A adição de dosimetria radical em tempo real permite o ajuste do efeito ▪carga OH e, portanto, aumenta a confiança e a reprodutibilidade durante um experimento de HRPF. O uso da dosimetria radical no FPOP foi descrito em outros lugares23,24,25, e é ainda discutido em detalhes em uma publicação recente26. Aqui, descrevemos o uso de um novo sistema de fotolise flash e dosimetria em tempo real para rotular apo-mioglobina equina (aMb), comparando níveis de oxidação de peptídeos em um experimento FPOP ao obtido ao usar um laser excimer.

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Protocolo

1. Instalação do tubo capilar

  1. Usando uma pedra de corte de sílica, corte 250 μm de diâmetro interno (ID) capilar de sílica de diâmetro para 27 polegadas. Verifique as extremidades capilares para um corte limpo e reto.
  2. Crie duas janelas com aproximadamente 15 mm de comprimento, queimando o revestimento de poliimida. A partir da "extremidade inferior" faça a primeira janela de fotolise a 90 mm de distância da "extremidade inferior" e a segunda janela dosímetro a 225 mm da "extremidade inferior".
    NOTA: Uma vez que o revestimento é queimado, o capilar é muito frágil.
  3. Desaparafusar a porca e a ferrule no porto 5 e inserir a "extremidade inferior" do capilar logo após a extremidade cônica do ferrule(Figura 1A).
  4. No módulo fotolise, remova a tampa da célula fotolise puxando-a diretamente para fora e, em seguida, remova a máscara metálica montada magneticamente que manterá o capilar no lugar.
    ATENÇÃO: Dentro da tampa da célula fotolise há um espelho curvo, não deixe nada tocar no espelho.
  5. No módulo dosímetro, abra a célula dosímetro empurrando a aba à esquerda e gire a célula dosímetro aberta para a direita. Remova os clipes magneticamente montados que manterão o capilar no lugar.
  6. Coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula fotolise. Centralizar a janela capilar com a janela da célula de fotolise. Enquanto segura o capilar em posição com uma mão, adicione a máscara magnética para segurar o capilar no lugar. Coloque o boné de fotolise de volta na posição.
  7. Coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula dosímetro. Centralizar a segunda janela capilar na pequena abertura no centro da base celular dosímetro. Enquanto segura o capilar em posição com uma mão, coloque os dois clipes magnéticos em posição para manter o capilar no lugar. Feche a célula dosímetro até que ela clique fechada.
  8. Insira o capilar através da porca amassada em cima do elevador capilar do coletor do produto(Figura 1B). Estenda o capilar até um pouco acima da parte inferior do frasco.
    NOTA: É importante que o capilar chegue à parte inferior do frasco para garantir que o capilar esteja submerso na solução de sátula durante a execução de um experimento.

2. Instalando um loop de injeção

  1. Use tubos de teflon com diâmetro externo de 1/16" e diâmetro interno de 0,015" (381 μm). Siga a equação 1 para calcular o comprimento da tubulação necessária para o volume desejado usando a equação 1.
    figure-protocol-1
    Onde L é o comprimento da tubulação em milímetros, V é o volume desejado em microliters e d é o diâmetro interno do tubo em milímetros. Para um volume de injeção de 25 μL e um diâmetro interno de 381 μm, o comprimento do tubo precisa ser de aproximadamente 219,3 mm.
    NOTA: Para volumes inferiores a 20 μL, utilize tubos PTFE com diâmetro interno de 0,01".
  2. Corte a tubulação de Teflon ao comprimento necessário usando um cortador de tubo. Verifique as extremidades do tubo para um corte limpo e reto.
  3. Insira uma extremidade do novo laço de injeção através de uma das porcas e coloque uma nova ferrule na extremidade do tubo. Segure a ferrula e a porca no lugar e insira o tubo na porta 3 da válvula de injeção até que ela se desnúde na válvula. Segure o tubo firmemente e aperte bem o dedo mindinho. Com uma chave inglesa, aperte ainda mais a volta da porca 1/4. Remova e inspecione o conjunto.
    NOTA: Se a ferrula não estiver fixada na posição, reinstale e aperte 1/8 mais. Repita com a outra extremidade do loop.
  4. Uma vez que ambas as extremidades tenham uma porca e ferrule fixa, enrosque vagamente uma extremidade para a porta 3 e a outra extremidade para a porta 6 (Figura 1C). Uma vez em posição aperte ambos os lados para o dedo apertado, em seguida, 1/4 vire o dedo apertado com uma chave inglesa.

