Este protocolo apresenta um método para usar a dosimetria radical inline e uma fonte de luz plasmática para realizar a pegada de proteína de oxidação flash. Este método substitui o perigoso laser UV para simplificar e melhorar a reprodutibilidade da oxidação fotoquímica rápida de estudos proteicos.
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Artigo de método
Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior
Neste artigo
Resumo
Resumo
Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) é uma técnica emergente e promissora de análise estrutural de ordem superior que fornece informações sobre mudanças na estrutura proteica, interações proteína-proteína ou interações proteína-ligand. O HRPF utiliza radicais hidroxil(▪OH) para rotular irreversivelmente a superfície acessível de solvente de uma proteína. A complexidade inerente, o custo e a natureza perigosa do desempenho do HRPF limitaram substancialmente a adoção ampla na biopharma. Esses fatores incluem: 1) o uso de lasers complicados, perigosos e caros que exigem precauções substanciais de segurança; e 2) a irreprodutibilidade do HRPF causada pela limpeza de fundo de ▪OH que limitam estudos comparativos. Esta publicação fornece um protocolo para o funcionamento de um sistema HRPF sem laser. Este sistema HRPF sem laser utiliza uma tecnologia de oxidação de flash de fonte de luz de plasma de alta energia e alta pressão com dosimetria radical em linha. A fonte de luz plasmática é mais segura, fácil de usar e mais eficiente na geração de radicais hidroxílicos do que os sistemas HRPF baseados em laser, e o dosímetro radical em linha aumenta a reprodutibilidade dos estudos. Combinado, o sistema HRPF sem laser aborda e supera as deficiências e limitações mencionadas das técnicas baseadas em laser.
Introdução
A conformação proteica e a estrutura de ordem superior associada (HOS) são os principais determinantes da função biológica adequada e do comportamento aberrante1. O mesmo se aplica aos biofarmacêuticos, cuja estrutura e atividade funcional dependem de vários aspectos de sua produção e ambiente. A mudança biofarmacêutica no HOS tem sido associada a reações adversas de medicamentos (ADR) atribuídas à farmacologia indesejável e à resposta imunológica do paciente2,3. O aparecimento de ADRs alertou a indústria biofarmacêutica para o papel crítico que o HOS proteico desempenha na segurança e ....
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Protocolo
1. Instalação do tubo capilar
- Usando uma pedra de corte de sílica, corte 250 μm de diâmetro interno (ID) capilar de sílica de diâmetro para 27 polegadas. Verifique as extremidades capilares para um corte limpo e reto.
- Crie duas janelas com aproximadamente 15 mm de comprimento, queimando o revestimento de poliimida. A partir da "extremidade inferior" faça a primeira janela de fotolise a 90 mm de distância da "extremidade inferior" e a segunda janela dosímetro a 225 mm da "extremidade inferior".
NOTA: Uma vez que o revestimento é queimado, o capilar é muito frágil. - Desaparafusar a porca e a ferrule no porto 5 e inserir a "extremidade inf....
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Resultados
A fonte de plasma de alta pressão juntamente com a dosimetria em tempo real permite um melhor controle do▪ o rendimento de OH para observar mudanças na estrutura proteica de alta ordem com mais precisão. A adição de adenina permite um dosímetro radical eficaz em tempo real. Após a oxidação, a adenina perde a absorvância UV a 265 nm(Figura 2A). A mudança na absorção de adenina está diretamente relacionada à concentração de radicais disponíveis para o HRPF, fornecendo assim um meio .......
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Discussão
Existem várias etapas críticas para garantir a rotulagem adequada de proteínas durante qualquer experimento hrpf. Primeiro, uma taxa de fluxo apropriada e a taxa de flash de origem são selecionadas para garantir que cada bolus da amostra seja irradiado uma vez. Isso garante que a proteína seja exposta a um único bolus de recém-formado ▪OH. Uma vez que uma proteína é oxidada, a estrutura proteica de ordem mais alta pode ser alterada. Para ter certeza de que a estrutura proteica nativa é sondada, cada molécula d.......
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Divulgações
A E.E.C., J.S.S., e S.R.W. divulgam um interesse financeiro significativo na GenNext Technologies, Inc., uma empresa em estágio inicial que busca comercializar tecnologias para análise de estrutura de proteínas de alta ordem. Os dados representativos fornecidos foram revisados por S.K.M., que não tem conflito financeiro de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (R43GM125420 e R44GM125420).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de Centrífuga Cônicos de 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | qualquer marca é suficiente |
| 50 µ L SGE Seringas à Prova de Gás | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µ m) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico (v / v), LC / MS Grau | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomioglobina | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 022625501 | |
| Limpadores de Tarefas Delicadas | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Peróxido de hidrogênio | Fisher Scientific | H325-100 | qualquer peróxido de hidrogênio a 30% é suficiente |
| Amida de metionina | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrífuga | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Espectrômetro de Massa | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid | outros instrumentos de alta resolução (por exemplo, Q exactive Orbitrap ou Orbitrap Fusion) podem ser usados |
| Perfure a Tripsina Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | qualquer cortador de tubos capilares é suficiente |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water com 0,1% de ácido fórmico (v / v), LC / MS Grau | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Água, LC / MS Grau | Fisher Scientific | W6-4 |
Referências
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K.
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Reimpressões e permissões