3. Inicialize o sistema de fotolise

  1. Ativar os módulos de fotolise na seguinte ordem: (1) Módulo Fluidics (2) Módulo de Fotolise (3) Módulo de Dosimetria (4) Coletor de Produto e, por último (5), o computador do sistema e iniciar o software de controle
    NOTA: Deixe o Módulo Dosímetro pelo menos meia hora para aquecer a partir de um início frio.
  2. Submergir totalmente a partir da posição "Válvula" na bomba de seringa(Figura 1D) em 10 mL de tampão. Coloque a tubulação da posição "Resíduos"(Figura 1D) e tubos da porta 2 na porta de seringa(Figura 1C)até um recipiente vazio para coletar resíduos.
    NOTA: Use o tampão em que sua proteína será suspensa. Um buffer recomendado é 10 mM NaPO4.
  3. No carrossel coletor de produtos, coloque tubos de microcentrifusagem de 1,5 mL na posição marcada H e 6.
  4. Se usar 250 μm ID capilar, defina a taxa de fluxo de carga para 500 μL/min, a taxa de fluxo de processamento para 7,5 μL/min e a taxa de fluxo de resíduos para 500 μL/min.
  5. Calcule o atraso do flash, o tempo do produto e o tempo de perda de tempo para usar o Modo semiautomático usando a equação 2.
    figure-protocol-2
    Onde t é o tempo em minutos, s é a distância capilar em milímetros, d é o diâmetro interno do capilar em milímetros, e f é a taxa de fluxo em μL/min.
    1. Para o atraso do flash, a distância é da "extremidade inferior" do capilar para a primeira janela, que deve ser de aproximadamente 90 mm. Usando capilar de 250 μm iD e uma taxa de fluxo de processamento de 7,5 μL/min, a amostra chegará à janela fotolise em cerca de 35 segundos. Permita que dois flashes a 1 Hz ocorram antes da chegada das amostras, por isso defina o flash de atraso para 33 segundos.
    2. Para o tempo do produto, digite a quantidade de tempo injetado que a solução levará para fluir da válvula de injeção até o final do capilar. Para um capilar de 27" de comprimento de 250 μm ID, defina o tempo do produto para 4,5 minutos.
    3. Para o tempo de perda, insira a quantidade de tempo que o volume total de solução injetada levará para ser coletado. Neste momento, o coletor de produtos passará da posição do produto para o frasco de resíduos. Para um volume de injeção de 25 μL e uma vazão de 7,5 μL/min, ajuste o tempo de perda para 7,8 minutos.
  6. Enxágüe o laço de injeção cinco vezes injetando 25 μL de água de grau HPLC na porta de injeção com a válvula de injeção definida na posição de carga.
  7. Gire manualmente a válvula de injeção para 'injetar posição' para lavar o resto do sistema. Selecione Processo (Fora) no software de controle para começar a fluir água. Enquanto flui, levante o elevador capilar do coletor de produtos selecionando-o sob o coletor de produtos para que você possa ver a extremidade do capilar. Flua água através do capilar até que uma gota se forme.
    NOTA: Se uma gota não se formar, verifique se há vazamentos na válvula injetor. Se houver um vazamento, solte a porca, recira o capilar e reretighten.

4. Determine o rendimento de ▪OH real para testar efeitos radicais de limpeza do buffer.

  1. No Software de Controle, inicie o fluxo selecionando Processo (Out). Na aba configurações, ajuste a tensão de flash para 0 V. Na guia Controle Manual na seção de dados dosímetros, selecione Dados de Início + AutoZero.
  2. Selecione a posição para o frasco de produto (H) e o frasco de resíduos (6).
  3. Selecione Pronto,vire manualmente a válvula de injeção para baixo para a posição de carga e injete 25 μL de 1 mM de Adenina com 100 mM H2O2 na porta de injeção. Uma vez injetado, gire manualmente a válvula de injeção para a posição de injeção.
    NOTA: Isso aciona automaticamente o sistema para iniciar o fluxo, ligar a fonte de plasma e adquirir os dados de dosimetria.
  4. Aumente a tensão navegando até a guia de configurações e alterando a tensão de flash. Repetir as etapas 4.2 e 4.3 usando 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Realize a leitura de absorvância de adenina em cada tensão em triplicados.
  5. Selecione a guia cálculos para determinar a absorção média de cada amostra. Primeiro, clique em Selecionar, depois selecione manualmente o início e o fim da absorção de pico. No espaço disponível, escreva em uma descrição da amostra. Repita para todos os dados adquiridos.
    NOTA: As bolhas podem se formar causando um pico na leitura dosímetro. Ao selecionar dados para determinar a absorção média, omite áreas com bolhas.
  6. Copie e cole dados no Excel para calcular a variação média da absorção de adenina para cada tensão, determinando assim o rendimento▪ OH efetivo.
  7. Repetição de passos 4.1-4.6 se várias condições de amostra (buffer/aditivos diferentes) estiverem sendo usadas para normalizar o rendimento de▪ DES eficaz para cada condição.

5. Modificação da proteína para detectar alterações na estrutura de ordem superior.

  1. Misture adenina de 4 mM com 20 μM de proteína em uma proporção de um para um para fazer uma solução contendo adenina de 2 mM e 10 μM de proteína.
  2. Faça a solução de saciar usando catalase de 0,3 mg/mL para quebrar o excesso de peróxido de hidrogênio e 35 mM em meio a methionina para saciar quaisquer radicais restantes. Aliquot 25 μL de solução de saciar em um microtubo de 200 μL para que um volume igual de sacieda e o produto rotulado seja misturado.
  3. Diluir H2O2 a 200 mM e manter no gelo.
  4. No Software de Controle na guia configurações, inicie a tensão flash em 0 V para determinar qualquer oxidação de fundo.
  5. Na guia de controle manual, selecione Start Data + AutoZero, seguido de Process (Out),em seguida, Pronto, e finalmente vire a válvula de injeção para baixo para a posição de carga.
  6. Coloque uma solução de saciar na posição 1 no carrossel de coleta de produtos. No Software de Controle do Sistema altere o frasco do produto para 1.
  7. Imediatamente antes da injeção, misture 12,5 μL da mistura de adenina e proteína com 12,5 μL de H2O2 para fazer uma concentração final de 1 mM de Adenina, 5 μM de proteína e 100 mM H2O2. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar, gire rapidamente para baixo e injete 25 μL usando a porta de injeção dentro de 10 segundos após a mistura.
  8. Mude a válvula de injeção para a posição de injeção e espere enquanto a amostra está sendo processada.
  9. Reincidente aquisição com 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Execute cada medição de tensão em triplicado.
  10. Calcule a absorvância média conforme descrito na etapa 4.5. Copie e cole todos os dados para o Excel.

6. Desligue o sistema

  1. Depois de todas as amostras terem sido coletadas, limpe a porta da seringa e o laço amostral, colocando a válvula de injeção na posição de carga e injete 25 μL de água HPLC cinco vezes.
  2. Gire a válvula de injeção até a posição de injeção para lavar o resto do sistema com água HPLC.
  3. Pare o fluxo, feche o software de controle do sistema e desligue os módulos começando com o coletor de produto, módulo dosímetro, módulo de fotolise e, finalmente, o módulo fluido.

7. Preparação amostral e espectrometria de massa cromatografia líquida

  1. Desnaturar a proteína incubando amostras a 80 °C por 20 min na presença de 50 mM Tris e 1 mM CaCl2. Esfrie amostras à temperatura ambiente e adicione 1:20 trypsin à proteína. Digerir a proteína durante a noite a 37 °C com mistura de amostras. Na manhã seguinte, termine a digestão de trippsina aquecendo amostras a 95 °C por 10 minutos.
  2. Detecte peptídeos usando um sistema LC-MS/MS de alta resolução conectado a um sistema UPLC.
  3. Carregue a amostra primeiro na coluna trap (300 μm ID X 5 mm 100 Å pore size, 5 μm tamanho de partícula) e lave a 5,0 μL/mL por 3 min com água contendo 2% de solvente B (acetonitrila e ácido fórmico de 0,1%).
  4. Separe os peptídeos em uma nanocolumn C18 (0,75 mm x 150 mm, tamanho de partícula de 2 μm, 100 Å tamanho de poros) a uma taxa de fluxo de 300 nL/min com um gradiente entre solvente A (água contendo 0,1% de ácido fórmico) e solvente B. O gradiente para eluição de peptídeo consiste em um aumento linear de 2 a 35% B sobre 22 min, rampado para 95% B sobre 5 min e mantido por 3 min para lavar a coluna, e depois voltou para 2% B sobre 3 min e segurou por 9 min para reelegenciar a coluna.
  5. Adquira os dados no modo íon positivo. Coloque a tensão do spray em 2400 V, e a temperatura do tubo de transferência de íons para 300 °C.
  6. Adquira as varreduras completas de MS de 250-2000 m/z seguidas de oito varreduras subsequentes de MS/MS dependentes de dados nos oito íons peptídeos mais abundantes. Use dissociação induzida por colisão a 35% de energia normalizada para fragmentar os peptídeos.
  7. Identifique todos os peptídeos não modificados detectados a partir da análise de MS/MS usando um software de análise de proteína disponível contra o arquivo FASTA necessário contendo a sequência proteica e a enzima proteolítica relevante.
  8. Pesquise e quantifique peptídeos modificados usando um Software de Processamento de Dados HRPF. A extensão da oxidação para cada peptídeo identificado é calculada dividindo a área de pico cromatográfica somada de um peptídeo modificado pela área total de pico cromatográfico daquele peptídeo modificado e não modificado usando a equação 3.
    P = [I(singly oxidado) X 1 + I (duplamente oxidado) X 2 + I(triply oxidado) X 3 + .../[Iunoxidized + I(singly oxidado)+ I(duplamente oxidado) + I(triply oxidado) ...]
    onde P denota o número médio de eventos de oxidação por molécula de peptídeo, e eu represento a área de pico do peptídeo nãooxidado (Iunoxidizado) e o peptídeo com n eventos de oxidação.

8. Para um estudo diferencial, repita as etapas 5-7 na segunda condição.

NOTA: Para confirmar a reprodutibilidade, recomenda-se duas réplicas biológicas, além de triplicados técnicos para cada condição.

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Resultados

A fonte de plasma de alta pressão juntamente com a dosimetria em tempo real permite um melhor controle do▪ o rendimento de OH para observar mudanças na estrutura proteica de alta ordem com mais precisão. A adição de adenina permite um dosímetro radical eficaz em tempo real. Após a oxidação, a adenina perde a absorvância UV a 265 nm(Figura 2A). A mudança na absorção de adenina está diretamente relacionada à concentração de radicais disponíveis para o HRPF, fornecendo assim um meio ...

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Discussão

Existem várias etapas críticas para garantir a rotulagem adequada de proteínas durante qualquer experimento hrpf. Primeiro, uma taxa de fluxo apropriada e a taxa de flash de origem são selecionadas para garantir que cada bolus da amostra seja irradiado uma vez. Isso garante que a proteína seja exposta a um único bolus de recém-formado ▪OH. Uma vez que uma proteína é oxidada, a estrutura proteica de ordem mais alta pode ser alterada. Para ter certeza de que a estrutura proteica nativa é sondada, cada molécula d...

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Divulgações

A E.E.C., J.S.S., e S.R.W. divulgam um interesse financeiro significativo na GenNext Technologies, Inc., uma empresa em estágio inicial que busca comercializar tecnologias para análise de estrutura de proteínas de alta ordem. Os dados representativos fornecidos foram revisados por S.K.M., que não tem conflito financeiro de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R43GM125420 e R44GM125420).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de Centrífuga Cônicos de 15 mLFisher Scientific14-959-53Aqualquer marca é suficiente
50 µ L SGE Seringas à Prova de GásFisher ScientificSG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µ m)Thermo Scientific
Acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (v / v), LC / MS GrauFisher ScientificLS120-500
ApomioglobinaSigma-Aldrich
CatalaseSigma-AldrichC9322
CentrífugaEppendorf022625501
Limpadores de Tarefas DelicadasFisher Scientific06-666A
Peróxido de hidrogênioFisher ScientificH325-100qualquer peróxido de hidrogênio a 30% é suficiente
Amida de metioninaChem-Impex03109
MicrocentrífugaThermo Scientific75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Espectrômetro de MassaThermo ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribridoutros instrumentos de alta resolução (por exemplo, Q exactive Orbitrap ou Orbitrap Fusion) podem ser usados
Perfure a Tripsina Protease, MS GradeThermo Scientific90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32"Molex1068680064qualquer cortador de tubos capilares é suficiente
UPLCThermo Scientific
Water com 0,1% de ácido fórmico (v / v), LC / MS GrauFisher ScientificLS118-500
Água, LC / MS GrauFisher ScientificW6-4

Referências

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